Name: פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: חקור זיהוי גנים המשמרים את שלמות האברונים בצמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וריצוף דור-הבא. שיטה זו מאפשרת למיפוי מוטציות רצסיביות ולמציאת גנים קריטיים לביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (מספר הפרס DE-FG02-91ER20021) ואת הקרן הלאומית למדע (MCB 0948584) (FB). אנו אסירי תודה על קרן בירד גב לעריכה את כתב היד.

1. EMS טיפול זרעים thaliana ארבידופסיס הם mutagenized משתמש כמו sulfonate mutagen אתיל מתאן סוכן (EMS) 3,4, אשר מעוררת את ה-C-ל-T משתנה הגנום וכתוצאה מכך C / G ל T / A מוטציות 5-7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.8 גרם זרעי ארבידופסיס (~~~HEAD=NNS 40,000 זרעים) הנושאים את הסמן ניאון אברון (באופן ספציפי, במחקר זה ssGFPHDEL (רצף ה-GFP-HDEL האות tetrapeptide) שימש כסמן ER). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הזרעים צינור פלקון 50 מ&quot;ל, ואז מוסיפים 25 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2% (V / V) sulfonate אתיל מתאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 16 שעות על nutating המיקסר במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזלים וזורקים אותו לתוך בקבוק המכיל 1.0 M NaOH להשבית EMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל מים לצינור פלקון המכיל את הזרעים, קרוב, ללא מרחב זה 5 פעמים לשטוף את הזרעים; לחכות עד שכל הזרעים יכולים להגיע, אז לשאוב מים וזורקים לתוך M 1.0 Na<html> OH הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב כביסה עד 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, שוב להשעות את הזרעים בכמות מינימלית של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עיקור זרע הוספת 25 מ&quot;ל של אקונומיקה 10%, לנער במרץ ל -30 זה. בואו זרעים להתיישב למטה, ואז לשפוך את אקונומיקה ולשטוף עם 25 מ&quot;ל של מים סטריליים. יוצקים מעל מים סטריליים ולהוסיף 25 מ&quot;ל אתנול 70%. ללחוץ על צינורות של 30. בואו זרעים להתיישב למטה. יוצקים את אתנול ולשטוף עם 25 מ&quot;ל של מים סטריליים. חזור פעמיים לשטוף עם מים סטריליים, ואז לשפוך זרעים על צלחת פטרי פלסטיק המכיל 3 נייר פילטר MM ולתת יבש מתחת למכסה המנוע. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת את הזרעים על ½ MS phytagel (ריכוז חצי בינוני Murashige ו Skoog), 150 מ&quot;מ צלחת פטרי (~~~HEAD=NNS 250-300 הזרעים צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זרעים M1 על צלחת 2 שבועות, ולאחר מכן השתלת לתוך האדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף זרעים מצמחים מסוג M2 M1 בודדים ליצור קווים M2 (1000 שורות עצמאיים). </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. הקרנת Confocal אוכלוסיות M2 ו M3 בחלק זה אנו מתארים את התצפית של שתילים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או כמתואר לעיל 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שישים זרעים של כל קו M2 גדלים במשך 7 עד 10 ימים פלסטיק צלחות פטרי, ½ MS phytagel, על אותה צלחת גדלים גם 5 שתילי-EMS מטופלים (שליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש עד עשר cotyledons מורכבים עם הצד abaxial לכיוון העדשה (40X) בשקופית המיקרוסקופ המצורף coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל טבורית הוא ציין, בין קליפת המוח באזור המדיאלי, תחת הקרינה להפצה בכל subcellular שונה של הסמן אברון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמחים חיוביים מושתלים לתוך האדמה וזרעי שלהם נאספים הוקרן שוב כדי לאשר את פנוטיפ מוטנטי בדור M3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת מזהמים מוטציות רקע דרך backcrossing לפחות שלוש פעמים כדי הגנום wild-type לשתף ואוליntaining את הסמן הרצוי אברון ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצמח האם, בעזרת מספריים עדינים או מלקחיים להסיר siliques בוגרים, פרחים פתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות כי הם קטנים מדי מן meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה זוג אחד מלקחיים בין