מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

התחילו עם שברים גרעיניים וסינפטיים תת-תאיים שנאספו מהאמיגדלה הצדדית של מוחם של חולדות ביקורת וחולדות מותנות פחד.

כל חלק תת-תאי מכיל ריכוזים משתנים של פרוטאזומים 20S, הליבה הקטליטית של קומפלקס הפרוטאזום האחראי לפירוק חלבונים תאיים לא רצויים.

הוסף לדגימות מאגר בדיקה המכיל ATP ומצע פפטיד פלואורוגני ודגירה.

בנוכחות ATP, הפרוטאזום מבקע את הפפטיד הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורוגניות חופשיות.

בעזרת קורא צלחות, מדוד את עוצמת הקרינה במרווחי זמן קבועים.

כמת את הקרינה על ידי השוואתה לריכוזים סטנדרטיים ידועים של המולקולה הפלואורוגנית.

עוצמת הקרינה פרופורציונלית לפעילות הפרוטאזום בדגימה.

פעילות מוגברת של פרוטאזום בחלק הגרעיני של חולדות מותנות פחד מרמזת על שינויים בביטוי גנים הקשורים לזיכרון, בעוד ירידה בפעילות במקטע הסינפטי מצביעה על שינויים בביטוי החלבון הסינפטי הדרוש לשימור זיכרון לטווח ארוך.

כדי להגדיר את הבדיקה, יש לחמם מראש את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס ולהחזיק לאורך כל הריצה. הגדר את העירור ל-360 ננומטר ואת הפליטה ל-460 ננומטר. אם צלחת 96 הבארות המשמשת ברורה, הגדר את מיקום האופטיקה לתחתית. אם נעשה שימוש בצלחת כהה של 96 בארות, הגדר את מיקום האופטיקה למעלה. תכנת ריצה קינטית בזמן של שעתיים, סריקה כל 30 דקות.

הרכיבו מחדש את מאגר הבדיקה 10x של שנות ה-20 המסופק בערכה עם 13.5 מיליליטר מים טהורים במיוחד. הוסף 14 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי ATP למאגר ה-1x כעת. זה משפר משמעותית את פעילות הפרוטאזום בדגימות ומשפר את אמינות הבדיקה. הרכיבו מחדש את תקן AMC המסופק בערכה עם 100 מיקרוליטר DMSO. בצע שלבים באמצעות תקן AMC בחושך או בתנאי תאורה חלשים, מכיוון שהתקן רגיש לאור.

צור עקומה סטנדרטית של AMC מסדרה של ריכוזי AMC גבוהים עד נמוכים. עקומה זו תשמש לכיול קורא לוחות וניתוח פעילות הפרוטאזום בדגימות ההומוגניות. הרכיבו מחדש את מצע הפרוטאזום המסופק בערכה עם 65 מיקרוליטר של DMSO. בצע שלב זה גם בחושך או בתנאי תאורה חלשים, מכיוון שהמצע רגיש לאור.

לאחר מכן צור דילול של 1 עד 20 של מצע הפרוטאזום בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, באמצעות מאגר בדיקה של 20 S. הוסף כמות מנורמלת של הדגימות הרצויות לצלחת של 96 בארות. הפעל כל דוגמה בשכפול. כמות הדגימה הדרושה משתנה בהתאם להכנת הרקמות. בדרך כלל, 10 עד 20 מיקרוגרם מספיקים לכל חלק תת-תאי.

הביאו את נפח באר הדגימה ל-80 מיקרוליטר עם מים טהורים במיוחד. הכמות שנוספה תלויה בנפח הדגימה שנוספה. בשתי בארות נפרדות, הוסף 80 מיקרוליטר מים בלבד. אלה יהיו החסר של הבדיקה. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר בדיקה של 20 S לכל באר, כולל ריקים לבדיקה. השתמש במשחזר או בפיפטה אוטומטית כדי להבטיח נפח בדיקה עקבי על פני הבארות.

כבו את האורות או היכנסו לחדר חשוך. הוסף את כל 100 המיקרוליטרים של תקני AMC מדוללים לבאר חדשה, תוך שימוש בבאר אחת לכל תקן. בחושך, השתמש במשחזר או בפיפטה אוטומטית כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של מצע פרוטאזום מדולל לבארות המכילות ריקים של דגימה ובדיקה, אך לא בתקן AMC. הנח את הצלחת בקורא הצלחות והתחל את הריצה הקינטית.