Name: ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למד לבצע ניסויים אישית של microRNA microarray לניתוח ביטוי גנים ברמה גנומית. השיטה כוללת בידוד RNA, סימון בצבעים פלואורסצנטיים, היברידיזציה וניתוח אותות לזיהוי פרופילי microRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים מרכז (P50 התובע 011,806) ו צבא ארצות הברית מחלקת ההגנה (W81XWH-07-1-0183).

1. הדפסה של microarrays מירנה אישית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את השקופיות microarray באמצעות מתקן הגרעין שירותי microarray באוניברסיטה או חברה. איכות ייצור microarray היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחה של הניסוי microarray. נסו כמה שירותים במידת האפשר. באופן אידיאלי, אפשר היה להדפיס שקופיות 5-10 בכל פעם, ואת כל השקופיות ייראה זהה, עם כתמים בודדים מופרדים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תמיכה microarray, אנו משתמשים פערים שקופיות השנייה מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקות מירנה, אנו משתמשים NCode Multi-Species מירנה microarray בדיקה קבע V2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את כל oligonucleotides ב 3 x SSC ב 10 מיקרומטר ו quadruply להדפיס אותם על השקופיות. תקן את השקופיות על ידי הקרנה אולטרה סגולה על פי הוראות השקופיות II GAAPS. לייבל השקופית באמצעות עט יהלום לסמן את האזור לצד בדיקות מודפס. חנות ב 22 ° C. </li></ol> 2. לדוגמה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שיטהאו מגיב יכול לשמש כדי לבודד RNA, כל עוד היא שומרת RNA קטנים. אנו משתמשים בדרך כלל Trizol (Invitrogen) כדי לחלץ RNA בסך הכל, עם כמות איכות משביעת רצון של ההכנות RNA, כפי שנמדד על ידי 260nm ו 280nm קריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור RNA תיוג, לערבב ~ 25 מיקרוגרם של רנ"א מוחלטת עם 0.5 מיקרוגרם של 5'-PCU-DY547-3 "6 במאגר x 1 (50 HEPES מ"מ, pH 7.8, 20 מ"מ MgCl 2, 10 מיקרוגרם / מ"ל BSA, 10% DMSO) המכיל ~ 20 יחידות T4-RNA האנזים 1, בתוספת ~ 10 mM DTT ו ~ 0.02-0.03 נפח הסופי של 10 x T4 חיץ RNA האנזים 1 עבור ה-ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תיוג להמשיך על הקרח בתוך המקרר במשך 2-24 שעות. המשקע RNA עם אצטט 0.3 M נתרן 3 כרכים של אתנול. עבור קשירת משקעים יעיל, לפזר RNA סך של מעל 2 מ"ג / מ"ל, ולשמור את נפח קשירת הכולל ב μl 20 ~. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RNA פחות זמין, כמות קלט 5'-RNA ו-PCU DY547-3 "יכול להיות scaled למטה. &lt;/ Li&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RNA הוא מאוד דליל, להוסיף המוביל כגון tRNA שמרים לסייע משקעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב ו התווית מיקרוגרם 1 סך של DNA oligonucleotides התייחסות המקביל משנה של miRNAs יונקים באמצעות Ulysis אלקסה פלואוריד 647 חומצות גרעין תיוג קיט 6 כביקורת על תהליך ההכלאה. לטהר את ה-DNA מסומן באמצעות טור CentriSep ולשמור בחושך ב -20 ° C. </li></ol> 3. Microarray הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש שקופיות בפעם הראשונה, לפני להכליא את השקופיות בפתרון מסונן של 3 x SSC, 0.1% SDS, BSA 0.2% במשך 30-60 דק 'ב 37 ° C. להטביע אותם במים כמה פעמים, אז isopropanol. יבש את השקופיות בעזרת צנטריפוגה עם מתאם שקופיות ב 100 גרם במשך 5 דק 'ב 22 ° C. </li></ol> הערה: אנו משתמשים בתאי קורנינג microarray הכלאה ו mSeries אירי של המדעית של Lifterslips לבצע הכלאה microarray. