איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות את הגנום של נגיף ההרפס סימפלקס, סוג 1, בחתכים של גנגליונים טריגמינליים מעכברים שהודבקו בזיהום חבוי, באמצעות היברידיזציהה פלואורסצנטית באתר (FISH). דבר זה מושג תחילה על ידי הזriktת הנגיף לשפת בעל החיים, ולאחריה תקופת דגירה של 28 ימים שבה הנגיף מתבסס בגנגליונים הטריגמינליים. לאחר מכן, הגנגליונים הטריגמינליים נאספים, נטמעים ונחתכים בשיטות קריו.

החתכים עוברים מספר טיפולים מקדימים, כולל השלב המכריע של חימום בתמיסת בופר של נתרן ציטראט. לבסוף, מבוצע היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (fluorescent in situ hybridization) באמצעות גשים פלואורסצנטיים ספציפיים להרפס. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את מיקומו של הגנום הוויראלי בתוך הגרעין של נוירונים נגועים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

במקרים רבים, חקר מחזורי חיים שונים מחייב שימוש במודלים של בעלי חיים. היתרון המרכזי של הטכניקה המוצגת כאן הוא שהיא מספקת נתונים ברמת התא הבודד באמצעות גישת זיהוי תאיים רציפה. מודל החולדה של זיהומי HS משחזר את מרבית ההיבטים של ההיסטוריה הטבעית של זיהום HSV-1 בבני אדם.

זהו המארח הטבעי של הנגיף. הזיהום הראשוני מתרחש ברקמות הפה, ולאחר מכן הנגיף מתקדם מהשפתיים אל הגנגליון התריגמינלי. זהו האתר העיקרי של לטנציה של HSV בבני אדם. שילוב של אימונו-וצביעה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הנוגעות ללטנציה של נגיף ההרפס, כגון האופן שבו הנגיף מקייים אינטראקציה עם רכיבים גרעיניים, וכיצד אינטראקציות אלו משפיעות על השמירה על הלטנציה ובסופו של דבר על ריאקטיבציה של הנגיף. לתחילת העבודה, יש להכין עכבר תחת הרדמה ותמיסת סטוק של נגיף HSV one. תמיסה זו תהיה רסוספנדית במצע ללא פנול אדום.

באמצעות סטראוסקופ בינוקולרי, הכניסו את המחט לשכבה הסוב-אפיתליאלית של השפה העליונה השמאלית בגבול המוקו-קוטנאלי. הזריקו 0.5 µL של תמיסת וירוס לאורך חמש שניות, ולאחר מכן בצעו הזרקה שנייה של וירוס באותו אתר. העבירו את העכבר לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C או למצע חימום עד להתעוררותו.

לאחר מכן, החזירו את בעל החיים לכלובו למשך זמן ההתאוששות הנדרש לפני ביצוע פרפוזציה וקיבוע בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בצעו חיתוך בכל צד של הלסת התחתונה. לאחר מכן, חתכו את קצה האף מיד מאחורי השיניים החותכות כדי לחשוף את חלל האף.

גזרו את החיך לשניים בעזרת מספריים, ולאחר מכן הניחו אותו בצד. הגנגליונים התריגמינליים נמצאים מתחת לחיך. אלו הם גושים לבנים ומוארכים, באורך של שני עד שלושה מילימטרים, המחוברים לעצב התריגמינלי.

חתכו את ענפי עצב השלישייה (trigeminal nerve) משני צדי הגנגליונים כדי לשחרר אותם מגזע המוח. בעזרת פלייר כירורגי, הסירו את הגנגליונים והעבירו אותם ל-20%Sucrose ב-PBS להדגרה למשך 24 שעות. למחרת, בטמפרטורת החדר, הטמיעו את שני גנגליוני השלישייה בבלוק בודד להכנה של נתחי קריו (cryosectioning).

מדיום הטמעה, הקפאו את הבלוק בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד לביצוע חיתוכים בקריוסטט. חתכו את ganglion trigeminale לאורכו לפרוסות של 10 micron ואספו אותן על שקופיות super frost שחוממו ל-30 degrees Celsius. ארבע עד חמש פרוסות יכולות להיכנס בשקופית אחת.

סימון השקופית במספר תוויות של סדרות יכול להיות שימושי. אם מתוכננים מספר יישומים בהמשך, יש להניח לפרוסות להתייבש במשך 5 עד 10 דקות לפני אחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. בפרוטוקול זה, הגשוש (probe) מוכן על ידי סימון cosms המכילים מקטעים של 30 kilobase של גנום HSV one באמצעות SI 3D CTP על ידי NIC translation.

החומר משקע וסספנדה בפורמדיד דה-יוני, וצפוי להיראות בצבע ורוד עקב שילוב של S SI three ביום הראשון. הניחו את השקופיות על מחזיק שקופיות בטמפרטורת החדר והמתינו לייבוש החתכים למשך 10 דקות. לאחר מכן, בצעו רהידרציה של החתכים ב-1XPBS למשך 10 דקות.

בשלב הבא, בצעו פרמיאציה לרקמה ב-0.5% Triton X 100 ב-1x PBS למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים למשך 10 דקות לכל שטיפה עם 2x SSC והשאירו אותן ב-2x SSC עד לחימום של תמיבפער הצפניר (unmasking buffer). לצורך חשיפת האפיטופים (unmasking), חממו מראש את תמיב הסיטראט במיקרוגל עד לרתיחתו.

פעולה זו מתבצעת על ידי מילוי מגש לשקופיות זכוכית ב-200 milliliters של הבאפר. מקיימים את המגש בתוך מכל גדול יותר מלא ב-500 milliliters של מים מזוקקים ומחממים את הבאפר מראש עד לרתיחה. לאחר מכן, מעבירים את השקופיות למגש.