עלי הכותרת ואת עלי גביע לפתוח 1 ניצן הפרח ולהסיר את כל המאבקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות זוג מלקחיים לקחת פרח בוגרת פתוח מצמח האב לשפשף את המאבקים על הסטיגמה של הצמח מסורס. </li></ol></li></ol> 3. מיפוי סעיף זה מתאר למעשה כיצד למפות מוטציה רצסיבית באמצעות פרוטוקול שונה מ Borevitz 9 שהוא מהיר יותר אם לעומת שיטות מיפוי מסורתיות 10,11. גישה זו להשתמש צפיפות גבוהה מערכי oligonucleotide את היכולת לזהות מספר רב של פולימורפיזמים תכונה אחת (SFPs) ב assay אחת 12. שימוש ATH1 ארבידופסיס Affymetrix מערך GeneChip ניתןלנתח כ 24,000 גנים. מאגר של F 2 אנשים המציגים את המוטציה משווים למאגר של wild-type f 2 צמחים שנאספו בקרב האוכלוסייה לבודד אותה. לאחר מכן, מוטציה ימופו באזור שבו בריכת מוטציה בו מועשרת עבור אללים מוטנטים גנוטיפ ולכן באותו אזור הבריכה wild-type תגרום מועשר עבור wild-type אללים הוריות 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ&quot;א הגנומי (3 מיקרוגרם) מופק הומוזיגוטים מוטציה קולומביה (M3) באמצעות DNeasy Qiagen ערכת מיני הצומח מוגש על הגנום Illumina Analyzer II (II GA) 14 סידור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוזיגוטים מוטציה קולומביה (M3) הוא חצה עם לנדסברג erecta ליצור מיפוי האוכלוסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיפוי מבוצע על 70 עד 100 אנשים F2 מראה פנוטיפ סוטה ואת אותו מספר של צמחים F2 פנוטיפ עם wild-type. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מצמח כל דיסק עלה (0.60 מ&quot;מ) באמצעות אגרוף חור.הדיסק עלה יש לאסוף מן העלים באותו גיל כדי להיות בטוח יש כמויות דומות של DNA. דוגמאות ניתן לעבד להפקת הגנומי בנפרד או בקבוצות. במקרה זה, ניתן לאסוף דגימות 5-10 עבור כל צינור Eppendorf כך שבסופו של דבר יהיה לך פחות צינורות eppendorf שממנו הדנ&quot;א הגנומי יש צורך לעקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליף MasterPure הצמח DNA טיהור Kit (Epicentre) משמש כדי לחלץ את ה-DNA הגנומי. ה-DNA הגנומי להשיג מדגם זה היא לכמת עם nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותה כמות של הדנ&quot;א הגנומי מכל מדגם לאחר מכן, ביחד עד לסך של 300 ננוגרם (~ 30 μL) של DNAs צמחים, מוסיפים 60 μL פתרון primers 2.5x אקראית [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 מ&quot;מ MgCl2, 25 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol, 750 מיקרוגרם / primers oligodeoxyribonucleotide מ&quot;ל (octamers אקראיים)] (Bioprime בערכה) ו 42 מים μL (μL הסופי נפח 132). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל DNAs ב&gt; 95 ° C במשך 5 דקות עד 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה denatuאדום DNA להוסיף 15 μL תערובת dNTPs 10X עם ביוטין dCTP [1 mM ביוטין-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 מ&quot;מ dATP, 2 מ&quot;מ dGTP, 2 מ&quot;מ dTTP ב 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime הערכה), ולהשלים עם פולימראז 3 Klenow μL (ערכת Bioprime). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 15 μL 3 מ &#39;ו 400 NaOAc μL EtOH 100% קר, ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן להסתובב ב XG 20,500 במשך 15 דקות, להסיר supernatant, ולשטוף עם EtOH μL 500 75% קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסובבים XG 20,500 עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דנ&quot;א כדורי יבש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ו resuspend במים 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 μL לבדוק התפוקה והאיכות על ג&#39;ל (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח 95 μL של תיוג תגובה עבור פראי סוג של מוטציה GeneChip הכלאה ATH1 ארבידופסיס הגנום המערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכים את נסרקים ואת. CEL קבצים שהתקבלו מנותחות באמצעות תוכנת R ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>RG /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת תוכנה R, ולאחר מכן פתח את התוכנית ולהדביק את המחרוזת הבאה: המקור (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () לאחר מכן לחצו על מקש החזרה, זה להתקין את החבילות Bioconductor סטנדרטיים ( <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיקייה חדשה על שולחן העבודה, להוריד מאתר האינטרנט הבא ( <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) את הקבצים: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip ColLerCEL.zip הקובץ יש פרקה את הקבצים המתקבלים להדביק את התיקיה החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה שם את הנתונים שהתקבלו בניסוי GeneChip שלך wildtype.CEL ו mutant.CEL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להעתיק נתונים GeneChip שלך (wildtype.CEL וmutant.CEL) לתוך התיקיה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ר &#39;, א) עבור Mac: לחץ על &quot;שונות&quot;, ולאחר מכן לחץ על &quot;מדריך שינוי עבודה.&quot; ב) עבור ה-PC: לחץ על &quot;קובץ&quot; ואז &quot;מדריך שינוי&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) עבור Mac: בחר את התיקייה המכילה את הקבצים. לחץ על &quot;סביבת עבודה&quot;, &quot;סביבת עבודה קובץ טען&quot; ובחר ath1V5.RData, ב) עבור ה-PC: בחר את התיקייה המכילה את הקבצים הנ&quot;ל, לחץ על &quot;קובץ&quot; ואז &quot;טען סביבת עבודה&quot; ובחר ath1V5.RData. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ReadCEL.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SFP.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Map.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון מסוף תראה את ההודעה הבאה: כרומוזום X מגביל Mb YZ גנים החיפוש תאיר ולהדביק בקישור הזה 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; בסוף = Z </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק והדבק את הקישור בדפדפן האינטרנט שלך. יופיע חלון ולבקש לפתוח או לשמור את הקובץ, עליך לבחור לשמור. בחר שם הקובץ ולצרף את הסיומת &quot;. Xls,&quot; ולאחר מכן לחץ על שמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ &quot;. Xls&quot; שבו אתה יכול למצוא את הקואורדינטות של מוטציה שלך (התוצאה מוצגת באופן גרפי באיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחום ממופה ב Illumina התאספו קורא הגנום המוטנטי לזהות ספציפיים מעברים צוות האמבולנס 4 בין פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד. להשלים את פנוטיפ מוטנטי של הגן עם השינוי בסוג בר (ים) באמצעות הליכים רגילים 15. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 1 מציג את הגישה המשמש זיהוי מוטציה של מסלול הפרשה באמצעות הקרנת מיקרוסקופיה confocal. תרשים 2 מציג הכנה טיפוסי של ה-DNA הגנומי שכותרתו עבור מערך ההכלאה. ב 3 דמות, תוצאה אופיינית צפוי לאחר ניתוח נתונים המתקבלים מערך ארבידופסיס GeneChip הגנום ATH1 מוצג. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> באיור 1. הצמחים הטרנסגניים ארבידופסיס המבטאים ssGFPHDEL (ER סמן) (1) עובדו כדי לייצר זרעים מספיק עבור EMS טיפול (2). זרעים שטופלו EMS נזרעו אז כדי לייצר צמחים M1 (3). כל צמח M1 מייצג קו שונה זרע נאספו בנפרד כל אחד מהם. זרע M2 היו מצופה על מצע MS ½ (4) ו הוקרן מכן על ידי מיקרוסקופ confocal (5) על פגמים מורפולוגיה ER. במהלך ההקרנה מצאנו צמחים שימור מורפולוגיה wild-type ER (6), צמחים המראים פגומים פנוטיפים ER (7). צמחים אלו גדלו להשיג את הדור M3 ו לאשר את הפנוטיפ (8). הדנ&quot;א הגנומי מצמח M3 שימש Solexa Illumina רצף (א). אותו צמחשימש גם צלבים עם הימלר-WT לקבל מיפוי האוכלוסייה F2 (ב). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> 2. איור Bioprime אקראיים תיוג תגובות (5 μL של μL 100) הועמסו על 1% agarose ג&#39;ל. ליין היא מתוך מאגר של צמחי הבר מסוג F2, וליין B היא מתוך מאגר של צמחים מוטנטים F2. (דה מרקר הוא 1 Kb DNA הסולם-N3232, החל חוד). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> איור 3. דמות מייצגת דוגמה מיפוי של מוטציה Col-0 ארבידופסיס באמצעות GeneChip ATH1 הגנום הכלאה המערך. מוטציה בדוגמה זו ממוקמת על תחום כרומוזום 1, על ידי קווים אנכיים. הסורגים האופקיים מייצגים את סף לצורך זיהוי.

