Name: אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: למד שיטת מיקרו-אנקפסולציה בתלת ממד לגידול והתמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לנוירונים דופמינרגיים. הטכניקה משפרת אינטראקציות בין תאיות ומאפשרת בידוד חיסוני בהשתלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית NHMRC גרנט # 568969 (PSS) ו הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת New South Wales, יוזמת לתאי גזע (KSS).

כל ההנחיות המפורטות להלן מתבצעות באמצעות טכניקות אספטיים בתוך השנייה מחלקה biosafety הממשלה. חומרים כימיים וציוד המשמשים מפורטים בטבלה שלהלן. 1. הכנת אלגינט 1.1% (W / V) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.275 גרם של נתרן אלגינט מטוהרים (glucuronic גבוהה חומצה תוכן ≥ 60%, צמיגות&gt; 200 מגפ&quot;ס S, ו רעלן פנימי ≤ 100 האיחוד האירופי / g) בצינור סטרילי 50 מ&quot;ל ולהוסיף 25 מ&quot;ל פתרון סטרילי ג&#39;לטין 0.1% הכין קודם לכן (0.5g gelatin/500 מ&quot;ל אלפית ש H 2 O ו מומס על ידי מעוקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערבולת צינור כ 30 שניות כדי להמיס את האבקה חלקית אלגינט ואז למקם את הצינור על מערבל מסלולית ב XG 10 את הלילה (בטמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2.778 מ&quot;ל של NaCl סטרילית 9% (4.5 גרם של NaCl/50 מ&quot;ל אלפית ש H 2 O) ל 25 מ&quot;ל של תמיסת אלגינט. המערבולת צינור כ 30 שניות ואחריו צנטריפוגה ב XG 95 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון אלגינט ב 4 °; C לאחסון לטווח קצר (1-2 חודשים) או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך (כשנה). </li></ol> 2. הכנת אמבט 2 רטיבות CaCl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 14.7 גרם של CaCl 2. 2H 2 O ו - 2.38 גרם של HEPES ב 1 ליטר של אלפית ש H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את רמת החומציות ל 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטיבות אמבטיה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר (6-12 חודשים). </li></ol> 3. הכנת Decapsulating פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 500 מ&quot;ל של פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (D-PBS), מוסיפים 50 מ&quot;ל של EDTA 0.5m ו 5 מ&quot;ל של HEPES 1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר באמצעות מסנן או 0.22 מיקרומטר החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון decapsulating בטמפרטורת החדר (6-12 חודשים). </li></ol> 4. הכנת סרום החלפת בינוני (SR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אנקפסולציה, להכין בינוני SR מראש כמו דהscribed בטבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד. </li></ol> 5. הכנת אינהיביטור רוק (Y-27632) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Y-27632 אבקת ב 0.1% האנושי סרום אלבומין (HSA) ב D-PBS לעשות פתרון 5 מ&quot;מ. </li></ol> 6. הכנת hESC אנקפסולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטיפול המקדים תאים עם התקשורת culturing השלימו עם 10 מיקרומטר של מעכב רוק (RI) במשך שעתיים ב -37 מעלות צלזיוס (הגנה מן האור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול RI, לשטוף את התאים עם D-PBS פעמיים לסלק את התאים מצלחות תרבות enzymatically עם accutase 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את התאים עם פיפטה מגרד או תא ולאסוף בצינור 15 מ&quot;ל. לנטרל את accutase עם המדיום SR ביחס 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את ההשעיה תא בודד, לסנן את התאים מנוטרלים באמצעות מסנן 40 מיקרומטר ולאסוף ב צינור צנטריפוגות טרי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר הכולל של תאים בתמיסה באמצעות hemacytometer. