מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

התחילו עם שברים גרעיניים וסינפטיים תת-תאיים שנאספו מהאמיגדלה הצדדית של מוחם של חולדות ביקורת וחולדות מותנות פחד.

כל חלק תת-תאי מכיל ריכוזים משתנים של פרוטאזומים 20S, הליבה הקטליטית של קומפלקס הפרוטאזום האחראי לפירוק חלבונים תאיים לא רצויים.

הוסף לדגימות מאגר בדיקה המכיל ATP ומצע פפטיד פלואורוגני ודגירה.

בנוכחות ATP, הפרוטאזום מבקע את הפפטיד הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורוגניות חופשיות.

בעזרת קורא צלחות, מדוד את עוצמת הקרינה במרווחי זמן קבועים.

כמת את הקרינה על ידי השוואתה לריכוזים סטנדרטיים ידועים של המולקולה הפלואורוגנית.

עוצמת הקרינה פרופורציונלית לפעילות הפרוטאזום בדגימה.

פעילות מוגברת של פרוטאזום בחלק הגרעיני של חולדות מותנות פחד מרמזת על שינויים בביטוי גנים הקשורים לזיכרון, בעוד ירידה בפעילות במקטע הסינפטי מצביעה על שינויים בביטוי החלבון הסינפטי הדרוש לשימור זיכרון לטווח ארוך.

כדי להגדיר את הבדיקה, יש לחמם מראש את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס ולהחזיק לאורך כל הריצה. הגדר את העירור ל-360 ננומטר ואת הפליטה ל-460 ננומטר. אם צלחת 96 הבארות המשמשת ברורה, הגדר את מיקום האופטיקה לתחתית. אם נעשה שימוש בצלחת כהה של 96 בארות, הגדר את מיקום האופטיקה למעלה. תכנת ריצה קינטית בזמן של שעתיים, סריקה כל 30 דקות.

הרכיבו מחדש את מאגר הבדיקה 10x של שנות ה-20 המסופק בערכה עם 13.5 מיליליטר מי