אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

פרוטוקול זה מותאם לעטיפת תאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים ולהבדיל אותם לנוירונים דופמינרגיים במערכת תלת מימדית. ראשית, טפל במושבות עם מעכב סלע או RI ושייך אותם לתאים בודדים עם אקואט מעורבב עם נתרן אלגינט ומועבר דרך מכשיר האנקפסולציה. המשך הטיפול ב-RI במשך שלושה ימים, העביר את התאים העטופים לשישה תאי PA והתמיין במשך 28 ימים.

בסופו של דבר, ניתוח ביטוי גנים וחלבונים מראה יעילות גבוהה יותר ביצירת נוירונים דופמינרגיים. היתרון העיקרי של טכניקה מסוימת זו על פני פרוטוקול ההתמיינות הדו-ממדי הקיים הוא שאנו מנסים להפיץ ולמיין תאים אלה בסביבת תלת מימד וסביבה תלת מימדית זו מספקת לך הזדמנות להפיץ תאים בצורה בצפיפות גבוהה. ואז זה גם נותן הזדמנות לאינטראקציה טובה יותר בין תאים להתמיינות.

ושלישית, גם נותן לך יעילות טובה יותר של בידול בהמשך המסלול. וגם, אם יורשה לי להוסיף שהטכניקה הספציפית הזו יכולה להיות מותאמת גם לסוגים אחרים של תאים, שאותם אנו יכולים להפיץ בסביבה תלת מימדית. עכשיו זכרו גם, למשל, הטכניקה הספציפית הזו עברה אופטימיזציה על בסיס שימוש במעכב סלע מסוים שמונע אפופטוזיס של התאים וגם מונע את ניתוק התא מכלי התרבית.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בהתחלה מכיוון שטכניקה זו אינה מבוצעת בדרך כלל בתרבית רקמות. טכניקת האנקפסולציה הבאה עברה אופטימיזציה בהתבסס על מחקרי הסיכום של ד"ר דין ד"ר צ'אד על יישום סוג מעכב R של אלגינט, ריכוז אלגינט והגדרות מכשיר אנקפסולציה. ג'יימי וקים, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו, ידגימו כעת את הפרוטוקול הזה.

הוסף 25 מיליליטר של תמיסת ג'לטין סטרילית של 0.1% ל-275 מיליגרם של נתרן אלגינט מטוהר במערבולת צינור סטרילית של 50 מיליליטר כדי להמיס חלקית את אבקת האלגינט. לאחר מכן הנח את הצינור על מערבל אורביטלי בטמפרטורה של 10 פעמים G למשך הלילה. לאחר מכן, הוסף 9% נתרן כלורי סטרילי לתמיסת האלגינט.

מערבולת למשך 30 שניות ואז צנטריפוגה ב-95 פעמים G למשך חמש דקות. אחסן את תמיסת האלגינט בארבע מעלות צלזיוס. תחילה בסביבה חשוכה, טפל בתאי גזע עובריים אנושיים עם מצע תרבית בתוספת 10 מיקרומולר של מעכב סלע.

דגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כעת שטפו את התאים פעמיים עם DPBS כדי לעקור את התאים באופן אנזימטי. מוסיפים אקוטן ודוגרים למשך 10 דקות.

בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, קצרו בעדינות את התאים בעזרת מגרד תאים והעבירו לצינור של 15 מיליליטר. לנטרל את האקוטן בנפח שווה של מדיום SL. לאחר מכן העבירו את התאים המנוטרלים דרך פילטר 40 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר.

כעת השתמש בציטומטר המו כדי לספור את התאים. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, השליכו בזהירות את הסופינאט. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם חימום מראש.

0.9% נתרן כלורי. צנטריפוגה את הרווח שלך והשליך את הסופינאט. כדי לעטוף את תאי הגזע העובריים האנושיים, התחל על ידי Resus השעיית התאים בתמיסת אלגינט טרום חמה.

לשם כך, חבר מזרק של 20 מיליליטר לצינורות פלסטיק רכים ושאב אלגינט למזרק. לאחר מכן מערבבים בעדינות את תרחיף התאים באמצעות המזרק מבלי ליצור בועות. כעת שאפו את התאים למזרק.

השליכו את צינורות הפלסטיק ולאחר מכן חברו את המזרק למכונת האנקפסולציה. המשך למכשירים שהוקמו של מחולל החרוזים, משאבת המזרק, מד זרימת האוויר ואמבט המשקעים של סידן כלוריד. ודא פער של 10 סנטימטרים בין קצה מכונת האנקפסולציה לנקודת איסוף צלחת הפטרי.

