אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בגישות וירולוגיות וביוכימיות שונות כדי לנתח את תפקידו של מסלול איתות מארח בשכפול ליטי של נגיף הרפס מודל. כאן כדוגמה, אנו בוחנים את תפקידו של חלבון האיתות האנטי-ויראלי המיטוכונדריאלי Mavs במהלך זיהום בנגיף ההרפס גמא HV 68. לראשונה כדי לבחון את תפקידם של Mavs במהלך זיהום חריף, עכברי נוקאאוט מסוג בר ו-Mavs נגועים בגמא HV 68 בעקבות זיהום ויראלי חריף.

ריאת העכבר נאספת ועומסים נגיפיים נקבעים על ידי בדיקת פלאק שבה הדגימות מדוללות ומצופות באופן סדרתי. על חד-שכבות נספר מספר הפלאקים. עומסים נגיפיים מוגברים בעכברי הנוקאאוט מרמזים על כך שהגן המעניין ממלא תפקיד אנטי-ויראלי.

לעומת זאת, עומסים נגיפיים מופחתים בעכברי נוקאאוט מצביעים על כך שהגן נדרש לזיהום נגיפי כדי לאמת את הממצאים הללו. קינטיקה של צמיחה רב-שלבית ויראלית במבחנה נבדקת בפיברובלסטים עובריים של עכברים, סוג פראי ו-mavs פיברובלסטים עובריים של עכברים נגועים בגמא HV 68 ומודגרים לזמנים שונים. לאחר מכן נאספים התאים ומבוצעות בדיקות פלאק כדי להשוות קינטיקה של צמיחה רב-שלבית בין תאים מסוג בר לתאים חסרי mavs.

כדי לאמת עוד יותר את הממצאים הללו, תאי פיברובלסטים עובריים של עכברים מסוג בר ו-mavs נגועים בגמא HV 68. לאחר מכן DNA ו-RNA מופקים בנפרד מהתאים הנגועים והתעתיקים הגנומיים הוויראליים מנותחים על ידי PCR בזמן אמת. הרעיון לפרוטוקול זה עלה לנו לראשונה כאשר חקרנו את תפקידו של מסלול חסינות מארח במהלך זיהום ליטי של נגיף.

ניתן ליישם פרוטוקול זה כדי לחקור את הכללים של מסלולי איתות מארח במהלך ההדבקה על ידי פתוגנים אחרים. התחילו בהליך זה על ידי מתן אפשרות לעכברים בני שישה עד שמונה שבועות התואמים למין להתאקלם לתקופה של ארבעה ימים לאחר המשלוח. הניסוי הבא יבוצע במתקן ביולוגי

כהכנה, לבשו ציוד מגן אישי כולל חלוק מעבדה, כפפות, מסכה ומגפונים הפועלים בארון של בטיחות ביולוגית. רמה שנייה. הכן את התרחיף הנגיפי עם 40 עד 10, 000 PFU של גמא HV 68 ו -30 מיקרוליטר של PBS סטרילי לכל עכבר שיידבק.

שמור את התרחיף הנגיפי על קרח לאחר הזרקה תוך-צפקית של קטמין קסילזין. ודא שהעכברים הורדמו על ידי ביצוע צביטה בבוהן. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, העבירו 30 מיקרוליטר מהתרחיף הנגיפי בטיפה לנחיר השמאלי או הימני.

הניחו את העכבר על צדו למשך חמש עד 10 דקות כדי להקל על העברת הנגיף לדרכי הנשימה לריאות. לאחר מכן החזירו את העכברים לכלוב שלהם ועקבו אחריהם עד שהם יתאוששו לחלוטין מההרגעה. לאחר מכן, רקמת הריאה נאספת מהעכברים המוזרקים כדי להכין ליזאט תאים להערכת טיטר ויראלי בימים שונים לאחר ההדבקה.

הנח את הריאות שנקטפו מעכברים שהוקרבו לתוך צינורות מכסה בורג סטריליים של 1.5 מיליליטר המכילים 500 מיקרוליטר של חרוזי סיליקה זירקוניה 1.0 מילימטר על קרח. אם לא ממשיכים לשלב הבא באותו היום. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.