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את lifterslips במים, אז אתנול, לפני ייבוש באוויר. המקום שקופיות בתוך בסיס קאמרית הכלאה microarray, וכן lifterslip על גבי השקופית. Lifterslip יכסה את אזור הבדיקה, עם רצועות לבן שלה לפנות את השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחושך, ספין למטה זירז, רנ"א מסומן. לשטוף את זה פעם אחת עם 70% אתנול, ו אוויר יבש גלולה. גלולה צריך להיות אדמדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הכלאה המכיל 400 mM Na 2 HPO 4 pH 7.0, 0.8% BSA, 5% SDS, לפוראמיד 12% עם 6 μl 1/15-1/100 של מטוהרים, שכותרתו התייחסות DNA (2.4) לדגימה RNA. כמות ה-DNA התייחסות הוסיף תלוי כמה oligonucleotides שונים מסומנים (2.4). אם יש מעל 100, אז דילול פחות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה RNA היטב עם μl 60 ~ הפתרון הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מים לכל אחד בארות humidifying על בסיס microarray קורנינג קאמרית הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף tהוא תערובת של RNA ו-DNA שכותרתו הפניה לשקופית. השתמש טיפ pipet דק, לגעת בעדינות את קצה lifterslip, ולאפשר פתרון להיכנס רווח בין lifterslip והחלק דרך יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכסה תא הכלאה מעל לבסיס, ואז לאטום את החדר עם קליפים מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החדר כולו בתוך שקית הפלסטיק שמגיע עם קלטת הקאמרית של קורנינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קלטת קאמרית (ים) בתוך מכולה עם מגבת נייר הרטובות; לכסות את המיכל בניילון נצמד ומניחים אותו בתוך 37 ° C לחות, תא תרבות חממה ~ 24 שעות. אלו אמצעי זהירות (3.6, 3.9, 3.10) להבטיח כי הפתרון הכלאה לא להתייבש במהלך הדגירה. </li></ol> 4. פוסט הכלאה עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את קלטות תא אחד אחד. שקופית לצלול lifterslip שלה 2 x SSC ב 22 ° C. Lifterslip באופן טבעי ליפול השקופיות. המקום בו 0.8 x SSC. לשטוףאת השקופיות ב 0.8 x SSC פעמיים, ואז שלוש פעמים 0.4 x SSC, 1-2 דקות בסך הכל. יבש את השקופיות בעזרת צנטריפוגה עם מתאם שקופיות. שטפו את lifterslips במים ולשמור לשימוש חוזר מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את השקופיות עם סורק כל מתאים, למשל, פרקין אלמר ScanArray 5000 או מולקולרית התקנים אקסון GenePix סורק 4000B microarray. סריקה באורכי גל קרובים 547 ננומטר 647 ננומטר כדי להשיג את קבצי התמונה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש תוכניות כגון BlueFuse לכמת בעוצמות פיקסל קלט, קבצי תמונה מ 4.2). בדוק מקומות מסוימים עם התוכנית להוציא נקודות חריגות על microarrays מתוך שיקול נוסף. אלה כתמים נורמלי בדרך כלל נובעים הדפסה מחליקים מחליקים עניים או טיפול לאחר ההכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש תוכניות כגון GeneSpring ו-Excel לניתוח נתונים והצגה. שיקולים כלליים לנורמליזציה נתוני microarray חלים, המהווה מעבר להיקף של מאמר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אותות משביע רצון מתקבלים after 4.3), רצועת שקופיות microarray לשימוש חוזר 7. יש לשטוף את השקופיות במים, לטבול אז מראש חימם, 1 mM NaOH ו 0.1 x SSC בצלחת מכתים ב 62 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות. חזור על דגירה פעם אחת. לשטוף את השקופיות כמה פעמים במים עד 60 דקות עם רעד עדין על 22 ° C. יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגות, ולאחסן על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש מחדש בשקופיות, אין צורך לאשר מראש את להכליא אותם שוב. פשוט לשטוף אותם במים ואחריו isopropanol, ויבש השקופיות ממש לפני ההכלאה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: יש לנו בעיקר בעקבות ההליכים המתוארים לפרופיל ביטוי מירנה העולמי אלפי דגימות, כלומר RNAs