איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את הגנום של נגיף הרפס סימפלקס, סוג אחד בחלקים של גרעיני טריגמינל מעכברים נגועים סמויים על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה. זה מושג על ידי חיסון הנגיף תחילה בשפת החיה, ולאחר מכן תקופת דגירה של 28 יום שבמהלכה הנגיף מתבסס בגרעינים הטריגמינליים. לאחר מכן, הגרעינים הטריגמינליים נקצרים, מוטמעים ומחתכים קריו.

החלקים נתונים למספר טיפולי הכנה, כולל שלב המפתח של חימוםם במאגר נתרן ציטראט. לבסוף, הכלאה פלואורסצנטית באתרה מתבצעת באמצעות גלימות פלואורסצנטיות ספציפיות להרפס. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את מיקום הגנום הנגיפי בתוך גרעין הנוירונים הנגועים בנפרד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

במקרים רבים, חקר מחזור חיים שונה דורש שימוש במודלים של בעלי חיים. היתרון העיקרי של הטכניקה המיוצגת כאן הוא שהיא מספקת נתונים ברמת התא הבודד באמצעות גישת המכון לשליטה שוטפת. מודל הרוצח המלכותי של זיהומי HS משחזר את רוב ההיבטים של ההיסטוריה הטבעית של זיהום HSV 1 בבני אדם.

זהו המארח הטבעי של הנגיף. הזיהום הראשוני נעשה ברקמות הפה, ואז הנגיף מתקדם מהשפתיים לשני הגנגליונים האל. זהו הצד העיקרי של חביון HS V בבני אדם משולב שני חיסון וצביעה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לחביון נגיף ההרפס, כגון כיצד הנגיף מקיים אינטראקציה עם רכיבים גרעיניים, וכיצד אינטראקציות אלו ישפיעו על שמירה על חביון ובסופו של דבר הפעלה מחדש של הנגיף. כדי להתחיל, יש עכבר מורדם ו-HSV תמיסת מלאי וירוס אחת. מושעה במדיום נטול פנול אדום.

בעזרת סטריאוסקופ דו-עיני, הכנס את המחט לשכבה התת-אפיתלית של השפה העליונה השמאלית בגבול הרירי. הזרקו 0.5 מיקרוליטר של תמיסת וירוס במשך חמש שניות, ולאחר מכן בצעו זריקה שנייה של הנגיף באותו אתר. העבירו את העכבר לחממה או לכרית חימום של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מתעורר.

לאחר מכן הכניסו אותו לכלוב הביתי שלו לזמן ההתאוששות הנדרש לפני שתתקן אותו בהתאם לפרוטוקול הטקסט. חותכים מכל צד של הלסת התחתונה. לאחר מכן חתכו את קצה האף ממש מאחורי החותכות כדי לחשוף את חלל האף.

חותכים את החך לשניים במספריים ואז מניחים אותו בצד. הגרעינים הטריגמינליים נמצאים מתחת לחיך. הם גושים מלבניים לבנים, באורך של שניים עד שלושה מילימטרים ומחוברים לעצב הטריגמינלי.

חותכים את ענפי העצב הטריגמינלי בכל צד של הגרעינים כדי לשחרר אותם מגזע המוח. בעזרת צבת כירורגית, הסר את הגרעינים והעביר אותם ל-20% סוכרוז ב-PBS מאפשר להם לדגור למשך 24 שעות. בטמפרטורת החדר למחרת, הטמיעו את שני הגרעינים הטריגמינליים בבלוק אחד של הקפאה.

הטמעת מדיום, הקפיאו את הבלוק במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהוא נחתך על קריוסטט. חותכים את הגרעינים הטריגמינליים לאורכם לחלקים של 10 מיקרון ואוספים אותם על מגלשות סופר פרוסט מחוממות ל -30 מעלות צלזיוס. ארבעה עד חמישה מקטעים יכולים להתאים לשקופית אחת.

מתן תוויות מרובות לשקופית של סדרות מרובות יכול להיות שימושי. אם מתוכננים מספר יישומים במורד הזרם, הניחו לפרוסות להתייבש במשך חמש עד 10 דקות לפני שמאחסנים אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור פרוטוקול זה, הגשושית מוכנה על ידי תיוג קוסמוסים המכילים חלקים של 30 קילו-בסיס של גנום HSV אחד עם SI 3D CTP על ידי תרגום NIC.

הוא משקע ותלוי בצורה נטולת יונים של אמיד ואמור להופיע ורוד עקב שילוב S SI 3 ביום הראשון. הנח את השקופיות על מחזיק שקופיות בטמפרטורת החדר ותן לחלקים להתייבש במשך 10 דקות. לאחר מכן החזר את החלקים למים ב-XPBS אחד למשך 10 דקות.

לאחר מכן, סרקו את הטישו ב-0.5%Triton X 100 ב-XPBS אחד למשך 20 דקות. לאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה עם שני XSS ושמרו אותן בשני XSSC עד לחימום מאגר הסרת המסכה. להסרת המסכה מחממים מראש את מאגר הציטראט במיקרוגל עד שהמאגר רותח.

זה נעשה על ידי מילוי מגש שקופיות זכוכית עם 200 מיליליטר של המאגר. מניחים את המגש בכלי גדול יותר מלא ב -500 מיליליטר מים מזוקקים ומחממים את המאגר עד לרתיחה. לאחר מכן העבירו את השקופיות למגש.