אחרת, הוסף מיליליטר אחד של DMEM ללא סרום קר. הנח את הצינור במקצף חרוזים ולחץ על התחל כדי להומוגניזציה של הריאות למשך 30 שניות. כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה שעלולה להשבית את הנגיף.

מצננים את הצינור על קרח למשך דקה אחת לפחות לאחר 30 שניות של הומוגניזציה. ואז חזור על תהליך זה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הרקמה ההומוגנית ב-16,000 RCF בארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.

לאחר הסיבוב, פסולת התא תהיה בתחתית הצינור והשומנים יהיו על פני השטח. קח מיד את ה-snat כפי שמוצג כאן כדי לבצע בדיקת פלאק באמצעות NIH three T שלוש או BHK 21 חד-שכבתי. לאחר מכן, מבוצעת בדיקת פלאק כדי לקבוע את הטיטר הנגיפי הקיים בדגימה, התחל את בדיקת הפלאק על ידי ביצוע דילול סדרתי של הסופרנטנט הנגיפי.

ראשית, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 270 מיקרוליטר מדיה לצלחת של 96 בארות. השאר את השורה הראשונה ריקה. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של סופרנטנט לשורה הראשונה של צלחת 96 הבאר כל דגימה בשלוש עותקים.

לאחר מכן, העבירו 30 מיקרוליטר מהדגימה מהשורה הראשונה לשורה הבאה וערבבו. לאחר מכן מעבירים 30 מיקרוליטר מהתערובת לשורה הבאה ומערבבים. חזור על שלב זה מספר פעמים כדי לבצע דילול סדרתי פי עשרה.

לאחר מכן, הוסיפו את הסופרנטנט הנגיפי המדולל לחד-שכבת התא. בצלחת 24 באר. מניחים את הצלחת באינקובטור ומנערים את הצלחת כל 30 דקות במהלך דגירה של שעתיים לאחר הדגירה כדי להסיר פסולת תאים, לשאוב את הסופרנטנט מהצלחת.

לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת במדיום טרי. לאחר הכביסה מוסיפים לתאים מדיום המכיל מתיל צלולוז. דגרו על התאים במשך ארבעה עד שישה ימים.

לאחר שחלפו ארבעה עד שישה ימים. השתמש במיקרוסקופ כדי לקרוא את מספר הפלאק עבור כל דגימה. רשום את מספר הפלאק עבור כל דילול.

לאחר מכן חשב את הממוצע וסטיית התקן. בארות המכילות יותר מדי או מעט מדי פלאקים לא יכולות לשמש לחישוב מדויק של הטיטר. אז עבור כל דגימה, השתמש בדילול שבו יש שבעה עד 70 פלאקים.

לדגימה זו מדוללת פי 1000 יש ממוצע של 23 פלאקים לבאר. כדי לחשב את הטיטר הנגיפי בתמיסה הלא מדוללת, הכפל את גורם הדילול במספר הפלאק במספר המיקרוליטרים במיליליטר. לאחר מכן חלקו את זה בנפח הסופרנטנט המדולל שנוסף לבאר.

אז בדוגמה זו, 1000 כפול 23 פלאק כפול 1000 מיקרוליטר למיליליטר חלקי 100 מיקרוליטר שווה ל-2.3 כפול 10 ליחידות היוצרות החמישיות למיליליטר. לאחר מכן, נעשה שימוש בתמיסת מלאי ויראלית עם טיטר ידוע כדי לקבוע את קינטיקת הצמיחה של גמא HV 68 בפיברובלסטים עובריים של עכברים ORMs מתחילים בפיצול מיתוסים מסוג בר ואלה החסרים בגן מארח לצלחת של 24 בארות ב-10,000 תאים לבאר. למחרת, החלף את המדיום בכל באר ב-0.5 מיליליטר של מתלה MOI gamma HV 68 נמוך.

