הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

קח את הפלסמיד הרצוי במדיה נטולת סרום. פלסמיד זה מקודד חלבונים ספציפיים לשלפוחית עם תגים פלואורסצנטיים.

בשפופרת אחרת, קח את מגיב הטרנספקציה המדולל במדיה נטולת סרום.

מערבבים את שתי התמיסות ודוגרים.

מגיב הטרנספקציה משתלב עם הפלסמיד ויוצר קומפלקס.

קח באר המכילה נוירונים דבקים בתקשורת עם סרום. מוסיפים את המתחמים ודוגרים. הקומפלקס מקל על כניסת הפלסמיד לתא.

השלך את המדיה כדי להסיר קומפלקסים לא מופנמים.

הוסף מדיה טרייה ואז דגירה.

הפלסמיד נכנס לגרעין לתמלול ולאחר מכן מתורגם לחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לשלפוחית המסמנים את השלפוחיות בנוירונים.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בטמפרטורה מבוקרת, רכוש תמונות במרווחי זמן מוגדרים.

כדי לנתח את התמונות, הגדר פרמטרי מעקב.

זהה את השלפוחית המעניינת ורשום את הקואורדינטות שלה בכל אחת מהתמונות.

אסוף את הנתונים כדי להמחיש את תנועת השלפוחית.

בהליך זה, מערבבים 4 מיקרוגרם פלסמיד עם 200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. בצינור נפרד, יש לדלל שמונה מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ב -200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. לאחר מכן, דגרו את התמיסה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, מערבבים את תמיסת הפלסמיד ואת תמיסת המגיב הטרנספקציה, ומדגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת לכלי תחתית הזכוכית המצופה.

דגרו על תאי העצב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, החלף את המדיום ב -2 מיליליטר של מדיום תרבית קליפת המוח, ודגר את הנוירונים ב -37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים.

לצורך הדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD עם עדשות אובייקטיביות פי 40. שמור על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת דגירה. רכוש תמונות נוירונים בפריים אחד כל 5 שניות במשך תקופה של 100 שניות הנשלטת על ידי תוכנת רכישת התמונה.

כדי לנתח את התמונות, פתח את כל התמונות הרציפות בתוכנת ImageJ עם מעקב ידני. כדי לשלב את התמונות הרציפות, בחר תמונה, לאחר מכן ערימות ולאחר מכן תמונות לערימה, ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תוספים ולאחר מכן מעקב ידני. יופיע חלון מעקב. לחץ על תיבת הסימון של הצג פרמטרים, והגדר את פרמטרי המעקב בסעיף הפרמטרים.

לאחר מכן, לחץ על הוסף רצועה כדי להתחיל רצועה חדשה. לאחר קביעת השלפוחיות המעניינות, לחץ על מרכז האותות בתמונות הרציפות כדי לרשום את קואורדינטות ה-XY. חזור על הליך זה כדי לאסוף את קואורדינטות XY של השלפוחיות מכל התמונות העוקבות. כל תמונה מתקדמת אוטומטית לתמונה העוקבת לאחר בחירת נקודת ההתייחסות.