ודא שהם מכוסים לחלוטין במאגר במיקרוגל. מחממים את השקופיות במאגר למשך כ -20 שניות עד שהמאגר מגיע לרתיחה. אל תתנו למאגר לרתוח.

לאחר מכן מצננים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות וחוזרים על מחזור החימום שש פעמים נוספות. זה קריטי לקבוע באופן אמפירי את מספר ומשך מחזורי האכילה לצורך שחזור שלב חשיפת המסכה. תנור המיקרוגל, המגש, המיכל, נפח המאגר במגש.

יש לשמור על נפח המים במיכל זהה בסיום החימום. העבירו את השקופיות בשני XSSC למשך חמש דקות מתחת למכסה אדים, דגרו את השקופיות בתמיסה של שלוש עד אחת עד ארבע של מתנול, חומצה אצטית ו-PBS למשך 15 דקות. לאחר מכן דגרו את השקופיות בתערובת מתנול טרי של שלושה עד אחד לחומצה אצטית למשך 15 דקות.

כעת ייבשו את החלקים באמצעות דגירה רצופה של 10 דקות באתנול 70%, ולאחר מכן שתי דגירות של 10 דקות באתנול טהור. הניחו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להכין אותן לבדיקה. מרחו 80 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה על החלקים המיובשים בצורה טיפתית וכסו אותם בהחלקת כיסוי.

בדוק שתמיסת הבדיקה מתפשטת על פני כל שטח החלקת הכיסוי ושאין בועות. לאחר מכן אטמו את החלקת הכיסוי במלט גומי ותנו לו להתייבש. המשך עם דנטורציה על ידי דגירה של המגלשות ב 80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן העבירו במהירות את השקופיות על מגש מתכתי על קרח למשך חמש דקות. המשיכו עם הכלאה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת. הסר את מלט הגומי בעזרת מלקחיים עם המגלשות על גוש חום של 37 מעלות צלזיוס.

הסר את החלקת הכיסוי בעדינות עם קצה להב אזמל. לאחר מכן, שטפו את החלקים שוב ושוב עם SSC. כעת, צבעו את הדגימות למשך 10 דקות עם הצבע המתאים כמו DAPI או ווים 3 3 3 4 2 ב-0.5 מיקרוגרם למיליליטר ב-XPBS אחד.

לאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם XPBS אחד למשך 10 דקות לכל כביסה. לאחר הכביסה השלישית, מסננים כמה שיותר נוזלים מהמגלשה. לאחר מכן בסוף כל שקופית, יש למרוח 80 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם חומר נגד דהייה.

מכסים לאט את המדיום בהחלקת כיסוי באיכות אופטית גבוהה, והימנעות מהיווצרות בועות. לאחר מכן אטמו את השקופית עם לק ואחסנו אותה בחושך בארבע מעלות צלזיוס. בפיתוח פרוטוקול זה, נבדקו מספר חוצצי מלח לחשיפת המסכה.

בעוד שמאגרי EDTA נטו לפגוע ברקמה. נתרן ציטראט טריס, HCL ומים מזוקקים התאימו לזיהוי HSV אחד כדי לוודא שהפרוטוקול יעבוד עם בדיקות מסחריות. זיהוי גנום סמוי אחד של HSV בוצע באמצעות בדיקה ביוטינילית אחת של PAN HSV שהתקבלה מ-Enzo Biochem, ניתן היה לזהות דפוסי נקודה בודדת ומרובה עבור גנום HSV אחד.

יתר על כן, פרוטוקול דגי ה-DNA נבדק על עכברים וארנבים שנדבקו בשלושה זנים נפוצים של HSV. בכל המקרים, הגנום של HSV one הראה אות נקודתי עם בהירות ועוצמה משתנים. בנוסף, תחולת הפרוטוקול נבדקה במחזור השכפול של HSV על ידי ביצוע דגי DNA על רקמות של עכברים שעברו זיהום הרפס כללי.

בבעלי חיים אלה זוהו אגרגטים גדולים ובהירים של גנום HSV one ברקמות שונות, כולל העיניים והמוח של DRG. פרוטוקול דגי הדנ"א הוא רב תכליתי. זה מאפשר זיהוי משותף של גנום HSV אחד ו-RNA וחלבונים נגיפיים או תאיים.

לדוגמה, זיהוי משותף של גנום HSV אחד יחד עם HSV 1 lat RNA אפשרי הוא זיהוי משותף של גנום HSV אחד עם חלבונים תאיים כגון חלבון Centro MERIC CE NPA A שימש זיהוי משותף של HSV אחד עם הגופים הגרעיניים כרומטין ו-PML. חלבון מקושר A TRX הודגם עם כתם משולש המראה HSV 1D NA באדום. תוצר ה-RNA שלה בצבע כחול ו-TRX בירוק.

לאחר הגדרת חשיפת המסכה, הליך דג ה-DNA חזק מאוד. ניתן לעשות זאת תוך פחות מ-24 שעות בקבוצות של 20 שקופיות ומעלה. פיתוח טכניקה זו יאפשר לחוקרים החוקרים נגיפי הרפס ווירוסים מתמידים אחרים לחקור ברמת התא הבודד, כיצד רכיבים תאיים וארכיטקטורה גרעינית יכולים להשפיע על הביולוגיה של נגיפים אלה.