לאחר מכן, הגדר את משאבת המזרק על 10 מיליליטר לשעה. קצב זרימת אוויר בשמונה ליטר לדקה ולחץ של 100 קילו פסקל. אוספים את התאים העטופים באמבט משקעים חם למשך שבע דקות.

לאחר מכן העבירו אותם על ידי שאיפה עדינה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי אפשרו לכמוסות להתיישב בתחתית הצינור, השליכו בעדינות את הסופינאט, ואז שטפו פעם אחת עם 0.9% נתרן כלורי. המשך להשעות מחדש את התאים המכוסים במדיום תרבית טרום חם, בתוספת מעכב סלע. מעבירים לבקבוק תרבות ודוגרים במשך שלושה ימים.

זרע את קו הסטרומה של העכבר PA שישה תאים בבקבוק T 75 מצופה ג'לטין 0.1% ומדיום התמיינות עצבית דופמינרגית למשך 24 שעות. העבירו את הכמוסות לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר והניחו להן להתיישב בתחתית הצינור. השליכו את הסופינט והשעו מחדש את הכמוסות בהתמיינות עצבית דופמינרגית דופמינרגית במצב PA שישה תאים.

תרבות בינונית. תאי הגזע העובריים האנושיים עטופים בשכבה חד-שכבתית של שישה תאים PA למשך 21 יום. בעת חידוש החלפת המדיה.

רק מחצית מהמדיה בכל פעם ממשיכה לתרבית את ששת תאי ה-PA בהתמיינות עצבית דופמינרגית. מדיום בתוספת גורמים מעוררים למשך שבוע אחד. ראשית שאפו את הקפסולות והעבירו אותן לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

כאשר הכמוסות התיישבו לתחתית, השליכו את הסופינאט. שוטפים פעמיים עם DPBS, זורקים את הספינאט. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת הסרת הראש וערבבו היטב את המתלה.

דגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה של גלולה, תאי הסרת המכסה ושטיפה פעמיים עם DPBS ממשיכים להשתמש בתאי הסרת מכסה כתרבית חד-שכבתית או לניתוח מיידי במורד הזרם. בתכשיר טיפוסי, קוטר המיקרו-כמוסות של אלגינט הוא בין 400 ל-500 מיקרון.

הנה, בדיקת C-F-D-A-P-I. התוצאות קובעות את התאים העטופים הירוקים ברי קיימא ב-80% ניתוחים של כדאיות, התפשטות ואפופטוזיס של תאי גזע עובריים אנושיים עטופים בנקודות זמן שונות משמשים לאופטימיזציה של תנאי התרבות. מעניין שהשפעות מעכבי סלע מונעות אפופטוזיס המושרה על ידי דיסוציאציה ושומרות על כדאיות התאים עם אינדיקציה לצמיחה מעולה של תאי גזע עובריים אנושיים עטופים שגודלו ב-H-F-F-C-M פלוס ri.

דוגמה זו מיישמת אנקפסולציה של תאים כפלטפורמה תלת מימדית להבדיל תאי גזע עובריים אנושיים עטופים לנוירונים דופמינרגיים. כצפוי, גודל גופי העוברים גדל עם הזמן על תאי קפסולציה של דק מפגינים מורפולוגיה עצבית מתקדמת לאחר יומיים-שלושה של תרבית עם יותר מ-90% כדאיות. ניתוח ביטוי גנים מצביע על ויסות נמוך של סמן פלוריפוטנטי OCT 4.

חשוב לציין, סמן האב העצבי PAC 6 והסמן העצבי הדופמינרגי th נשארים מווסתים לאחר שבעה ימים של התמיינות. תאי גזע עובריים אנושיים מובחנים נוספים מצביעים על יותר מ-90% נוירונים חיוביים TH לאחר 21 יום. ניתוח אובדן מערבי מאשר את דפוסי הביטוי החיוביים של TH ו-PAC 6 תחת מערכות תרבית תאים תלת מימדיות לעומת דו-ממדיות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביעילות תוך שעתיים. זכור לטפל בתאים עם מעכב סלע לפני ואחרי אנקפסולציה. משפרי וריאנטים או מעכבים יכולים להתאים את פרוטוקול הבידול התלת-ממדי לניסויים עתידיים.

טכניקה מסוימת זו של עטיפת ESL אנושי והבחנתם בסביבה תלת מימדית או לפוטנציאל לטיפול תאי במספר מחלות, במיוחד מחלת פרקינסון.