ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

הליך זה מאפשר לנטר את מוות תאי הגליה של אוליגו DDR בזמן אמת. זה מושג תחילה על ידי תרבית התאים, ואז התאים מוכנים להדמיית תאים חיים. השלב הבא הוא מתן טיפול לתאים ומעקב אחר ההשפעות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השלב האחרון הוא ביצוע ניתוח נתונים. בסופו של דבר, התוצאות מראות שיעורי מוות של תאים באוכלוסיית תאים לאחר טיפול או גירוי על ידי ניטור פלואורסצנטיות גרעינית מצבע פלורו המופעל על ידי קספאז. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו צביעה חיסונית, הוא היכולת לאסוף מספר נקודות זמן בו זמנית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון תגובות לטיפולים פרמקולוגיים, ריאגנטים וטיפולים שונים. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מוות בתוך תרביות תאים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון ex vivo, רקמות אורגנוטיפיות, כולל פרוסות מוח.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו להסתגל לעבודה עם רקמה חיה ולא רקמה קבועה. הדגמה חזותית של טכניקה זו חשובה מכיוון שיש הרבה שלבים להכנת דגימות תאים חיים בהשוואה לרקמה קבועה. ראשית, הפשרה קפואה של תאי גליה N 19 oligo droog באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מפשירים אותם.

הוסף שבעה מיליליטר של גלוקוז גבוה DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין לצלחת תרבית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן הוסף את תרחיף התאים טיפה לצלחת וערבב בעדינות את צלחת הפטרי כדי לפזר את התאים באופן שווה. תרבו את התאים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני של 5 סנט למשך ארבע שעות לאחר ארבע שעות.

שאפו את המדיה מהצלחות כדי להסיר את כל ה-DMSO שנותר. קריופרוטקנט. החלף בשבעה מיליליטר של מדיה טרייה לאחר ארבעה עד שבעה ימים של צמיחה. כאשר התאים הגיעו ל-70 עד 80% מפגש שואבים את המדיה ומזרימים מיליליטר אחד של טפטפות פנימה על יריעת התא, בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן קצרו את התאים הזרע הבא, צלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר עם התאים שנקטפו בצפיפות של 0.1 כפול 10 לששת התאים למיליליטר, והניחו את המנה הזו בחממת תרבית הרקמה. לאחר עיסוי אחד נוסף, ניתן לצפות את התאים לניסויי הדמיה של תאים חיים. לשם כך, קצרו את התאים כמו קודם, ואז הסירו 30 מיקרוליטר מתרחיף התאים וספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח החלקות כיסוי זכוכית לא מצופות. בבארות של צלחת שש בארות הוסף תאים לבאר בצפיפות של 0.1 כפול 10 לששת התאים למיליליטר. בשני מיליליטר של DMEM נטול פנולים, סוכר גבוה בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין סטרפטומיצין מאפשרים לתאים לגדול בן לילה ב-34 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לפני הטרנספקציה.

למחרת, שלב 100 מיקרוליטר של מדיה חופשית בסרום 0.5 עד ארבעה מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר, DNA וארבעה מיקרוליטרים של גן FU hd. מערבל בעדינות את התערובת פעמיים ולאחר מכן אפשר ל- DNA להתרכב בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר שחלף זמן הדגירה, הוסף תערובת DNA HD של גן FU ישירות לתאים המתורבתים.

הטה את הצלחת בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן תרבית את התאים למשך 48 שעות נוספות בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לפני הטיפול או הניסוי. הפעל תחילה את תיבת הבקרה של מכשיר התא החי LCI Cham.

יש לעשות זאת שלוש שעות לפני תחילת הניסוי כדי להבטיח התחממות יסודית של השלב. לכל הפחות, יש להפעיל את תיבת הבקרה שעה לפני תחילת הניסוי. לאחר מכן, בעבודה במכסה המנוע, רססו את תא התרבות והמלקחיים מסוג מגנטי של LCI Cham עם 70% אתנול והניחו להם להתייבש במשך חמש דקות.

הוציאו את התאים מהאינקובטור ובדקו אותם במיקרוסקופ כדי לוודא שהם בריאים. התאים צריכים להופיע דוראנט ולהתפשט היטב על החלקת כיסוי הזכוכית עם תהליכי קרום רבים. תאים עם מספר מופחת של הרחבות תהליך או וגרעין בעל צורה לא סדירה ככל הנראה נלחצים מטרנספקציה ואינם מתאימים לניסויים נוספים הפועלים במכסה הזרימה.

הטה את צלחת שש הבארות והסר את החלקת הכיסוי בעזרת מלקחיים. הנח במהירות את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מעלה לתוך הצלחת התחתונה של החדר. אל תאפשר לכיסוי להחליק להתייבש.