<ol><li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li>
<li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3%2C+a+non-essential+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li>
<li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li>
<li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li>
<li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li>
<li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li>
<li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Golgi+apparatus%3A+from+imaging+to+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li>
<li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li>
<li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li>
<li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li>
<li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li>
<li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).</li>
<li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

כאן תיארנו ההקרנה confocal מיקרוסקופיה מבוססת על זיהוי של מוטציות endomembrane. גישה זו ניתן להרחיב בקלות אברונים אחרים של התא עבורו סמנים ספציפיים חלבון פלואורסצנטי הזמינים. המסך מבוסס על זיהוי של מוטנטים המציגים התפלגות חריגה של סמן פלואורסצנטי בין אם אברון היעד או אברונים שאינם אמורים להכיל את הסמן. בהתאמה, מוטציות אלה מייצגים אוכלוסיות בו גם את היכולת של אברון כדי subcompartimentalize סמן נפגעת או מוטציות שלא ניתן כראוי translocate את הסמן בין האברונים. במהלך ההקרנה שמנו לב כמ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ethylmethane sulfonate </td><td> סיגמא </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT בייקר </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige skoog הבסיס בינוני * פרנסות gamborg ויטמינים </td><td> פיטו technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> סיגמא </td><td> P8169-1 ק&quot;ג </td></tr><tr><td> ערכת RNeasy מיני </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> הורים צמח טהור עלה DNA ערכת טיהור </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> ה-DNA Bioprime תיוג מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> 200 אלכוהול הוכחה </td><td> Decan מעבדות Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT בייקר </td><td></td></tr><tr><td> שבב גנטי ארבידופסיס ATH1הגנום מערך </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> פלקון צינורות 50 מ&quot;ל </td><td> קורנינג </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Eppendorf מבחנות 1.5 מ&quot;ל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נייר סינון 90 מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> אנליטי מאזן </td><td> Mettler טולדו AB54-S </td><td> נה </td></tr><tr><td> Nutating (גל) שאכר </td><td> Heidolph polymax 1040 </td><td> נה </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> נה </td></tr></tbody></table>

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון integrity

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

פרוטוקול זה מתאר סינון הקרינה המיקרוסקופ מבוסס על שתילים ארבידופסיס ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיבי אשר משנים את חלוקת subcellular של סמן מסוים ניאון מתויג במסלול הפרשה. ארבידופסיס הוא מודל ביולוגי רב עוצמה למחקרים גנטיים בגלל גודל הגנום שלו, זמן דור, ושימור של המנגנונים המולקולריים בין הממלכות. מערך genotyping כגישה למפות מוטציה חלופה לשיטה המסורתית המבוססת על סמנים מולקולריים יש יתרון משום שהוא הוא יחסית מהיר יותר עשוי לאפשר מיפוי של מוטציות מספר פרק זמן קצר מאוד. שיטה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים אשר יכולים להשפיע על שלמות אברון כל בצמחים. הנה, לדוגמה, אנו מציעים מסך לגנים מפת חשובים שלמות של reticulum endoplasmic (ER). הגישה שלנו, לעומת זאת, ניתן להרחיב בקלות אברונים תאים אחרים צמחים(לדוגמה לראות 1,2), ובכך מייצג צעד חשוב לקראת הבנת הבסיס המולקולרי השולט מבנים subcellular אחרים.

