השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

מדידה של שיעורים אזוריים של סינתזת חלבון במוח יכולה לעקוב אחר התגובה של המוח לשינויים ארוכי טווח כאלה המתרחשים במהלך התפתחות ונוירופלסטיות. לשיטה שלנו יש את היתרונות כי המדידות הן כמותיות לחלוטין, והן נעשות בבעלי החיים המתנהגים ערים. הטכניקה האוטוביוגרפית הכמותית מאפשרת מדידות בכל אזורי המוח בו זמנית.

הדגימה של ההליך תהיה אניטה טורוסיאן, עמיתה לתואר ראשון במעבדה שלי, ונטינג'יאן הואנג, מנתח החיות שלנו. התחל הליך זה עם הכנה לניתוח כמפורט בפרוטוקול הטקסט. פעם אחת על שלב הניתוח, להשתמש במספריים כירורגיים כדי להפוך חתך סנטימטר אחד מן החלק המדיאלי העליון של הירך השמאלית rostrally לכיוון קו האמצע חושף את עורק הירך ואת וריד.

לסגת עור רופף עם ווים עור כירורגי מעל משני צדי החתך. לאבטח את ווים העור על ידי הקלטת אותם לשלב הניתוח. יש למרוח 0.9% נתרן כלורי סטרילי על האזור החשוף כדי לשמור על לחות נאותה.

השתמש מטלפים כדי לנתח קהה, הפרדת רקמת החיבור סביב קטע קטן של עורק הירך והווריד. בזהירות להפריד את העורק ואת וריד. עכשיו להשתמש במקלות להשחיל גדיל אחד של תפר נספג תחת וריד הירך ועורק בנקודה הצדדית ביותר של החתך.

משוך את התפר באמצע הדרך כך הקצוות הם אפילו. בנקודה פרוקסימלית יותר למפשעה, השתמש במלקיחות כדי להשחיל תפר שני מתחת לווריד הירך בלבד. לקשור בעדינות חצי קשר שישמש להגבלת זרימת הדם.

בנקודה בין גדיל A ו strand B, להשתמש מדפים להשחיל תפר שלישי תחת רק את וריד הירך. לקשור בעדינות קשר מלא שישמש להגבלת זרימת הדם. תיזהר לא לקרוע את הוריד.

משוך בעדינות על גדיל B כדי להגביל את זרימת הדם. השתמש בהמוסטט כדי למשיכה עדינה של גדיל B כדי לשמור על הגבלת דם. עכשיו, לחבר את הקצה הלא חתוך של צינורות PE למחט מד 32 ומזרק מילימטר אחד מלא מלוחים heparinized.

לשטוף את הקטטר כדי להסיר בועות אוויר. חותכים חור קטן באזור המוגבל של וריד הירך עם מספריים מיקרו, ובזהירות להכניס את הקצה הזוויתי של צינורות PE שמונה סמוק לכיוון גדיל B.Once מוכנס, לשחרר את המתח של גדיל B ולהנחות את הקטטר עוד יותר במעלה הוריד. הדקו את הגדיל B סביב הוריד המכיל את הקטטר.

באמצעות גדיל C, לקשור קשר נוסף סביב הקטטר. ודא קשר זה אינו לוכד את עורק הירך. בעדינות למשוך בחזרה על חבית מזרק כדי למלא חלקית את הצינורות בדם כדי להבטיח כי קטטר הושתל כראוי לפני החדרת PE 10 קטטר לתוך עורק הירך השמאלי באמצעות אותו הליך.

לאחר שגם וריד הירך וגם קטטרים עורקים אובטחו, לקשור גדיל A לתוך קשר סביב שני קטטרים. לאחר חיתוך כל התפרים העודפים והסרת ווים בעור, לשטוף את קטטר העורקים עם מלוחים heparinized כדי למנוע קרישה. לצרוב את הקצוות של שני קטטרים כדי ליצור חותם.

מניחים את העכבר במצב נוטה ולעשות חתך קטן בבסיס הצוואר החלת מלוחים על האזור החשוף. הכנס מוט מתכת חלול תת-מדרמלית מהחתך בצוואר לחתך הירך. נחש את הקטטרים דרך המוט החלול ומן החתך בצוואר.

לאחר הסרת המוט החלול, סגור את החתך בירך עם תפר ואחריו משכך כאבים לאחר ניתוח. נחש את הקטטרים דרך צינור חלול גמיש 30 ס"מ כדי להפוך את קפיץ לקשור לפני תופר את הכפתור של קפיץ לקשור מתחת לעור ואחריו משכך כאבים לאחר הניתוח. להזיז את העכבר לתוך מיכל גלילי ברור עם הר מסתובב זרוע כדי לשכן את העכבר במהלך תקופת ההחלמה.

מניחים יד חמה יותר מתחת למיכל כדי לשמור על העכבר חם. ודא שהעכבר נמצא במצב פיזיולוגי תקין בתחילת הניסוי על ידי לקיחת דגימות כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי לנהל את מכשיר המעקב דרך הווריד, השתמש במחבר Y עם מזרק המחזיק את מכשיר המעקב לאוצין המסומן C 14 המחובר לזרוע אחת, ומזרק עם 100 עד 200 מיקרוליטרים של תמיסת מלח סטרילית כדי לשטוף את הקו הווריד המחובר לזרוע השנייה.

חבר את מחבר ה- Y לקו הווריד. ליזום את המחקר על ידי בו זמנית מתחיל שעון להפסיק, הזרקת tracer, ואיסוף דגימות דם עורקי מתוזמן. לשטוף את הקו הווריד עם מלוחים מיד לאחר ההזרקה.

