שיטת Multiplex Immunostaining באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין פונדקאי
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:31 דק׳ • July 8th, 2025
קח קטע קבוע וחדור של יותרת הכליה המורכב מקליפת המוח ומדולה. טפל בו עם מאגר חומצי רותח, ושבירת הקישורים הצולבים המושרים על ידי קיבוע לחשיפת אנטיגן.
לחסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים ולהכניס נוגדנים ראשוניים הנקשרים לסמנים ספציפיים לקליפת המוח.
הוסף נוגדנים משניים ביוטיניים המכוונים לנוגדנים הראשוניים ופרוקסידאזות מצומדות סטרפטווידין הנקשרות לביוטין.
הציגו טירמיד ומי חמצן מתויגים פלואורופור.
הפרוקסידאזות המשותקות משתמשות במי חמצן כדי להפעיל טירמיד, שנקשר לחלבונים סמוכים, ומסמן את קליפת המוח.
לאחר מכן, טפל בקטע עם המאגר הרותח כדי להפשיט את הנוגדנים הקשורים.
הציגו את אותם נוגדנים ראשוניים שנוצרו על ידי מיני מארח המכוונים לסמנים ספציפיים למדולה ונוגדנים משניים ביוטיניליים.
הציגו פרוקסידאזות מצומדות סטרפטווידין וטירמיד מצומד פלואורופור אחר כדי לתייג את המדולה.
הפשטת הנוגדנים הראשוניים הספציפיים לקליפת המוח מעכבת את הנוגדן המשני המוחזר הקושר אותם, ומונע תגובתיות צולבת.
מרחו כתם גרעיני ובצעו הדמיה כדי לדמיין את קליפת המוח והמדולה המוכתמים באופן מובהק, המאשרים שאין תגובתיות צולבת של נוגדנים.
לפני הצביעה, יש להסיר שעווה ולהחזיר לחות לשקופיות קבועות פורמלין ומשובצות בפרפין עם טבילה של חמש דקות בכל תמיסה כפי שמצוין. לאחר הטבילה השנייה במים מזוקקים, הניחו את השקופיות ב-275 מיליליטר של תמיסת נתר
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים