ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניסוי מיקרו-מערך מיקרו-RNA. זה מושג על ידי רכישת שקופיות מיקרו-מערך מודפסות המכילות ספרייה של בדיקות מיקרו RNA והכנת דגימות RNA באיכות ובכמות מתאימות. לאחר מכן, דגימת ה-RNA ודגימת ה-DNA המבוקרת מסומנות בצבעים פלואורסצנטיים.

לאחר מכן מתווספות חומצות הגרעין המסומנות לשקופית מיקרו-מערך לצורך הכלאה. לבסוף, שקופית המיקרו-מערך נשטפת ונסרקת והמגלשה מתחדשת. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הביטוי הרחב של הגנום של מיקרו-רנ"א באמצעות ניתוח השקופית לעוצמות ההכלאה של בדיקות המיקרו RNA הבודדות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ביטוי הגנים, כגון כיצד תנאים פיזיולוגיים נורמליים או תנאים פתולוגיים דיפרנציאליים משפיעים על צרכי המיקרו של הביטוי בקנה מידה עולמי. איכות ייצור המיקרו-מערך היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחת ניסוי מיקרו-מערך. לאחר בידוד RNA בשיטה המשמרת RNA קטן והחייאה אותו בריכוז השווה או גדול משני מיליגרם למיליליטר, סמן את ה-RNA בנפח תגובה של 20 מיקרוליטר על ידי ערבוב תחילה של כ-25 מיקרוגרם של RNA כולל עם 0.5 מיקרוגרם של חמישה ראשוניים P-C-U-D-Y 5 4 7 3 ראשוניים במאגר X HEPs אחד בתוספת T ארבעה RNA Ligase 1D TT, ו-TP. אם יש פחות RNA זמין, הקטינו את כמות ה-RNA ואת התגובה.

אם ה-RNA מדולל מאוד, הוסיפו נשא כמו שמרים, TRNA כדי לעזור במשקעים, דגרו את התגובה על קרח בתוך מקרר למשך שעתיים עד 24 שעות. לאחר מכן, הוסיפו נתרן אצטט ל-0.3 טוחנת, ולאחר מכן שלושה נפחים של אתנול וזרזו את ה-RNA למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להשתמש בשקופיות בפעם הראשונה, הכלאה מראש שלהן בתמיסה מסוננת של שלושה XSSC, 0.1% SDS ו-0.2%BSA למשך 30 עד 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, טבלו את המגלשות במים כמה פעמים. לאחר מכן באיזופרופנול, יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה עם מתאם שקופיות ב 100 פעמים G למשך חמש דקות ב -22 מעלות צלזיוס. שוטפים את רצועות ההרמה במים.

לאחר מכן באתנול לפני הייבוש באוויר, הנח מגלשה בתוך בסיס תא הכלאה של מיקרו-מערך והחלקה של מרים על גבי המגלשה כך שהחלקת המרים תכסה את אזור הבדיקה ואת הרצועות הלבנות שלה. צור קשר עם המגלשה בחושך, סובב את ה-RNA המשקע המסומן, שטוף אותו פעם אחת עם אתנול 70% וייבש את הגלולה באוויר. הגלולה צריכה להיות בצבע אדמדם.

הכן תמיסת הכלאה באמצעות נפח 15 עד 100 בנפח של ה-DNA הייחוס המסומן המטוהר לכל דגימת RNA ממיסים את גלולת ה-RNA לחלוטין עם כ-60 מיקרוליטר מתמיסת ההכלאה כדי להבטיח שתמיסת ההכלאה לא תתייבש. במהלך הדגירה מוסיפים 20 מיקרוליטר מים לכל אחת מבארות הלחות. בבסיס תא ההכלאה של מיקרו-מערך.

הוסף תערובת של RNA מסומן ו-DNA התייחסות לשקופית. בעזרת קצה פיפטה דק, גע בעדינות בקצה החלקה של המרים ודרך היניקה. אפשר לתמיסה להיכנס לרווח שבין החלקה להחלקה.

הנח את מכסה תא ההכלאה מעל הבסיס. ואז אטום את החדר בעזרת קליפסים מתכתיים. הכניסו את כל החדר לשקית הניילון שמגיעה עם קלטת החדר.

לבסוף, הניחו את קלטת החדר בתוך מיכל עם מגבת נייר רטובה. לאחר מכן מכסים את המיכל בניילון נצמד ומניחים אותו בתוך חממת תרבית תאים לחה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ- 24 שעות. כדי לעבד את השקופיות לאחר הכלאה, יש לפרק את קלטות התא בזו אחר זו ולהטביע מגלשה, והמרים שלה מחליק בשני XSSC ב-22 מעלות צלזיוס.

החלקת המרים תיפול באופן טבעי מהמגלשה, תשטוף את המגלשות ב-0.8 XSSC פעמיים, ואז שלוש פעמים ב-0.4 XSSC למשך דקה עד שתיים בסך הכל. יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה עם מתאם שקופיות. לאחר מכן, סרוק את השקופיות עם סורק מיקרו-מערך והשתמש בתוכנית כגון נתיך כחול כדי לכמת את העוצמות בקבצי התמונה.

בדוק כתמים בודדים כדי לא לכלול כתמים חריגים הנובעים בדרך כלל מהדפסת שקופיות נקבוביות או טיפול בשקופיות לאחר הכלאה. לניתוח נתונים והצגתם, השתמש בתוכנות כגון קפיצת גנים ואקסל כדי לעשות שימוש חוזר במיקרו-מערך. הפשיטו את השקופית על ידי שטיפתה במים, ולאחר מכן טבילה אותה בכלי מכתים של NAOH מילימולרית ו-0.1 XSSC בטמפרטורה של 62 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 20 דקות.

חזור על הדגירה בפעם השנייה. שטפו את המגלשות מספר פעמים במים עד 60 דקות עם ניעור עדין בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה ואחסן 22 מעלות צלזיוס.

ניתן להשתמש במגלשות ללא הכלאה מוקדמת. איור זה מציג תמונה סרוקה של מיקרו-מערך המדגים אותות הכלאה מדויקים וחזקים מאוד. כתמים אדומים נבעו מהכלאה של הכתמים הירוקים של ה-DNA הייחוס מדגימת ה-RNA המסומנת DY 5 47, והכתמים הצהובים היו מהכלאה של ה-DNA וה-RNA לאותן בדיקות.

מקדמי המתאם של פירסון בין שכפולים טכניים של הכלאה של מיקרו-מערך הם כ-0.99, מה שמעיד על יכולת שחזור מצוינת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסוי מיקרו-קרניים מותאם אישית, לא רק לכימות מיקרונאז, אלא גם לכימות סוגים אחרים של חומצות גרעין כגון mRNAs.