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה ההשעיה התא XG 95 דקות 5 ובזהירות לבטל supernatant לאחר מכן. שוטפים את התאים עם מחומם מראש NaCl 0.9%. סרכזת XG 95 דקות 5 וזורקים supernatant. </li></ol> 7. אנקפסולציה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מזרק 1 מ&quot;ל מחובר צינור פלסטיק רך של 14 גר קטטר X 2 ד &quot;. זה משמש לשאוב ההשעיה התא להיות טעון על משאבת מזרק כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את התאים עם פתרון מחומם מראש אלגינט בצפיפות של 1.25 מיליון תאים / מ&quot;ל ​​אלגינט. מערבבים בעדינות עם מזרק ולמנוע יצירת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת גנרטור חרוז, משאבת מזרק מד זרימת אוויר, כפי שמוצג באיור 1. פרטים נוספים של מכשירים אלה מוצגים לפי טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התאים aspirated לתוך מזרק, לבטל את צינורות הפלסטיק של קטטר IV ולצרף את המזרק מכונת אנקפסולציה. ודא כי קיים פער 10 ס&quot;מ להיות<html> tween בסופו של המכונה אנקפסולציה ונקודת איסוף כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמצת את התאים על ידי הגדרת משאבת מזרק בשיעור 20 מ&quot;ל אוויר / שעה, הזרימה ב L 8 / דקה ואת הלחץ של kPa 100 (בגודל של קפסולות ניתן לשנות על ידי שינוי קצב זרימת אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים כמוס לתוך צלחת פטרי (100 x 15 מ&quot;מ) מלא 20 מ&quot;ל של אמבטיה מחומם מראש משקעים דקות 7 לייצב את הכמוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים כמוס על ידי שאיפה עדינה לתוך 50 מ&quot;ל צנטריפוגות מבחנות מלאות 20 מ&quot;ל של 0.9% NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הכמוסות להתיישב לתוך החלק התחתון של הצינור ואז להשליך בעדינות supernatant. חזור על תהליך הכביסה עם NaCl 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים הגלום בינוני מחומם מראש culturing השלימו עם RI (10 מיקרומטר), להעביר לתוך הבקבוק תרבות מודגרות ב 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 8. דיפרנציאציה של hESC Encapsulated כדי DA נוירונים ve_content &quot;&gt; hESC Encapsulated מטופלים עם RI במשך 3 ימים לפני בידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע העכבר קו סטרומה התא, PA6 תאים בצפיפות של 1.0 x 10 4 ל 2 ס&quot;מ ב 0.1% ג&#39;לטין מצופה T75 בקבוק ומצבו את PA6 תאים בינוניים בידול התובע עצבית (טבלה חומרים) 24 שעות לפני בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הכמוסות לצינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל ולאפשר להם להתיישב לתוך החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ו resuspend את הכמוסות במדיום PA6 DA תא ממוזג בידול עצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות hESC במארז עם monolayer PA6 תאים (9 x 10 6 hESCs ל 7.5 x 10 5 PA6 תאים) במשך 28 ימים עם שינוי המדיה ביום 4 וכל כמה ימים לאחר מכן (לשנות רק מחצית בינונית בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שבועות בתרבות עם PA6 תאים, להשלים את המדיום התובע בידול עצבית עם 100 ng / mL ששש ו 100 ng / mL FGF8a שבוע הנותר. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation של hESC Encapsulated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הכמוסות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ולאפשר להם להתיישב בחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן לבטל את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הכמוסות עם D-PBS פעמיים. בואו הכמוסות להתיישב בחלק התחתון של הצינור ולאחר מכן להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל פתרון decapsulating על קפסולות. מערבבים את ההשעיה באופן יסודי באמצעות שאיפה לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה תאים decapsulated XG ב 95 דקות 3 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התא גלולה עם D-PBS ואחריו צנטריפוגה XG ב 95 דקות 3. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים decapsulated יכול להיות מתורבת יותר כמו monolayer או להשתמש בהם ניתוח במורד הזרם. </li></ol> 10. נציג תוצאות הקוטר של microcapsules אלגינט הוא 400-500 מיקרומטר. מספר התאים בתוך הקפסולה היתה estimatאד על ידי חישוב המספר הכולל של תאים מחולק במספר הכולל של קפסולות בכל ריצה. לכן, כ 5.0 x 10 4 תאים בכל כמוסה הוערך. מכאן, אנו מעריכים כי המספר המרבי של הקפסולה תאים יכול להכיל הוא כ 1.0 x 10 5. הכדאיות של hESC במארז הוא&gt; 80% (איור 2) כפי שנקבע על ידי שימוש באמצעות diacetate carboxyfluorescein succinimidly אסתר (CFDA) / יודיד propidium (PI) assay. אנחנו מותאם לתנאי אנקפסולציה hESC ידי הפחתת ריכוז אלגינט מ 2.2% עד 1.1% ועל ידי שינוי אמבטיה המשקעים בריום כלוריד כדי סידן כלוריד. מתוך תנאים אלו, אנו מראה כי רק את התאים אשר היו ארוזים עם אלגינט סידן 1.1% הצליחו לשרוד, להתרבות וליצור EBS במבחנה 1. כדי לייעל עוד יותר את המצב, ההשפעות של המדיה culturing ו RI, Y-27632 נחקרו. הנתונים כפי שהוצגו באיור 2 ו 3 מראים כי prevente RIד דיסוציאציה הנגרמת אפופטוזיס ומתוחזק על כדאיות התא והיווצרות אשכול לקדם 1,6. יתר על כן, את הכדאיות של hESC Encapsulated בתרבית RI + hFF-CM היה גבוה באופן משמעותי מאשר קבוצות אחרות ללא תוספת RI, אך זה לא היה שונה באופן משמעותי hESC Encapsulated בתרבית RI + SR. כמו כן, התפשטות תאים באמצעות assay BrdU עלה מ 25% עד 75% כמו תאים בודדים התפתח אשכולות (איור 3). Assay אפופטוזיס על ידי TUNEL גילה כי תאים בודדים microcapsules בתרבית בינוני SR היו אפופטוטיים (מידע לא מוצג) ואילו אשכולות שנמצאו CM-hFF היו שליליות בעיקר TUNEL. במידה מסוימת, hFF ס&quot;מ בתוספת bFGF גם קידם הישרדות ריבוי hESCs הגלום בהיעדר Y-27632. עם זאת, הטיפול ב-Y לפני 27,632 (2 שעות) ואחרי אנקפסולציה (למשך 4 ימים נוספים) משופרת במידה ניכרת, הכדאיות שגשוג היווצרות אשכול hESC Encapsulatedב microcapsules אלגינט 1.1% סידן. בעבר הראינו כי hESC במארז יכול להיות מובחן בהצלחה האנדודרם סופי 1. כאן בדקנו את היישום של אנקפסולציה תא כפלטפורמה 3D להבדיל hESC Encapsulated בתוך הנוירונים התובע. hESC, שיצר גופים embryoid (EB) בכמוסות היו ישירה מבודל על decapsulation בתנאים המתוארים הראו מורפולוגיה עצבית מתקדמת (איור 4) לאחר 2-3 ימים של תרבות עם כדאיות יותר מ 90%. ניתוח Gene הביטוי הראה את ויסות של סמן pluripotent, OCT4 תוך ציון neuroprogenitor, PAX6 ו סמן התובע העצבית, TH עלו ב-מוסדר לאחר 7 ימים של בידול (5 א &#39;איור). מכתים Immunofluorescent גילה כי hESC הבדיל היו PAX6 חיובי (&gt; 80%), אך OCT4 שלילית ביום 7. HESC מובחן נוסף הראה TH-חיוביות (&gt; 90%) נוירונים לאחר 21 יום (5 ב איור). ניתוח המערבי כתם הראה גםאת ויסות הביטוי TH מיום 14 (איור 5 ג) תוך PAX6 הביטוי היה למטה מוסדר אחרי יום 21. לעומת זאת, התאים בתרבית תחת סביבת דו ממדי (2D) בתנאים דומים (למשל RI לפני הטיפול 2 שעות ו RI שלאחר הטיפול במשך 3 ימים לפני התמיינות) שמר על אחוז גבוה של תאים PAX6 חיובי (&gt; 80 %) במשך כל תקופת בידול ולא היו יעילים כמו הבחנה כדי TH-חיוביות תאים (&lt;60%) כמו בסביבת 3D מסופק על ידי אנקפסולציה (איור 5 א &#39;ו - ג&#39;).

