אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בגישות Virológicas (וירולוגיות) וביוכימיות שונות כדי לנתח את תפקידו של נתיב איתות במארח במהלך השכפול הליטי של נגיף הרפס מודלי. כאן, כדוגמה, אנו בוחנים את תפקידו של החלבון המיטוכונדריאלי לאיתות אנטי-ויראלי Mavs במהלך זיהום בנגיף הרפס gamma HV 68. ראשית, כדי לבחון את תפקידו של Mavs במהלך זיהום חריף, עכברים מסוג wild type ועכברים עם נוקאאוט של Mavs מודבקים ב-gamma HV 68 בעקבות זיהום ויראלי חריף.

ריאות העכבר נאספות ועומס הנגיף נקבע באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay), שבה הדגימות מדוללות בסדרה ונזרעות על מצע. לאחר מכן נספר מספר הפלאקים על השכבות החד-שכבתיות (monolayers). עלייה בעומס הנגיפי בעכברי knockout מרמזת כי הגן הנבדק ממלא תפקיד אנטי-ויראלי.

בניגוד לכך, עומסים ויראליים מופחתים בעכברי knockout מעידים כי הגן נחוץ לזיהום ויראלי. כדי לתקף ממצאים אלו, נבחנת קינטיקת גדילה רב-שלבית של נגיפיים in vitro בתאי פיברובלסטים עובריים של עכברים; תאי פיברובלסטים עובריים של עכברים מסוג wild type ותאי פיברובלסטים עובריים של עכברי mavs knockout מודבקים ב-gamma HV 68 ומודגריים לפרקי זמן שונים. לאחר מכן התאים נאספים ומבוצעים מבחני פלאקים (plaque assays) כדי להשוות את קינטיקת הגדילה הרב-שלבית בין תאי wild type לתאים חסרי mavs.

כדי לתקף ממצאים אלו באופן נוסף, תאי פיברובלסטים עובריים של עכברים מסוג פרא (wild type) ועכברים עם נוק-אאוט של mavs מודבקים ב-gamma HV 68. לאחר מכן, DNA ו-RNA מופקים בנפרד מהתאים המודבקים, והתמלילים הגנומיים של הנגיף מנותחים באמצעות real-time PCR. הרעיון לפרוטוקול זה עלה לראשונה כאשר חקרנו את תפקידה של מסלול חסינות של המארח במהלך זיהום נגיפי ליטי.

ניתן להחיל פרוטוקול זה פוטנציאלית כדי לבחון את כללי נתיבי השליחון של המארח במהלך זיהום על ידי פתוגנים אחרים. התחל את ההליך על ידי מתן זמן הסתגלות של ארבעה ימים למשך השחזור לאחר המשלוח עבור עכברים בני שש עד שמונה שבועות, תואמי מין, מאותה המערה.

כהכנה, לבשו ציוד מיגון אישי הכולל חלוק מעבדה, כפפות, מסכה וכסאות נעליים, בעבודה בתוך קבינט בטיחות ביולוגית ברמה 2. הכינו את תרחיף הנגיף עם 40 עד 10,000 PFU של gamma HV 68 ו-30 µL של PBS סטרילי עבור כל עכבר שיודבק.

שמרו את התססוף הויראלי על קרח לאחר הזרקה תוך-peritoneal של ketamine Xylazine. ודאו שהעכברים מרותקים על ידי ביצוע צביטה באצבע. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, טפטפו 30 µL של התססוף הויראלי לתוך הנחיר השמאלי או הימני.

השכיבו את העכבר על צדו למשך חמש עד 10 דקות כדי להקל על העברת הווירוס דרך דרכי הנשימה אל הריאה. לאחר מכן, החזירו את העכברים לכלובם ועקבו אחריהם עד להשכמה מלאה מהסדציה. בהמשך, אספו רקמת ריאה מהעכברים המוזרקים כדי להכין ליזאט תאי להערכת תיתור הווירוס בימים שונים לאחר ההדבקה.

העבירו את הריאות שהוצאו מעכברים שהוקרבו למבחנות סטריליות עם פקק הברגה בנפח 1.5 מיליליטר, המכילות 500 µL של חרוזי זירקוניה סיליקה בגודל 1.0 mm, על קרח. אם לא ממשיכים לשלב הבא באותו היום, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C.