מבודד דג הזברה כדי הדגימה האדם בתנאים שונים. איור 1 מציג תמונה סרוקה של microarray להפגין אותות הכלאה מדויקת מאוד חזק על שקופית. פירסון correlatiעל מקדמי בין טכני משכפל של הכלאה microarray הם ~ 0.99 7, המציין reproducibility מעולה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 תמונה Composite של שקופיות microarray סרוקים מירנה לאחר ההכלאה. כתמים אדומים נבעה הכלאות על ידי ה-DNA התייחסות, כתמים ירוקים מן המדגם RNA DY547 שכותרתו, בעוד כתמים צהובים היו הכלאות על ידי ה-DNA ו-RNA הן על בדיקות זהה.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li>
<li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li>
<li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe%3Aslide+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li>
<li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs%3A+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות ההתקדמות עמוק טכנולוגיות רצף, microarray נשאר בחירה מעשית עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA ו-RNA. בהשוואה רצף עמוק, ניסויים microarray זולים, וכן מעבדה לביולוגיה מולקולרית טיפוסי יכול לבצע את רוב הניסויים ניתוח נתונים בתוך הבית, אשר מאפשר גמישות חוסך זמן. בעתיד, סביר להניח microarrays היטב המותאם באופן אינטנסיבי לחקור קבוצות הגנים, למשל, או כל קבוצת משנה של גורמי תעתוק בגנום או miRNAs, ואת אותם עקרונות ונהלים שהוצגו כאן ניתן להשתמש בניסויים microarray מנהג ללמוד הגן משפחות מלבד...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> פריטים </th><th> מוכר </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> NCode Multi-Species מירנה microarray בדיקה קבע V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> עיצוב המבוסס על miRBase שחרור 9.0 (אוקטובר 2006). הוא מכיל ~ 1140 ללא שינוי, 34-44 oligonucleotides nt עוד בדיקות עבור להטיס תולעת, דג הזברה, עכבר, חולדה, ו miRNAs אדם, ומספר בדיקות בקרה פנימית כגון snoRNAs. בדיקות מירנה הן כפילויות של רצפי משלים miRNAs בוגרת, ומכאן גודל של ~ 44 NT. ניתוח אחד יכול להתמקד miRNAs מן הגנום מסוים (ים) של עניין. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> יש לנו גם השתמשו מועשר, חלק קטן RNA תיוג, למרות הכל דגימות רנ&quot;א הם מהירים יותר, קל יותר להכין לכמת מתאים ליישומים במורד כגון ניתוח ה-mRNA. </td></tr><tr><td> T4-RNA האנזים 1 </td><td> ניו אינגלנד Biolשרירי הבטן </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis אלקסה פלואוריד 647 ערכת גרעין תיוג חומצה </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> ערכה זו או מוצרים דומים ניתן להשתמש בתווית ניסיוני דגימות RNA או RNA השליטה (במקום ה-DNA שליטה) גם כן. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &quot; </td><td> Dharmacon </td><td> מותאמים ללקוח </td><td> חלק קטן RNA יכול להיות מתויג באופן דומה על ידי קשירת. </td></tr><tr><td> CentriSep עמודות </td><td> פרינסטון הפרדות </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII מצופה שקופיות </td><td> קורנינג </td><td> 40004 </td><td> סוגים אחרים של שקופיות ניתן להשתמש גם. </td></tr><tr><td> Microarray לתאי הכלאה </td><td> קורנינג </td><td> 2551 או 40080 </td><td> סוגים אחרים של תאים הכלאה ו coverslips צריך גם לעבוד. באמצעות מכונות הכלאה זמינים מסחרית יכולה להפחית באופן משמעותי את זמן הכלאה, למשל, ל ~ 2 שעות. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ה &#39;ermo / אירי מדעי </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ביצוע ניסויים אישית microarray microrna