לאחר מכן, חבר את הגוף הראשי המגנטי של תא התרבות והוסף 500 מיקרוליטר של מדיה מצלחת שש הבארות המקורית על החלק העליון של תלוש הכיסוי. שימוש חוזר במדיה מפחית את כמות הלחץ המופעל על התאים הנגרם על ידי שינויים סביבתיים ויכול להיות שימושי גם להערכת גורמים מופרשים חוץ-תאיים. לאחר הוספת המדיה, הנח את מכסה הזכוכית על תא התרבית והשתמש בצמת מגבונים של קים עם 70% כדי להסיר כל חומר שנותר שעלול להפריע למיקרוסקופיה מתחתית החלקה של המכסה.

הנח את תא התרבות בחממת 34 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. שלב זה יבטיח שהתא עצמו יחמם את 34 מעלות כדי להפחית את הזזת החלקת הכיסוי. ככל שהמתכת מתחממת, יש צורך לעבוד עם תאורת החדר הסביבתית נמוכה ככל האפשר במהלך השלבים הבאים.

ראשית, תורה הכינה בעבר אלקווה של נוף גרעיני בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שלף את תא התרבות מהחממה והניח אותו במהירות בתא הסביבתי של המיקרוסקופ. הפעל את מיכל הפחמן הדו חמצני המעורבב מראש של 5% עם ווסת כפול.

לאחר מכן, שימוש במטרה פי 10 כאשר מנורת המיקרוסקופ מוגדרת לסביבות 2.5 וולט וזמן החשיפה ל-240 אלפיות השנייה. התמקד באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להמחיש את התאים על צג המחשב. לאחר מכן הוסף לתאים ריכוז של 80 מילי-מולרי של יון אשלגן או משרה אפופטוזיס אחר באמצעות חילופי מדיה עם זלוף איטי ומקומי באמצעות משאבה פריסטלטית.

מצע ה-nuke view 4 88 יציב בתרבית תאים לניסויים הנמשכים עד 36 שעות. לכן, ניתן לערוך ניסויים לאורך פרק זמן זה. תחילה הגדר את המיקרוסקופ כדי להמחיש פלואורסצנטיות מחלבון פלואורסצנטי אדום וירוק.

לאחר מכן לחץ על הערוץ האדום כדי להציג את התאים שהוחלפו. בחר ושמור כ-12 פריימים שבהם יש מספר תאים שעברו טרנספטציה ושמור נקודות שלב XY אלה. בקש מהמיקרוסקופ לצלם תמונות בערוץ האדום של השדה הבהיר ובערוץ הירוק בנקודות הבמה השמורות הללו כל שש דקות.

לאחר איסוף מספר נקודות XY מניסויים כפולים או משולשים, אסוף את הנתונים מניסויים נפרדים שבוצעו בימים שונים ובצע ניתוח נתונים ובדיקות סטטיסטיות כמתואר בפרוטוקול הכתוב כדי להשוות את היחס בין התאים השליליים של מפרץ CASP לתאים החיוביים של מפרץ CASP. מצע Nuke view 4 88 יכול להצביע על שיעור מוגבר של אפופטוזיס של תרביות תאי גליה N 19 oligo DDR. לאחר טיפול עם ריכוז גבוה של אשלגן חוץ-תאי, תמונות הבסיס הללו נרכשו תוך שימוש במטרה של פי 10.

תאי N 19 עברו טרנספטציה עם RFP וטופלו בשלושה מיקרוליטרים גרעיני, 4 88 סובסטרט לתאי בקרה, או שלושה מיקרוליטרים גרעיני, 4 88 סובסטרט ו-80 מיליליר אשלגן. תמונות אלה ממחישות כי מספר התאים האפופטוטיים גדל עם הזמן, שלוש, שש ותשע שעות לאחר הטיפול באשלגן 80 מילי-מולרי בתנאי ביקורת, כמויות משמעותיות של אפופטוזיס לא נצפו בהשוואה לתרביות אשלגן 80 מילי-מולריות. האות הירוק שנצפה ברקע בתנאי הבקרה מצביע על התאים שעוברים אפופטוזיס ללא תוספת אשלגן חוץ-תאי.

קורס זמן של 12 שעות מתאים למחקרים הכוללים עלבונות נוירולוגיים לאחר 12 שעות, תרביות שטופלו באשלגן הראו כ-45% מוות תאים. כמעט אף אחד מהתאים בניסוי הביקורת לא מפגין אפופטוזיס בנקודת הזמן של 12 שעות. אם כי במצבים אחרים, הניסויים עשויים להידרש לרוץ זמן רב יותר.

גרף זה מראה את העלייה בשלושה תאים חיוביים של קספאז במהלך הזמן של הניסוי בן 12 השעות. לאחר שמציקים להם, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת וניתן לאסוף נתונים בן לילה אם עושים זאת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עקבי בין הטיפולים לאחר הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון צביעה חיסונית כדי להסתכל על חלבונים אחרים במורד הזרם המעורבים במסלולים שנחקרו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דוגמאות להדמיה. רכוש ערכת נתונים ונתח את הנתונים שלך.