הדמיה של הפעלת קספז במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

בתאי מערכת החיסון, קספאז-1, קספאז דלקתי, הוא מרכיב מרכזי המגיב למערכת החיסון וקיים בצורה לא פעילה. צורות לא פעילות אלו מורכבות מפרו-דומיין שהתמזג עם תחום קטליטי והופכות לפעילות באמצעות דימריזציה המושרה על ידי קרבה.

כדי לדמיין את הפעלת הקספאז in vivo, התחל בתרבית של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים שעברו טרנספטציה המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים אדומים וזוג חלבונים מדווחים על השלמה פלואורסצנטית. החלבונים המדווחים מכילים פרו-דומיין של קספאז-1 המאוחה עם מקטעים לא פלואורסצנטיים של חלבון ונוס, Venus-N או Venus-C.

טפל בתאים באמצעות מדיום הדמיה המכיל ליפופוליסכרידים - ממריץ דלקתי שמקורו בחיידקים, ואשלגן יונופורים - ניגריצין.

ליפופוליסכרידים מקיימים אינטראקציה עם קולטני זיהוי דפוסים על המקרופאגים, ומתחילים הרכבה של קומפלקס דלקתי.

מולקולות ניגריצין נכנסות לתא ונקשרות ליוני אשלגן, וגורמות לזרימתם לתווך החוץ-תאי ולהפחתת ריכוז יוני האשלגן התוך-תאי. זה מוביל להתחלה של חלבוני חיישן דלקתיים עם חלבוני מתאם - חלבון מגשר בין חלבון חיישן לפרוקספאז-1, היוצר את הקומפלקס.

הפרו-דומיינים המכילים שברי ונוס מקיימים אינטראקציה עם חלבוני המתאם של הקומפלקס. זה מביא את שני השברים בסמיכות, ומאלץ אותם להתחדש ולהאיר.

דמיין את התאים תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

התאים הטרנספטנטיים נראים אדומים עם כתמי פלואורסצנטיות ירוקים, המאשרים את הפעלת הקספאז.

קח מיקרו-צינור סטרילי של 1.5 מיליליטר לכל טרנספקציה, והוסף את הפלסמידים המתאימים של הדיווח והפלסמידים של Caspase-BiFC במכסה המנוע. הנח את תחנת הפיפטה, המכשיר, הקצוות, צינורות האלקטרופורציה והפיפטה במכסה זרימה למינרי סטרילי. חבר והפעל את מכשיר הגרעין.

הזן את פרמטרי ההעברה במסך ההפעלה המוצג. לחץ על כרךtagה, הזן 1,000 ולחץ על בוצע כדי להגדיר אותו ל-1000 וולט. לחץ על רוחב, הזן 40 ולחץ על סיום כדי להגדיר את הדופק ל-40 אלפיות השנייה. לבסוף, לחץ על # פולסים, הזן שניים ולחץ על בוצע כדי להגדיר את מספר הפולסים החשמליים ל-2.

קח את אחד מצינורות האלקטרופורציה ומלא אותו בשלושה מיליליטר של מאגר אלקטרוליטי E בטמפרטורת החדר. הכנס את צינור האלקטרופורציה למחזיק הפיפטה בתחנת הפיפטה, וודא שהאלקטרודה בצד הצינור פונה פנימה, ונשמע צליל נקישה בעת הכנסת הצינור.

קח את גלולת התא והוסף 10 מיקרוליטר של מאגר R מתלה מחדש מחומם מראש לכל 1 עד 2 פעמים 10 לתאים החמישיים, וערבב בעדינות עם מיקרופיפטה P20. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל צינור טרנספקציה, וערבב בעדינות עם מיקרופיפטה P20. הכנס קצה לתוך הפיפטה על ידי לחיצה על כפתור הלחיצה עד לעצירה השנייה, וודא שהמהדק מרים לחלוטין את גזע ההרכבה של הבוכנה בקצה.

לאחר מכן, לחץ על כפתור הלחיצה על הפיפטה עד לתחנה הראשונה, וטבל בצינור הראשון המכיל תערובת DNA של תאים או פלסמיד כדי לשאוב את הדגימה. הכנס את הפיפטה עם הדגימה בזהירות רבה לתוך מחזיק הפיפטה, וודא שהפיפטה לוחצת וממוקמת כראוי. לחץ על התחל במסך המגע והמתן עד להעברת הפולסים החשמליים.

לאט, הסר את הפיפטה מהתחנה, והוסף מיד את מתלה התאים המועבר לבאר המתאימה עם המדיום המחומם מראש ונטול האנטיביוטיקה על ידי לחיצה איטית על כפתור הלחיצה עד לתחנה הראשונה. נענעו בעדינות את הצלחת עם תאים שעברו טרנספטציה, ודגרו במשך שעה עד שלוש שעות באינקובטור תרבית רקמות לח. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית מחומם מראש לכל באר.

מניחים את המנה באינקובטור, ומאפשרים לפחות 24 שעות לביטוי גנים. למחרת, בדוק את כדאיות התא ויעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

הסר את המדיה מהתאים בזהירות בעזרת מיקרופיפטה P1000, והוסף 500 מיקרוליטר מתמיסת הגירוי בצד הבאר. כדי להפעיל בארות בקרה לא מטופלות, הוסף מדיום הדמיה ללא הגירוי.

כדי לדמיין את התאים באמצעות אפיפלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקלי, הפעילו את המיקרוסקופ ואת מקור האור הפלואורסצנטי, בהתאם להוראות היצרן. בחר את המטרה פי 10 או פי 20, והנח את צלחת התרבות על במת המיקרוסקופ.

מצא תאים מתחת למסנן 568 ננומטר עם העינית, והתמקד בתאים המבטאים את התאים האדומים המדווחים. ספרו את כל התאים האדומים בשדה הראייה. באותו שדה חזותי, שנה למסנני 488 או 512. ספור את מספר התאים האדומים שגם הם ירוקים. לספור לפחות 100 תאים אדומים מתוך שלושה שדות לפחות.