<ol><li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li>
<li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li>
<li>Cell encapsulation: promise and progress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Orive, G. 9, 104-107 (2003).</li>
<li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li>
<li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li>
<li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

מספר מחקרים באמצעות העכבר גזע עובריים לתאים hESC הוכיחו את היתרונות של מערכת התרבות 3D ב biomaterials והנדסת רקמות 2,3. השתמשנו אלגינט microcapsules סידן כפלטפורמה 3D מתאים ללמוד התפשטות hESC והבחנה בהשוואה אלגינט בריום מאז hESC הראו כדאיות גבוהה יותר משמעותית כאשר הגלום אלגינט סידן מאשר אלגינט בריום. מערכת זו מאפשרת גם תרבות תרבות גבוהה צפיפות התאים וחילופי חומרי מזון וחמצן דרך הממברנה 7. התמיינות ספונטנית בתוך הכמוסות נצפתה קודם לכן ההנחה היא כי ככל hESC מו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות </td></tr><tr><td> אלגינט (Pronova למעלה MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> glucuronic גבוהה תכולת חומצות ≥ 60%, צמיגות&gt; 200 מגפ&quot;ס S, ו רעלן פנימי &lt;100 האיחוד האירופי / g </td></tr><tr><td> ג&#39;לטין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100 גרם </td><td></td></tr><tr><td> 0.9% NaCl </td><td> בקסטר הבריאות </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> סוג J1 חרוז גנרטור </td><td> ניסכו הנדסה בע&quot;מ </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser מזרק משאבה </td><td> חדש משאבת עידן מערכות בע&quot;מ </td><td> דגם NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow רפואי flowmeter </td><td> גסקון מערכות</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> מרק </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> האדם אלבומין בסרום </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14 גר x 2 &quot;קטטר IV </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> נוק אאוט, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> עבור SR בינוני (הבסיס) </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> עבור SR בינוני (2 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> נוק אאוט סרום החלפת </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> עבור SR בינוני (20%) </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> עבור SR בינוני (2.5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> אינסולין transferrin, סלניום (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> עבור SR בינוני (1x) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> עבור SR בינוני (0.1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> MEM פתרון NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> עבור SR בינוני (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> גלזגו בינוני Essential Minimum </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (הבסיס) </td></tr><tr><td> נוק אאוט סרום החלפת </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (10%) </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> MEM פתרון NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> עבור התובע nבידול בינוני eural (0.1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (0.1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> סוניק הקיפוד (ששש) </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> על בידול התובע עצבית (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> גידול פיברובלסטים גורם 8 א (FGF8a) </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 4745-F8-050 </td><td> על בידול התובע עצבית (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3d עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hesc) כדי שושלות שונות

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מתעוררים כמקור חלופה אטרקטיבית עבור טיפול חלופי תא שכן ניתן להרחיב בתרבות הבדיל ללא הגבלת זמן לכל סוגי התאים בגוף. סוגים שונים של biomaterials יש גם שימש בתרביות תאים גזע לספק microenvironment מחקה נישה תא גזע 1-3. זו האחרונה היא חשובה לקידום התא אל התא אינטראקציה, התפשטות תאים, והתמיינות אל שושלות ספציפיות, כמו גם הארגון רקמה על ידי מתן תלת ממדי (3D) סביבת 4 כגון אנקפסולציה. עקרון אנקפסולציה התא כולל המלכוד של תאים חיים בגבולות קרום חדיר למחצה בתרבויות 3D 2. קרומים אלה מאפשרים לחילופי חמצן, חומרי מזון גירויים על פני הממברנות, ואילו הנוגדנים ותאי החיסון של המארח שגודלם עולה על גודל הנקבוביות הקפסולה מודרים 5. הנה, אנחנו מראששלח את הגישה לתרבות להבדיל hESC נוירונים התובע ב microenvironment 3D באמצעות microcapsules אלגינט. יש לנו תרבות שונה התנאים 2 כדי לשפר את הכדאיות של hESC כמוס. הראינו בעבר כי תוספת של p160-Rho הקשורים מעכבי קינאז סליל מפותל, (רוק), Y-27632 ואנושי בינוני העובר פיברובלסטים אוויר החלפת בסרום (hFF-CM) לפלטפורמה 3D משופרת באופן משמעותי את הכדאיות של hESC Encapsulated שבו התאים לידי ביטוי מוחלטות סמן גנים האנדודרם 1. השתמשנו עכשיו זה פלטפורמה להפצת 3D של בידול hESC ויעיל נוירונים התובע. חלבון הגן ניתוחים ביטוי לאחר השלב האחרון של בידול התובע העצבית הראו ביטוי מוגבר של hydroxylase טירוזין (ה &#39;), הסמן של התובע נוירונים,&gt; 100 קפלי לאחר 2 שבועות. החוקרים שיערו כי הפלטפורמה שלנו 3D באמצעות microcapsules אלגינט אולי כדאי ללמוד את התפשטות וביים בידולשל hESC כדי שושלות שונות. מערכת 3D גם מאפשר הפרדת תאים מזין מן hESC במהלך תהליך של התמיינות, וכן יש פוטנציאל בידוד-החיסונית בעת השתלת בעתיד.

יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הופכים למקור חלופה אטרקטיבי לטיפול בהחלפת תאים, מכיוון שניתן להרבית אותם בתרבית...

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לכדיסקפולציה של תאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים והגדרתם לנוירונים דופמינרגיים במערכת תלת-ממדית. ראשית, יש לטפל במושבות במעכב ROCK (או RI) ולפרק אותן לתאים בודדים בעזרת סודיום אלגינאט, ולאחר מכן להעבירם דרך מכשיר האנקפסולציה. יש להמשיך בטיפול ב-RI למשך שלושה ימים, להעביר את התאים המוקפסלים למצע PA six ולהבדילם למשך 28 ימים.בסופו של דבר, ניתוחי ביטוי גנים וחלבונים מראים יעילות גבוהה יותר ביצירת נוירונים דופמינרגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקול בידוד דו-ממדי (2D) קיים הוא הניסיון להנחיל ולהבדיל תאים אלו בסביבה תלת-ממדית (3D), וסביבה תלת-ממדית זו מאפשרת להנחיל את התאים בצפיפות גבוהה. בנוסף, היא מאפשרת אינטראקציה טובה יותר בין התאים לצורך הבידול.ושלישית, הדבר יעניק לכם יעילות גבוהה יותר של דיפרנציאציה בהמשך התהליך. כמו כן, אם אוכל להוסיף, ניתן להתאים את הטכניקה הספציפית הזו גם לסוגים אחרים של תאים שניתן להגדיל בסביבה תלת-ממדית. כעת, זכרו גם שבעצם, לדוגמה, הטכניקה הספציפית הזו עברה אופטימיזציה על בסיס שימוש במעכב ROCK מסוים המונע אפופטוזה של התאים וכן מונע את ניתוק התאים ממעdishי התרבית.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקושי בתחילה, שכן טכניקה זו אינה מבוצעת בדרך כלל בתרביות רקמה. טכניקת הכליאה הבאה עברה אופטימיזציה בהתבסס על מחקרי הסיכום של Dr.Dean ו-Dr.Chad בנוגע ליישום של alginate מסוג R inhibitor, ריכוז alginate והגדרות מכשיר הכליאה. ג'יימי וקים, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלנו, ידגימו כעת פרוטוקול זה.הוסיפו 25 milliliters של תמיסת ג'לטין סטרילית בריכוז 0.1% ל-275 milligrams של נתרק אלגינאט מpurified בתוך מבחנה סטרילית בנפח 50 milliliter; ערבבו באמצעות vortex כדי להמיס חלקית את אבקת האלגינאט. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מערבל אורביטלי (orbital mixer) במהירות של 10 times G למשך לילה. לבסוף, הוסיפו נתרק כלוריד סטרילי בריכוז 9% לתמיסת האלגינאט.ערבבו במיקסר (Vortex) למשך 30 שניות ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה ב-95 ×g למשך חמש דקות. שמרו את תמיסת האלגינאט בטמפרטורה של 4 °C. ראשית, בסביבה חשוכה, הכשילו את תאי הגזע העובריים של בני אדם באמצעות מצע גידול המועשר ב-10 µM של מעכב ROCK.דגרו למשך שעתיים ב-37 °C. כעת שטפו את התאים פעמיים עם DPBS כדי לשחרר אותם אנזימטית. הוסיפו accutane ודגרו למשך 10 דקות.בטמפרטורה של 37 °C, קצרו בעדינות את התאים באמצעות גורר תאים (cell scraper) והעבירו אותם לשפרוֹר של 15 ml. נטרלו את ה-Accutane באמצעות נפח שווה של מצע SL. לאחר מכן, העבירו את התאים המנוטרלים דרך מסנן של 40 micron לשפרוֹר צנטריפוגה נקי של 50 ml.כעת השתמשו במערך ספירה של תאי דם (hemo cytometer) כדי לספור את התאים. השקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה ורוקנו בזהירות את הנוזל העליון (supinate). לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסה שחוממה מראש.0.9% sodium chloride. סוביב את המשקע בצנטריפוגה והסר את הנוזל העליון. כדי לאכסן את תאי הגזע העובריים האנושיים, התחל על ידי השהיית התאים בתמיסת אלגינט שחוממה מראש.כדי לבצע זאת, חברו מזרק של 20 milliliters לצינור פלסטיק רך ושאבו אלגינט לתוך המזרק. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את תגלה התאים באמצעות המזרק מבלי ליצור בועות. כעת, שאבו את התאים לתוך המזרק.