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

רנ&quot;א (miRNAs) הם משפחה גדולה של ~ 22 נוקלאוטידים (NT) זמן מולקולות RNA אשר באים לידי ביטוי נרחב אאוקריוטים 1. הגנום מורכב לקודד לפחות מאות miRNAs, אשר בראש ובראשונה לדכא את הביטוי של מספר רב של גני מטרה שלאחר transcriptionally 2, 3. miRNAs לשלוט במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1. בנוסף, הביטוי מירנה שינה נמצא קשור מחלות אנושיות, כגון סרטן, ואת miRNAs עשוי לשמש סמנים למחלות הפרוגנוזה 4, 5. חשוב, אפוא, להבין את הביטוי פונקציות של miRNAs בתנאים שונים. שלוש הגישות העיקריות היו מועסקים לביטוי פרופיל מירנה: PCR בזמן אמת, microarray, וסדר עמוק. הטכניקה של microarray מירנה יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה, בדרך כלל פחות יקר, ורוב הפעולות הניסוי וניתוח ניתן קארied החוצה במעבדה לביולוגיה מולקולרית במרבית האוניברסיטאות, בתי ספר לרפואה ובתי חולים הקשורים. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע אישית microarray ניסויים מירנה. מערכת בדיקה מירנה יודפסו על שקופיות זכוכית כדי לייצר microarrays מירנה. רנ&quot;א הוא מבודד באמצעות שיטה או מגיב ששומרת קטן מינים RNA, שכותרתו אז עם צבע פלואורסצנטי. כמו שליטה, DNA התייחסות oligonucleotides המקביל משנה של miRNAs מסומנים גם עם צבע פלואורסצנטי שונים. ה-DNA התייחסות ישמש כדי להדגים את האיכות של השקופית ואת ההכלאה ואת ישמש גם לנורמליזציה נתונים. רנ&quot;א ודנ&quot;א הם מעורבים הכלאה לשקופית המכילה microarray בדיקות עבור רוב miRNAs במסד הנתונים. לאחר הכביסה, להחליק את נסרק להשיג תמונות, בעוצמות של מקומות מסוימים לכימות. אותות אלה הגלם יעובדו נוסף ניתח את הנתונים ביטוי miRNAs המקביל. Microaמגלשות rray ניתן הפשיטו מחדש כדי להפחית את העלות של microarrays כדי לשפר את העקביות של ניסויים microarray. אותם עקרונות ונהלים החלות על סוגים אחרים של ניסויים microarray אישית.

הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.

ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

miRNAs (מיקרו-RNA) הם משפחה גדולה של מולקולות RNA באורך של כ-22 נוקלאוטידים (nt), המבטאות באופן נרחב באוקריוטים 1. גנומים מורכבים מקודדים ל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ביצוע ניסוי של מערך זעיר (microarray) עבור micro RNA. מטרה זו מושגת תחילה על ידי רכישת שקופיות של מערך זעיר מודפס המכילות ספרייה של גששים (probes) ל-micro RNA, והכנת דגימות RNA באיכות ובכמות מתאימות. לאחר מכן, ה-RNA ודגימת DNA של ביקורת מסומנים בצבעים פלואורסצנטיים.לאחר מכן, מוסיפים את חומצות הגרעין המסומנות לפלטת מיקרו-מערך (microarray) לצורך היברידיזציה. לבסוף, שוטפים וסורקים את פלטת המיקרו-מערך ולאחר מכן מחדשים אותה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הביטוי של microRNAs ברחבי הגנום, באמצעות ניתוח של עצימות ההיברידיזציה של הגששים (probes) האישיים לכל microRNA על גבי הפלטה.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ביטוי הגנים, כגון השאלה כיצד תנאים פיזיולוגיים נורמליים או מצבים פתולוגיים משפיעים באופן דיפרנציאלי על דרישות הביטוי במיקרו-מערכים בקנה מידה גלובלי. איכות ייצור המיקרו-מערך היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחת ניסוי במיקרו-מערך. לאחר בידוד RNA בשיטה המשמרת RNA קטן ותליתו בריכוז השווה או הגבוה מ-2 mg/mL, סמנו את ה-RNA בנפח תגובה של 20 µL על ידי ערבוב של כ-25 µg של RNA כולל עם 0.5 µg של 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' בבופר 1X HEPs בתוספת T4 RNA Ligase 1D TT ו-ATP. אם זמין פחות RNA, הפחיתו את כמות ה-RNA ואת היקף התגובה.אם ה-RNA דלול מאוד, יש להוסיף נשא כגון שמרים או TRNA כדי לסייע בשקיעה, ולהדגיר את התגובה על קרח בתוך מקרר למשך שעתיים עד 24 שעות. לאחר מכן, יש להוסיף נתרקה אצטט לריכוז של 0.3 M, ולאחר מכן שלושה נפחים של אתנול ולהשקיע את ה-RNA למשך לילה בטמפרטורה של 20- °C. בשימוש ראשון בעגילות, יש לבצע היברידיזציה מוקדמת (pre hybridize) בתמיסה מסוננת של 3X SSC, 0.1% SDS ו-0.2% BSA למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C.בשלב הבא, טבול את השקופיות במים מספר פעמים. לאחר מכן, טבול אותן באיסופרופנול, ייבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה עם מתאם לשקופיות ב-100 $\times$g למשך חמש דקות ב-22 °C. שטוף את פסי ההרמה במים.לאחר מכן, בתוך אתנול ולפני ייבוש באוויר, הנח שקופית בתוך בסיס של תא היברידיזציה של מיקרו-מערך (microarray) וסליפ הרמה (lifter slip) מעל השקופית, כך שסליפ ההרמה יכסה את אזור הגששים ואת הפסים הלבנים שלו. השקה את השקופית בחושך, סבב למטה (spin down) את ה-RNA המסומן ששקע, שטוף אותו פעם אחת ב-70% ethanol ויבש את המשקע באוויר. המשקע צריך להיות בעל צבע אדמדם.הכינו תמיסת היברידיזציה באמצעות שימוש בנפח של 1/15 עד 1/100 מה-DNA של רצף הייחוס המסומן והמטוהיר עבור כל דגימת RNA. המיסו את משקע ה-RNA לחלוטין עם כ-60 microliters של תמיסת ההיברידיזציה כדי להבטיח שתמיסת ההיברידיזציה לא תתייבש. במהלך הדגירה, הוסיפו 20 microliters של מים לכל אחת מבארות הלחות בבסיס תא ההיברידיזציה של המערך (microarray).הוסיפו תערובת של RNA מסומן ו-DNA ייחוס לשקף. בעזרת קצה של פיפטה דקה, געו בעדינות בקצה של שקף ההרמה (lifter slip) ובאמצעות יניקה, אפשרו לתמיסה להיכנס לחלל שבין שקף ההרמה לשקף.