במידה ולא, הוסיפו 1 mL של DMEM קר ללא סרום. הניחו את המבחנה במכשיר bead beater ולחצו על כפתור ההפעלה כדי להומוגניзировать את הריאות למשך 30 שניות. פעולה זו נועדה למנוע חימום יתר של הדגימה, העלול להשבית את הנגיף.

קררו את המבחנה על קרח למשך דקה אחת לפחות לאחר 30 שניות של הומוגניזציה. לאחר מכן, חזרו על תהליך זה. השלב הבא הוא סנטריפוגה של הרקמה ההומוגנית ב-16,000 RCF בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.

בעקבות הצנטריפוגה, ששאריות התאים יהיו בתחתית המבחנה והליפידים יהיו על פני השטח. קחו מיד את העלה (snat) כפי שמוצג כאן כדי לבצע בדיקת פלאקים (plaque assay) באמצעות שכבת מונו-שכבה של NIH three T three או BHK 21. לאחר מכן, תבוצע בדיקת פלאקים כדי לקבוע את התרעת הנגיפים (viral titer) הנוכחת בדגימה; התחילו את בדיקת הפלאקים על ידי ביצוע דילולים סדרה של העלה הנגיפית.

ראשית, באמצעות פיפט רב-ערוצי, יש להוסיף 270 µL של מצע ללוחית 96 בארות. השאירו את השורה הראשונה ריקה. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של עלנוס לשורה הראשונה של לוחית 96 הבארות; יש להעביר כל דגימה בשלוש חזרות.

בשלב הבא, העבירו 30 microliters של הדגימה מהשורה הראשונה לשורה הבאה וערבבו. לאחר מכן, העבירו 30 microliters מהתערובת לשורה הבאה וערבבו. חזרו על שלב זה מספר פעמים כדי לבצע דילולים סדרתיים של פי עשרה.

בשלב הבא, העבירו את העל-נוזל הוויראלי המדולל אל השכבה החד-שכבית של התאים בלוח 24 בארות. הניחו את הלוח באינקובטור ונערה אותו מדי 30 דקות במהלך דגירה של שעתיים. לאחר הדגירה, שאבו את העל-נוזל מהלוח כדי להסיר שיירי תאים.

לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם מצע טרי. לאחר השטיפה, הוסיפו לתאים מצע המכיל methylcellulose. דגרו את התאים במשך ארבעה עד שישה ימים.

לאחר השהייה של ארבעה עד שישה ימים, השתמשו במיקרוסקופ כדי לקרוא את מספר הלוחיות (plaques) עבור כל דגימה. רשמו את מספר הלוחיות עבור כל מהילול.

לאחר מכן חשב את הממוצע ואת סטיית התקן. בארות המכילות יותר מדי או מעט מדי פלאקים אינן ניתנות לשימוש לצורך חישוב מדויק של הטיטר. לכן, עבור כל דגימה, השתמש בדילול שבו ישנם בין שבעה ל-70 פלאקים.

מדגם זה, המדולל פי 1000, מכיל בממוצע 23 פלאקים לבאר. כדי לחשב את התר לשבקי הווירוס (viral titer) בתמיסה הבלתי מדוללת, הכפילו את מקדם הדילול במספר הפלאקים ובמספר המיקרוליטרים שבמיליליטר אחד. לאחר מכן, חלקו את התוצאה בנפח התא על של supernatant המדולל שהתווסף לכל באר.

לכן, בדוגמה זו, 1000 כפול 23 פלאקים כפול 1000 µL למילילטר חלקי 100 µL שווה ל-2.3 כפול 10 בחזקת 5 יחידות יוצרות פלאקים למילילטר. לאחר מכן, תמיסת סטוק ויראלית עם טיטר ידוע משמשת לקביעת קינטיקת הצמיחה של gamma HV 68 בפיברובלסטים עובריים של עכבר. התחילו בפיצול של תאי MEF מסוג wild type ותאים חסרים בגן מאכסן לתוך פלטה של 24 בארות בריכוז של 10,000 תאים לבערה. למחרת, החליפו את המדיום בכל בארה ב-0.5 mL של תרחיף gamma HV 68 בריכוז MOI נמוך.

הניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והמתינו שעתיים לאורך תקופת הדגירה. נערו את הפלטה בכל 30 דקות לאחר הדגירה. השתמשו בפיפטה כדי להסיר את תרחיף הנגיף והוסיפו 0.5 milliliters של מצע DMEM מלא טרי המכיל 8% fetal bovine serum לתאים שהודבקו בנגיף.

החזירו את התאים לאינקובטור במועדים שונים לאחר ההדבקה. אספו את התאים מהתווך באמצעות פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים. העבירו אותם למבחנות צנטריפוגה סטריליות בנפח 1.5 מיליליטר והקפיאו מיד את המבחנות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius כדי לשחרר את gamma HV 68 מהתאים.

בצעו שלושה מחזורי הקפאה והפשרה. הפשירו את התאים על ידי הנחתם בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, ערבבו במיקסר (vortex) והחזירו אותם למקפיא בטמפרטורה של 80- °C.

קבע את התר(titer) הנגיפי באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay) תוך שימוש בשכבה חד-שכבתית (monolayer) של תאי NIH 3T3 או BHK 21, כפי שהודגם קודם לכן, כדי לבחון האם שעתוק DNA או RNA מושפע מחסור בגנים של המארח או בגנים נגיפיים. התחל עם תאי mes מזוהמים במועדים שונים לאחר ההדבקה, השלך את העל-נוזל (supernatant), שטוף את התאים ב-PBS קר ובצע trypsinization לתאים על קרח. לאחר מכן, שקיע את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-1000 RCF בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת; לאחר הסבב, השלך את העל-נוזל ואחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

חלץ DNA ו-RNA כוללים, שהם ממקור המארח וממקור ויראלי. לאחר מכן, סבב את עמודי הספין בצנטריפוגה. בצע real-time PCR באמצעות ה-DNA הכולל ופריימר ספציפי לתמרירי ליטיס ויראליים.

קבעו את הכמות היחסית של גנום gamma HV 68 התוך-תאי ביחס לגן בית (housekeeping gene) של המארח, כגון beta actin. הכינו cDNA באמצעות RNA כולל ופריימר oligo DT. בצעו real-time PCR באמצעות ה-cDNA והפריימרים כפי שצוין לעיל כדי לקבוע את הכמות היחסית של התמלילים הוויראליים.

ביחס לגן הבית של המארח, Mavs הוא קיצור של mitochondrial antiviral signaling כפי שמוצג כאן. מולקולת המתאם Mavs מעבירה איתות מקולטנים דמויי RIG בצитоזול כדי להפעיל את NF kappa B וגורמי בקרה של אינטרפרון (IRFs), אשר בתורם מגבירים את ביטוי הגנים של ציטוקינים פרו-דלקתיים ואינטרפרונים. עומסי הנגיף בריאות של עכברים מסוג פרא (wild type) שהודבקו ב-gamma HV ועכברים מאותו שגר שחסרים את Mavs מוצגים כאן.

חסר ב-Mavs הפחית באופן משמעותי את העומסים הוויראליים בריאה 10 ימים לאחר ההדבקה, מה שמעיד על כך ש-Mavs נחוץ להדבקה ויראלית יעילה in vivo. איור זה מציג עקומת גדילה ויראלית רב-שלבית בתאי פיברובלסטים עובריים של עכברים מסוג פרא (wild type), ובכאלה עם חסר ב-Mavs. גדילה ויראלית שהתעכבה באופן משמעותי בפיברובלסטים עובריים של עכברים מעידה על כך ש-Mavs נחוץ לשכפול ויראלי יעיל in vitro. רמות ה-mRNA של גנים ליטיים ויראליים בפיברובלסטים עובריים של עכברים שהודבקו ב-gamma HV 68 נותחו באמצעות real-time PCR; חסר ב-Mavs הפחית באופן משמעותי את רמות ה-mRNA של שלושה גנים ליטיים חיוניים.

כל התוצאות הללו תומכות יחד במסקנה ש-Mavs נדרש להפעלה של תמלול gamma HV 68 ולשכפול ליטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובהB לגבי האופן שבו ניתן לבחון את האינטראקציה בין המאכסן לפתוגן ברמות מרובות, הן ב-VO והן ב-Vevo. אל תשכחו שעבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת ציוד מיגון אישי, במהלך ביצוע הפעולות.