השליכו את צינור הפלסטיק ואז חברו את המזרק למכשיר הכמיסה. המשיכו להגדרת המכשירים של מחולל החרוזיים, משאבת המזרקים, מד זרימת האוויר ואמבט השקיעה של calcium chloride. ודאו שקיים רווח של 10 centimeter בין קצה מכשיר הכמיסה לנקודת האיסוף בצלחת הפטרי.בשלב הבא, כוון את משאבת המזרקים ל-10 milliliters לשעה. קצב זרימת האוויר ל-eight liters לדקה ולחץ של 100 kilo pascals. אסוף את התאים המעטפים לתוך אמבט שיקוע שחומם מראש למשך שבע דקות.לאחר מכן, העבירו אותם באמצעות שאיבה עדינה לפרועת צנטריפוגה של 50 milliliters המכילה 20 milliliters של 0.9% Sodium chloride. המתינו עד שהקפסולות ישקעו לתחתית הפרועת, השליכו בעדינות את הנוזל העליון, ולאחר מכן שטפו פעם אחת עם 0.9% Sodium chloride. המשיכו להשעות את התאים העטופים במצע גידול שחומם מראש, בתוספת מעכב רוק (rock inhibitor). העבירו לבקבוק תרבית והדגירו למשך שלושה ימים.זריעה של תאי קו הסטרומה של עכבר PA six בבקבוק T 75 מצופה בג'לטין בריכוז 0.1%, וה conditioning של מצע דיפרנציאציה עצבית דופמינרגית למשך 24 שעות. העבירו את הקפסולות לפראנל צנטריפוגה בנפח 50 milliliter והמתינו עד ששקעו לתחתית הפראנל. השליכו את הנוזל העליון והשביו את הקפסולות במצע דיפרנציאציה עצבית דופמינרגית המותנה בתאי PA six.תרבית מצע. תאי הגזע העובריים האנושיים העטופים עם שכבת תאים אחת של PA six למשך 21 ימים. בעת חידוש המצע, יש להחליף את המדיה.בכל פעם השתמשו רק בחצי מהמצע כדי להמשיך את תרבית תאי ה-PA six בדיפרנציאציה עצבית דופמינרגית. מצע זה מועשר בגורמי השראה למשך שבוע אחד. ראשית, שאבו את הקפסולות והעבירו אותן למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר.כאשר הקפסולות שוקעות לתחתית, השליכו את הנוזל העליון. שטפו פעמיים עם DPBS, והשליכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של תמיסת decap ululating וערבבו את התרחף היטב.דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סבב צנטריפוגה של המשקע, ניתן להשתמש בתאי ה-decap, לאחר שטיפה כפולה עם DPBS, כתרבית בשכבה אחת (monolayer) או לניתוחים המשכיים מיידיים. בהכנה טיפוסית, קוטר המיקרו-קפסולות של האלגינאט הוא בין 400 ל-500 מיקרון.כאן מוצג בדיקת C-F-D-A-P-I. התוצאות קובעות את התאים העטופים החיוניים המסומנים בירוק ב-80%ניתוחים של חיוניות, פרוליפראציה ואפופטוזה של תאי גזע עובריים אנושיים עטופים בנקודות זמן שונות משמשים לאופטימיזציה של תנאי התרבית. באופן מעניין, השפעות של מעכב rock מונעות אפופטוזה המושרית על ידי הדיסוציאציה ושומרות על חיוניות התאים, עם אינדיקציה לצמיחה עדיפה של תאי גזע עובריים אנושיים עטופים שגודלו ב-H-F-F-C-M בתוספת ri.דוגמה זו מיישמת כליאה של תאים כפלטפורמה תלת-ממדית להגhautה של תאי גזע עובריים אנושיים כלואים לנוירונים דופמינרגיים. כצפוי, גודל גופי העוברית גדל עם הזמן; עם הסרת הכליאה, התאים מראים מורפולוגיה נוירונלית פרוגרסיבית לאחר יומיים עד שלושה ימי תרבית, עם חיוניות של למעלה מ-90%. ניתוח ביטוי גנים מעיד על דה-רגולציה (downregulation) של הסמן הפלוריפוטנטי OCT four.חשוב לציין כי הסמן לתאי מוצא עצביים PAC six והסמן לנוירונים דופמינרגיים th נותרים מועלים לאחר שבעה ימי דיפרנציאציה. תאי גזע עובריים אנושיים שעברו דיפרנציאציה נוספת מראים למעלה מ-90% נוירונים חיוביים ל-TH לאחר 21 ימים. ניתוח Western blot מאשר את דפוסי הביטוי המועדפים של TH ו-PAC six במערכות תרבית תאים בתלת-ממד (3D) לעומת דו-ממד (2D).לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביעילות תוך שעתיים. זכרו לטפל בתאים עם מעכב Roc לפני ואחרי הכמוסה (encapsulation). ניתן להתאים את פרוטוקול ההבדלה התלת-ממדית לניסויים עתידיים באמצעות שימוש במעבדים או במעכבים של וריאנטים.טכניקה ספציפית זו של הכמיש של ESL אנושיים והגאלתם תחת סביבה תלת-ממדית, או לצורך פוטנציאל לטיפול תאי במספר מחלות, ובמיוחד במחלת הפרקינסון.

