שיטת Multiplex Immunostaining באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין פונדקאי

קח קטע קבוע וחדור של יותרת הכליה המורכב מקליפת המוח ומדולה. טפל בו עם מאגר חומצי רותח, ושבירת הקישורים הצולבים המושרים על ידי קיבוע לחשיפת אנטיגן.

לחסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים ולהכניס נוגדנים ראשוניים הנקשרים לסמנים ספציפיים לקליפת המוח.

הוסף נוגדנים משניים ביוטיניים המכוונים לנוגדנים הראשוניים ופרוקסידאזות מצומדות סטרפטווידין הנקשרות לביוטין.

הציגו טירמיד ומי חמצן מתויגים פלואורופור.

הפרוקסידאזות המשותקות משתמשות במי חמצן כדי להפעיל טירמיד, שנקשר לחלבונים סמוכים, ומסמן את קליפת המוח.

לאחר מכן, טפל בקטע עם המאגר הרותח כדי להפשיט את הנוגדנים הקשורים.

הציגו את אותם נוגדנים ראשוניים שנוצרו על ידי מיני מארח המכוונים לסמנים ספציפיים למדולה ונוגדנים משניים ביוטיניליים.

הציגו פרוקסידאזות מצומדות סטרפטווידין וטירמיד מצומד פלואורופור אחר כדי לתייג את המדולה.

הפשטת הנוגדנים הראשוניים הספציפיים לקליפת המוח מעכבת את הנוגדן המשני המוחזר הקושר אותם, ומונע תגובתיות צולבת.

מרחו כתם גרעיני ובצעו הדמיה כדי לדמיין את קליפת המוח והמדולה המוכתמים באופן מובהק, המאשרים שאין תגובתיות צולבת של נוגדנים.

לפני הצביעה, יש להסיר שעווה ולהחזיר לחות לשקופיות קבועות פורמלין ומשובצות בפרפין עם טבילה של חמש דקות בכל תמיסה כפי שמצוין. לאחר הטבילה השנייה במים מזוקקים, הניחו את השקופיות ב-275 מיליליטר של תמיסת נתרן-ציטראט רותחת בתחתית קופסת קצה פיפטה עם מכסה, והכניסו את הקופסה למיקרוגל של 700 וואט בעוצמה של 70% למשך שמונה דקות.

בסיום הטיפול פותחים את המכסה ומניחים לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שטיפת השקופיות בשלוש שטיפות של חמש דקות של PBST טרי בצנצנת קופלין. כדי לחסום אתרי כריכה לא ספציפיים, לאחר הכביסה האחרונה, יש לנער את עודפי ה-PBST מכל שקופית ולכסות את השקופיות בנפח מספיק של תמיסת חסימה מתאימה.

לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח, יש לנער את תמיסת החסימה העודפת מכל שקופית, ולהוסיף 250 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני הראשון המעניין לכל דגימה. כדי למנוע התייבשות של דגימות, ניתן לכסות את השקופיות בחתיכת סרט פרפין.

לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא הלח, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBST טרי למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, יש לנער את עודפי ה-PBST, לכסות במהירות כל שקופית ב-250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מתאימה לדגירה של שעה בתא הלח בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה יש לשטוף את המגלשות שלוש פעמים ב-PBST טרי כפי שהודגם, ולהוסיף 250 מיקרוליטר של סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז טרי לכל מגלשה. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBST טרי, ולאחר מכן, נערו את עודפי ה-PBST וכסו כל שקופית ב-250 מיקרוליטר של תמיסת פלואורופור טירמיד טרייה.

דקה לאחר מכן, טבלו את השקופיות ב-PBST טרי, ולאחר מכן שלוש שטיפות של שתי דקות ב-PBST טרי. לאחר הכביסה האחרונה, יש למרוח כמה טיפות של גליצרול 1 ל -1 על תמיסת PBS על החלקים, ולבדוק אם יש אות פלורסנט על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כדי להסיר את קומפלקס הנוגדנים הראשון, הנח את השקיות המסומנות בנוגדנים ב-275 מיליליטר של תמיסת נתרן-ציטראט רותחת למשך שמונה דקות לפחות כפי שהודגם. בסיום הטיפול יש לפתוח את המכסה ולתת לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר, לפני שטיפת השקופיות שלוש פעמים עם PBST למשך חמש דקות לכל כביסה.

כדי לצבוע את חלבון המטרה השני המבוקש, לאחר שהודגמה חסימה לקשירה לא ספציפית, סמנו כל דגימה ב-250 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי השני המעניין בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב-PBST טרי לכל שטיפה לפני כיסוי כל שקופית ב-250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מתאימה לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה יש לשטוף את המגלשות שלוש פעמים ב-PBST טרי כפי שהודגם, ולהוסיף 250 מיקרוליטר של סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז טרי לכל מגלשה. כדי לפתח את האות לחלבון המטרה השני המעניין לאחר שלוש שטיפות PBST, טפל בשקופיות עם טירמיד מצומד פלואורופור בספקטרום פלואורסצנטי שונה.

כדי לעצור את התפתחות אות הטירמיד, טבלו את השקופיות לתוך PBST ואז צבעו את הדגימות בצבע גרעיני מתאים.