מניחים את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לדגירה להמשיך במשך שעתיים לאורך כל הדגירה. נדנד את הצלחת כל 30 דקות לאחר הדגירה. השתמש בפיפטה כדי להסיר את התרחיף הנגיפי ולהוסיף 0.5 מיליליטר של DM EM שלם טרי המכיל 8% סרום בקר עוברי לתאים נגועים בנגיף.

החזירו את התאים לאינקובטור בימים שונים לאחר ההדבקה. קצור את תאי הקצה הבינוני על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. העבירו אותם לצינורות צנטריפוגות סטריליים של 1.5 מיליליטר, הקפיאו מיד את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לשחרר גמא HV 68 מהמטס.

בצע שלושה מחזורי הקפאה והפשרה. הפשירו את התאים על ידי הצבתם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבולת ומניחים אותם בחזרה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.

קבע טיטר ויראלי על ידי בדיקת פלאק באמצעות NIH three T three או BHK 21 חד-שכבתי כפי שהוצג קודם לכן כדי לבחון אם שכפול DNA או RNA מושפע ממחסור בגנים מארחים או בגנים נגיפיים. התחל עם mes נגוע בימים שונים לאחר ההדבקה, השליך את הסופרנטנט, שטוף את התאים עם PBS קר ותאי קרח טריפסין. לאחר מכן גלולה את התאים על ידי צנטריפיקציה ב-1000 RCF בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט ואחסנו את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

חלץ את סך ה-DNA וה-RNA, שמקורו במארח ובויראלי. ואז צנטריפוגה את עמודי הספין. בצע PCR בזמן אמת באמצעות DNA כולל ופריימר ספציפי לתעתיקים ליטיים ויראליים.

קבע את הכמות היחסית של גנום גמא HV 68 תוך תאי בהתייחס לגן משק בית מארח כגון בטא אקטין. הכן CDNA עם פריימר RNA כולל ואוליגו DT. בצע PCR בזמן אמת באמצעות CD NA ופריימרים כאמור לעיל כדי לקבוע את הכמות היחסית של תעתיקים ויראליים.

בהתייחס לזה של גן משק הבית המארח, Mavs הוא קיצור של איתות אנטי-ויראלי מיטוכונדריאלי כפי שמוצג כאן. מולקולת המתאם של Mavs מעבירה איתות מקולטנים דמויי עין אסדה ציטוזולית כדי להפעיל גורמי ויסות NF kappa B ואינטרפרונים IRFs אשר בתורם מווסתים את ביטוי הגנים של ציטוקינים ואינטרפרונים פרו-דלקתיים. העומסים הוויראליים בריאה של עכברי בר מסוג גמא HV ועכברי המלטה עם מחסור ב-Mavs מוצגים כאן.

מחסור ב-Mavs הפחית משמעותית את העומסים הנגיפיים בריאה 10 ימים לאחר ההדבקה, מה שמצביע על כך ש-Mavs נדרש לזיהום ויראלי יעיל in vivo. איור זה מציג עקומת גדילה רב-שלבית ויראלית על פיברובלסטים עובריים של עכברים מסוג בר, ואלה החסרים במחסור ב-Mavs ב-Mavs. עיכוב משמעותי בצמיחה הנגיפית על פיברובלסטים עובריים של עכברים המצביע על כך ש-Mavs נדרש לשכפול ויראלי יעיל ברמות mRNA במבחנה של גנים ליטיים נגיפיים בפיברובלסטים עובריים של עכברים נגועים בגמא HV 68 נותחו על ידי מחסור ב-PCR בזמן אמת ב-Mavs, הפחית משמעותית את רמות ה-mRNA של שלושה גנים ליטיים חיוניים.

כל התוצאות הללו תומכות ביחד במסקנה ש-Mavs נדרש להפעלת שעתוק גמא HV 68 ושכפול ליטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את האינטראקציה של הפתוגן המארח במספר רמות, הן ב-VO והן ב-Vevo. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים יכולה להיות מהוססת ביותר.

יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בזמן ההופעות.