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

פרוטוקול זה מתאר סריקה של נבטי Arabidopsis המבוססת על מיקרוסקופ פלואורסצנציה, ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיביות המשנות את ה...

מטרת ניסוי זה היא לזהות את הגן או הגנים האחראים לשמירה על השלמות המורפולוגית והתפקודית של אברוני תא בצמחים. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספה של Ethel methane sulfonate כחומר כימי למתן מוטגנים לזרעים הנושאים סמן פלואורסצנטי של האברונים. השלב השני הוא איסוף זרעים מצמחים בודדים מהדור המוטגני הראשון, כדי לגדל שושלות של דור המוטנטים הבא, M two.בשלב הבא, בוחנים את זרעי ה-Eliana המוטגנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנטי כדי לזהות פנוטיפ אורגנלי חריג. השלב הסופי הוא יצירת הדור המוטגני השלישי ואישור נוכחותו של הפנוטיפ המוטנטי. בסופו של דבר, ניתן למפות את המוטציה הרססיבית באמצעות כלי ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing).ברגע שמיקומו של הגן המוטנטי מזוהה, טרנספורמציה באמצעות הגן מסוג הבר (wild type) אמורה לשקם את הפנוטיפ האורגנלי השגוי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לשמירה על השלמות המורפולוגית והתפקודית של אורגנלות בצמחים. טיפול בסולפונטים של אתיל-מתאן בזרעים של atop sta משרה שינויים של דה-אמינציה של ציטוזין בגנום, מה שמוביל להפיכת ציטוזין לאורציל.הוספת מוטציות. טיפול ב-EMS הוא שלב מרכזי בפרוטוקול זה כדי להבטיח יחס מוטציות מושלם בתוך שני פרטים של דור M2. כדי להתחיל, השג זרעים של Arabidopsis מסוג wild type Columbia Ecotype שהונדסו מראש כך שישאו סמן פלואורסצנטי רלוונטי לאברון.העבר 0.8 גרם או כ-40,000 זרעים למבחנת פלקון בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של מים מזוקקים ו-0.2% Ethel methane sulfonate. הדגר את התערובת למשך 16 שעות במערבל מוטציות במהירות נמוכה; לאחר ההדגרה, שאב את הנוזל והשלך אותו לבקבוק המכיל sodium hydroxide בריכוז one molar.כדי לנטרל את ה-EMS, הוסיפו 25 milliliters של מים למבחנה מסוג Falcon המכילה את הזרעים. סגרו את המבחנה והפכו אותה חמש פעמים כדי לשטוף את הזרעים. לאחר שכל הזרעים שקעו, שאבו את המים והשליכ תם לבקבוק המכיל sodium hydroxide בריכוז one molar.חזור על שלב שטיפה זה עד 10 פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, השאר את הזרעים בכמות מינימלית של מים. המשך לעיקר הסטריליזציה של הזרעים על ידי הוספת 25 milliliters של bleach בריכוז 10% ונער בעוצמה למשך 30 שניות. ברגע שהזרעים שוקעים לתחתית, שפוך את ה-bleach ושטוף עם 25 milliliters של מים סטריליים.לאחר הסרת המים הסטריליים, יש להוסיף 25 milliliters של 70%ethanol. יש לנער את המבחנות למשך 30 שניות ולאפשר לזרעים לשקוע לתחתית. יש לשפוך את ה-ethanol ולשטוף עם 25 milliliters של מים סטריליים.חזרו על השטיפה במים סטריליים פעמיים. לאחר מכן, שפכו את הזרעים אל תוך צלחת פטרי מפלסטיק המכילה נייר סינון בעובי שלושה מ"מ. הניחו לזרעים להתייבש תחת המנדף לאחר דגירה של הזרעים למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הניחו את הזרעים בצלחת פטרי של 150 מילימטר, בכמות של כ-250 עד 300 זרעים לצלחת, בתוך מצע Magi and scoog חצוי המכיל fighter gel כחומר ג'לטינציה. גדלו את הזרעים מדור M1 על צלחות למשך שבועיים. השתילו את השתיליים לאדמה ואפשרו לצמחים להמשיך לגדול.לאחר 30 עד 45 ימים, הצמחים יגיעו לשלב הבגרות שבו ניתן יהיה לראות את הדליפות בבירור. בנקודה זו, אספו שני זרעים מצמחים M1 בודדים כדי להפיק 1000 שורות M2 עצמאיות. על מנת לבחון את השתילים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנציה, גדלו 60 זרעים מכל שורת M2 למשך שבעה עד 10 ימים בצלחות פטרי מפלסטיק בחצי.במדיה מסוג Moreish ו-scoog המכילה fighter gel, גדלו גם חמישה נבטים של ביקרת השליטה שלא טופלו ב-EMS על אותה צלחת. לאחר גדילת הנבטים, הצמידו חמישה עד 10 cos lead-ins כאשר צד ה-ABAC seal פונה לעדשת ה-40x על תגית מיקרוסקופ וכסו בכיסוי זכוכית. תחת פלואורסצנציה, בחנו כל olein מהאזור הקורטיקלי לאזור המדיאלי כדי לזהות שינוי בהפצה התת-תאית של סמן האורגנלה. לאחר השתלת הצמחים החיוביים בקרקע וגידול הנבטים כפי שתיארנו, ודאו כי הפנוטיפ המוטנטי קיים בדור M3.