לאסוף דגימות דם אחד עד שבע ברציפות לאורך שתי הדקות הראשונות של הניסוי באותו אופן. לאחר איסוף שבע הדגימות, לאסוף 30 microliters של דם חלל מת לפני כל מדגם שנותר. דגימות שמונה עד 14 נאספות בשלוש, חמש, 10, 15, 30, 45 ו-60 דקות בהתאמה.

בשלב מסוים במהלך הניסוי, לעבד שלושה צינורות עבור סטנדרטים פנימיים המכילים לצין טריטי ונורלאוקין כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי לכמת ריכוזי לאוצין פלזמה, השתמש במערכת HPLC עם עמודת חילופי חיתוך נתרן ופרסם נגזרת עמודה עם אורתופתללדהיד וזיהוי קמח. האזור מתחת לעקומה לאוצין הוא פרופורציונלי לריכוז של לאוצין המדגם.

השתמש בהשוואה עם תקנים לכמת ריכוזי לאוצין בדגימות. לאחר מכן השתמש מונה scintillation נוזלי לכמת התפוררויות לדקה של טריטיום ו C 14 בדגימות הפלזמה. השתמש בריכוזים אלה כדי לבנות את עקומת האישור של C 14 שכותרתו לאוצין מהמחזור ואת מסלול הזמן של הפעילות הספציפית שלה בפלזמה העורקית.

מתוך הגרף, לחשב את משולב C 14 שכותרתו לאוצין פעילות ספציפית בפלזמה העורקית. כדי לבצע אוטוביוגרפיה כמותית, להכין את חלקי המוח 20 מיקרון בעובי. חלק המוח באמצעות קריוסטט במינוס 20 מעלות צלזיוס.

הפשר חלקים על שקופיות מצופות ג'לטין. לאחר קיבעון של שקופיות, סדר שקופיות בקלטת סרט רנטגן יחד עם קבוצה של תקני מתיל מתאקרילאט מכוילים בעבר C 14. בחדר חשוך ותחת אור בטוח, מניחים חתיכת סרט רנטגן, צד אמולסיה למטה על הצדדים והסטנדרטים.

אוטמים את הקלטת ומ מניחים אותה בשקית שחורה להחלפה. לפתח את הסרטים על פי הוראות היצרן. פיתוח אוטומטי של סרטים אינו מומלץ מכיוון שהרקע עשוי להיות לא אחיד ועשוי להשפיע על הכימות.

לבנות עקומת כיול של צפיפות אופטית לעומת ריכוז רקמה C 14 בהתבסס על ערכי הצפיפות האופטית של סט התקנים המכוילים בסרט. התאם נתונים אלה למשוואה פולינומית. משוואה פולינומית מדרגה שנייה או שלישית מתאימה מאוד.

כדי לנתח אזורי מוח ספציפיים, אתר את אזור העניין או את ההשקעה בשישה עד שמונה חלקים בהשוואה לאתלי המוח. רשום את הצפיפות האופטית של הפיקסלים בתוך דיסק ההשקעה בכל המקטעים. בהתבסס על עקומת הכיול, מחשב את ריכוז הרקמה C 14 בכל פיקסל.

לבסוף, לחשב את המחירים האזוריים של סינתזת חלבון מוחי מן הרקמה הממוצעת C 14 ריכוז בהדרת ההשקעה בחלק האינטגרלי של היחסים של ריכוזי פלזמה עורקית של לאוצין ללא תווית ותיוג לפעמים t ו lamba. השבריר של לאוצין בבריכת מבשר הרקמות שמגיע מהפלזמה. להלן תמונות מייצגות של בעל חיים שטופל ברכב בהשוואה לחיה שטופלה באניסומיצין, מעכב סינתזת חלבונים.

שיעורי סינתזת החלבון פרופורציונליים לרמת החושך בתמונה. אניסומיצין מפחית באופן דרסטי את שיעורי נמדד של סינתזת חלבון המוח המציין את הספציפיות של שיטה זו. כאן, אוסטרדיוגרמות דיגיטציה מוצגות מעכבר התנהגות ער ברמה של ההיפוקמפוס וההיפותלמוס.

באזורים הכהים יותר יש שיעורים אזוריים גבוהים יותר של סינתזת חלבונים מוחיים. מוצג כאן הוא אוסטרדיוגרמה דיגיטציה מעכבר בקרת התנהגות ערה ברמה של ההיפוקמפוס הגבי. שיעורים של סינתזת חלבון מוחי מצופים בצבע בתמונות על פי סרגל הצבע.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות בטוחים כי בעלי חיים נמצאים במצב פיזיולוגי תקין במהלך המדידות. המתודולוגיה שלנו כבר הוכיחה פירוק של סינתזת חלבונים בהפרעות נוירו-התפתחותיות כמו תסמונת X שברירית. זה עשוי להיות גם סמן שימושי עבור שינויים ניווניים ותנאים כמו מחלת אלצהיימר.

ניתן להשתמש בשיטת סינתזת החלבון בשילוב עם היסטוכימיה חיסונית בחלקים מתחלפים כדי לתאם שינויים בסינתזת חלבונים עם שינויים אזוריים בחלבונים ספציפיים. לסיכום, שיטת הלוצין האוטוביוגרפית הכמותית L-1 C 14 אידיאלית לקביעה מדויקת של שיעורים אזוריים של סינתזת חלבונים ב- vivo. הוא מציע יתרונות ניכרים מבחינת דיוק ויישום שלו לתנאי vivo.