וודאו שהשקופיות מכוסות לחלוטין בבופר בתוך המיקרוגל. חממו את השקופיות בבופר למשך כ-20 שניות עד שהבופר יגיע לרתיחה. הקפידו שהבופר לא יגלוש בזמן הרתיחה.

לאחר מכן, קררו את השקיפות בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות וחזרו על מחזור החימום שש פעמים נוספות. קריטי לקבוע באופן אמפירי את מספר ומשך מחזורי החימום לצורך שחזור של שלב הסרת המסכה (unmasking). תנור המיקרוגל, המגש, המכל, ונפח הבופר במגש.

יש לשמור על נפח מים זהה במיכל עם סיום החימום. העבירו את השקופיות לשתי XSSC למשך חמש דקות תחת מ पॉपुलर, דגרו את השקופיות בתמיסה של methanol, acetic acid ו-PBS ביחס של שלושה לواحد לארבע למשך 15 דקות. לאחר מכן, דגרו את השקופיות בתערובת טרייה של methanol ו-acetic acid ביחס של שלושה לאחד למשך 15 דקות.

כעת יש לבצע דהידרטציה לחתכים באמצעות סדרת דגירה של 10 דקות ב-70% ethanol, ולאחריהן שתי דגירות של 10 דקות ב-ethanol טהור. יש להניח לזכוכיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להכינן עבור הגשושית. יש להוסיף בטיפות 80 µL של תמיסת גשושית לחתכים המיובשים ולכסות אותם בzכוכית כיסוי.

יש לוודא שתמיסת הגילוי מתפשטת על פני כל שטח הזכוכית המכסה ושאין בועות. לאחר מכן, יש לאטום את הזכוכית המכסה באמצעות דבק גומי ולהמתין לייבוש. המשך בתהליך הדנטורציה על ידי הדגרת השקופיות ב-80 °C למשך חמש דקות.

לאחר מכן, העבירו במהירות את השקופיות למגש מתכתי על קרח למשך חמש דקות. המשיכו בהיברידיזציה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ביום למחרת. הסירו את הדבק הגומי באמצעות פינצטה כאשר השקופיות נמצאות על בלוק חימום בטמפרטורה של 37 °C.

הסיר בעדינות את זכוכית הכיסוי באמצעות קצה להב סקלפל. לאחר מכן, שטוף את החתכים שוב ושוב ב-SSC. כעת, צבע את הדגימות למשך 10 דקות עם צבע מתאים כגון DAPI או hooks 3 3 3 4 2 בריכוז של 0.5 µg/mL ב-1X PBS.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS למשך 10 דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפה השלישית, נקו כ যতটা ניתן מהנוזל השקופית. לבסוף, מרחו 80 µl של תמיסת קיבוע (mounting medium) הכוללת חומר למניעת דהייה (anti-fading agent) בקצה כל שקופית.

כסו באיטיות את המצע בעזרת זכוכית כיסוי בעלת איכות אופטית גבוהה, תוך הימנעות מיצירת בועות. לאחר מכן, אטמו את השקופית בעזרת לק לציפורניים ואחסנו אותה בחושך בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. במהלך פיתוח פרוטוקול זה, נבחנו מספר בופרי מלח לצורך חשיפת האפיטופים (unmasking).

בעוד שבופרי EDTA נטו לגרום נזק לרקמה, סודיום ציטראט טריס, HCL ומים מזוקקים היו מתאימים לגילוי HSV one כדי לוודא שהפרוטוקול יעבוד עם גששים מסחריים. גילוי הגנום הלטנטי של HSV one בוצע באמצעות גשש PAN HSV one ביוטיניליר שהושג מ-Enzo Biochem, וניתן היה לזהות תבניות של נקודה בודדת ושל נקודות מרובות עבור הגנום של HSV one.

יתרה מכך, פרוטוקול ה-DNA fish נבחן בעכברים ובשפנפנים שהודבקו בשלושה זנים נפוצים של HSV one. בכל המקרים, הגנומים של HSV one הראו אות נקודתי בעוצמה ובבהירות משתנות. בנוסף, התapplicability של הפרוטוקול נבחנה במחזור השכפול של HSV one באמצעות ביצוע DNA fish ברקמות מעכברים שעברו זיהום הרפס כללי.

בבעלי חיים אלו, זוהו אגרגטים גדולים ובהירים של גנומי HSV one ברקמות שונות, כולל ב-DRG, בעיניים ובמוח. פרוטוקול ה-DNA fish הוא ורסטילי מאוד. הוא מאפשר זיהוי משותף של גנום HSV one ושל RNA ווירוסים או חלבונים תאיים.

לדוגמה, גילוי משולב של הגנום של HSV-1 יחד עם ה-lat RNA של HSV-1 הוא אפשרי. גילוי משולב של הגנום של HSV-1 עם חלבונים תאיים, כגון חלבון ה-Centromeric CE NPA A, שימש לגילוי משולב של HSV-1 עם הכרומטין וגופי הגרעין PML. חלבון ה-Associated protein A TRX הוצג באמצעות צביעה משולשת שהראла את HSV 1D NA באדום, את תוצר ה-RNA שלו, lat, בכחול ואת A TRX בירוק.

ברגע ששלב חשיפת האתרים (unmasking) הוגדר, פרוצדורת ה-DNA fish היא חסונה מאוד. ניתן לבצעה בפחות מ-24 שעות במנות של 20 סליידים או יותר. פיתוח טכניקה זו יאפשר לחוקרים הבוחנים וירוסי הרפס ווירוסים עמידים אחרים לחקור ברמה של תא בודד, כיצד רכיבים תאיים ומבנה הגרעין עשויים להשפיע על הביולוגיה של וירוסים אלו.