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מציג את ההתפתחות וההתמיינות של תאי גזע עצביים אנושיים בתוך פיגום תלת ממדי. ציפוי למינין על הפיגום מקדם את חיבור התא, ואילו תווך עצבי נטול גורמי גדילה גורם להתמיינות תאים לתאי אב עצביים, המרחיבים את התהליכים שלהם בתוך ארכיטקטורה נקבובית לכיוונים מרובים, ויוצרים תרבית תלת...

התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לתרבית תלת-ממדית באמצעות פיגום נקבובי

בסרטון זה מודגם פרוטוקול מדורג של תאי גזע עובריים אנושיים לאורגנואידים עצביים. השיטה כוללת גרימת היווצרות רוזטה עצבית, ואחריה הבשלה מבוקרת וטיפוח סופי על קרום הידרופובי כדי להשיג אורגנואידים עצביים מפותחים במלואם.

התמיינות והבשלה של תאי גזע עובריים אנושיים לאורגנואידים עצביים

פרטי פרוטוקול ניתנים לתאים במבחנה תיוג גזע עובריים אנושיים עם חלקיקים ליצירת הרמוניים שני. מתודולוגיות לחקירת hESC ידי מיקרוסקופית רב פוטון והבידול שלהם בצבירי לב גם מוצגות.

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

הקמנו שיטה לעטיפת תאי גזע פלוריפוטנטיים (תאי PS) לכמוסות הידרוג'ל אלגינט באמצעות זרבובית קו-אקסיאלית.  זה מונע מהתאים להצטבר יתר על המידה ומגביל את מתח הגזירה שחווים התאים בתרבית השעיה.  הטכניקה ישימה לייצור המוני של תאי PS כמו גם למחקר על נישת תאי גזע.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

פרוטוקול זה מתאר גישה להפקת hepatospheres של תאי גזע האדם בעלי עוצמה באמצעות מערכת התרבות המוגדרת הרכבה עצמית תא. פרוטוקול זה מתוכנת במספר קווי תאים, העלות האפקטיבית ומאפשרת ייצור של כדורי גוף האדם יציבים עבור יישומים ביו-רפואיים.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).

שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.

ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

למד שיטת מיקרו-אנקפסולציה בתלת ממד לגידול והתמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לנוירונים דופמינרגיים. הטכניקה משפרת אינטראקציות בין תאיות ומאפשרת בידוד חיסוני בהשתלה.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

גלה סרטונים נוספים