מקמו את כיסוי תא ההיברידיזציה על הבסיס. לאחר מכן, אטמו את התא באמצעות תפסים ממתכת. הכניסו את התא כולו לתוך השקית הפלסטית המגיעה עם קסטת התא.לבסוף, הניחו את קסטת התא בתוך מיכל עם נייר סופג רטוב. לאחר מכן, כסו את המיכל בניילון נפה והכניסו אותו למדגרה לתרביות תאים לחה בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-24 שעות. כדי לעבד את השקופיות לאחר ההיברידיזציה, פרקו את קסטות התא אחת אחת ושקעו שקופית, יחד עם זכוכית ההרמה שלה, בתוך 2X SSC בטמפרטורה של 22 °C.פס ה-lifter יסתלק באופן טבעי מהשקופית; שטפו את השקופיות פעמיים ב-0.8 XSSC, ולאחר מכן שלוש פעמים ב-0.4 XSSC, למשך זמן כולל של דקה עד שתיים. ייבשו את השקופיות באמצעות צנטריפוגה עם מתאם לשקופיות. לאחר מכן, סרקו את השקופיות בעזרת סורק מיקרו-מערכים (microarray scanner) והשתמשו בתוכנה כגון blue fuse כדי לכמת את העוצמות בקבצי התמונה.יש לבחון את הנקודות הבודדות כדי להחריג נקודות חריגות, שנובעות בדרך כלל מהדפסת שקופיות נקבוביות או מטיפול בשקופיות לאחר ההibrדיזציה. לצורך ניתוח והצגת נתונים, השתמשו בתוכנות כגון gene springing ו-excel כדי להשתמש במערך המיקרוניซק (microarray) שוב. הסירו את החומר מהשקופית על ידי שטיפתה במים, ולאחר מכן טבילה בכלי צביעה המכיל 1 mM NaOH ו-0.1 XSSC שחוממו מראש ל-62 °C למשך 10 עד 20 דקות.חזור על הדגירה פעם שנייה. שטוף את השקופיות מספר פעמים במים למשך עד 60 דקות עם ניעור עדין ב-22 degrees Celsius. ייבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה ואחסן ב-22 degrees Celsius.ניתן להשתמש בשקופיות ללא היברידיזציה מקדימה. איור זה מציג תמונה סרוקה של מערך מיקרו (microarray) המדגימה אותי היברידיזציה חזקים ומדויקים מאוד. נקודות אדומות נבעו מהיברידיזציה של ה-DNA הייחוס, נקודות ירוקות נבעו מדגימת RNA המסומנת ב-DY 5 47, והנקודות הצהובות נבעו מהיברידיזציה של ה-DNA וה-RNA גם יחד לאותם פרובים.מקדמי המתאם של פירסון בין שיכורים טכניים של היברידיזציית מיקרומערך הם כ-0.99, דבר המעיד על הדירות מצוינת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ניסוי מיקרומערך מותאם אישית, לא רק לצורך כימות של micronase, אלא גם לצורך כימות של סוגים אחרים של חומצות גרעין, כגון mRNAs.

performing-custom-microrna-microarray-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

סרטון זה מתאר את הטכניקה לחקר ביטוי החלבונים בתאי סרטן ריאה נגועים ב-miRNA באמצעות מיקרו-מערך נוגדנים למדידת ביטוי גנים ספציפיים. בפרוטוקול המוצג, אנו מבצעים מיקרו-מערך נוגדנים לזיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורי בעצירת מחזור התא ואנגיוגנזה.

מיקרו-מערך נוגדנים: טכניקה לחקר ביטוי החלבונים של תאי סרטן ריאה שטופלו ב-miRNA

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט אימצה את BioMILD הקרנת ניסיון לביצוע המבדק המסווג במחזור של החתימה microRNA לגילוי מוקדם של סרטן ריאות.

MicroRNA מבוסס נוזלי ביופסיה: החוויה של miRNA פלזמה החתימה מסווג (MSC) לסינון סרטן ריאות

כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

למד לבצע ניסויים אישית של microRNA microarray לניתוח ביטוי גנים ברמה גנומית. השיטה כוללת בידוד RNA, סימון בצבעים פלואורסצנטיים, היברידיזציה וניתוח אותות לזיהוי פרופילי microRNA.

ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

גלה סרטונים נוספים