הסר את מוטציות הרקע המזהמות באמצעותB back crossing לפחות שלוש פעמים לגנום מסוג wild type המכיל את הסמן הפלורסצנטי האורגנלי הרצוי, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל במיפוי, השתמש בערכת cogen DN Easy Z plant mini kit כדי למצות כ-three micrograms של DNA גנומי מ-M three, המייצגת את ה-DNA של המוטנט ההומוזיגוט Columbia. שלח DNA זה לריצוף ב-Illumina genome analyzer two 14.השלב הבא הוא להכליא את מוטנט ה-zago מסוג Colombia עם Las Berger כדי להפיק דור ראשון באמצעות הגבייה עצמית, שבו השילוב יכול להתרחש. דור ה-f2 שיווצר ישמש בסופו של דבר כאוכלוסיית מיפוי המכילה את הגן המדובר, הגורם למוטציה. על ידי השוואת ה-DNA הגנומי של אוכלוסייה זו עם ה-DNA הגנומי של צמחים מסוג wild type, ניתן לזהות את מיקום המוטציה בגנום.לאחר גדילת צמחי ה-F2, אספו בין 70 ל-100 פרטי F2 המראים את הפנוטיפ השגוי ומספר זהה של צמחי F2 עם פנוטיפ מסוג בר (wild type); אספו דיסקיות עלה מכל צמח באמצעות מחורר נייר. יש לאסוף את דיסקיות העלה מעלים בעלי גיל זהה. כדי להבטיח כמויות דומות של DNA, ניתן לעבד את הדגימות לצורך מיצוי גנומי באופן נפרד או בקבוצות.במקרה זה, ניתן לאסוף חמישה עד 10 דגימות עבור כל מבחנת eend orph, כך שיהיו פחות מבחנות מהן יש להפיק DNA גנומי. השתמש בערכה לטיהור DNA מעלי צמחים master pure כדי להפיק את ה-DNA הגנומי. ניתן להשיג כימות של ה-DNA הגנומי שהופק מכל דגימה באמצעות NanoDrop.לאחר מכן, שלבו כמות שווה של DNA מכל דגימה עד לסך של 300 nanograms, תוך שמירה על הפרדה בין דגימות המוטנט לסוג הפרא (wild type) לצורך ביצוע תגובת הסימון תחילה; הוסיפו 60 µL של תמיסת random primer בריכוז 2.5 x ו-42 µL של מים. לאחר דנטורציה של ה-DNA בטמפרטורה הגבוהה מ-95 °C למשך חמש עד 10 דקות, קבעו את הדגימות על קרח כדי להשלים את דנטורציית ה-DNA. הוסיפו 15 µL של 10 X DN tps.ערבבו עם biotin DCTP והשלימו לשלושה µL של polymerase. הדגירו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 25 °C.ביום למחרת, הוסיפו 15 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-400 µL של 100% Ethanol קר. דגרו את הדגימות המעורבבות בטמפרטורה של 80°C- למשך שעה, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה במהירות של 20,500 ×g למשך 15 דקות. שטפו את המשקע ב-500 µL של 75% ethanol קר לאחר סבב סנטריפוגה שני.ייבשו את משקעי ה-DNA בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. השביו את המשקעים ב-100 µL של מים והשתמשו ב-5 µL לבדיקת התנובה והאיכות באמצעות ג'ל אגרוז. תגובות סימון אקראי ראשוניות הועמסו על ג'ל אגרוז בריכוז 1% מתוך מאגר של צמחי F2 מסוג בר ומתוך מאגר של צמחי F2 מוטנטים.כשלב סופי, העבירו 95 µL של תגובת הסימון של סוג הבר (wild type) והמוטנט עבור הכלאת מערך הגנום של gene chip arabidopsis ath one. לאחר סריקת ה-eraser, קובצי ה-dot CL שהתקבלו מנותחים באמצעות התוכנה שלנו. לאחר התקנת התוכנה, פתחו את התוכנית והדביקו את מחרוזת ה-bioconductor המופיעה בנוהל הכתוב.לאחר מכן לחצו על מקש ה-Enter, שיבצע התקנה של חבילות BIOCONDUCTOR הסטנדרטיות מאתר ה-array, genotyping and mapping. הורידו וחלצו את הקבצים המפורטים בטקסט לתיקייה חדשה בשולחן העבודה. שמרו את הנתונים שהתקבלו מניסוי השבב הגנטי עבור wild type C, L ו-mutant C. כעת העתיקו את נתוני השבב הגנטי עבור wild type C ו-mutant C אל התיקייה.בשלב הבא, פתחו את R במחשב PC. לחצו על file ולאחר מכן על change directory. בחרו את התיקייה המכילה את הקבצים, לחצו על file load workspace, ולאחר מכן בחרו ב-A one V five R data open read C do R באמצעות notepad והעתיקו את כל הטקסט ל-R. עבור מחשב Mac, לחצו על mis ולאחר מכן על change working directory.בחרו את התיקייה המכילה את הקבצים. לחצו על workspace load workspace file ובחרו ב-ATH one V five R data. באופן דומה, פתחו את SFP R ואת MAP R באמצעות text, edit והעתיקו את הטקסט אל R בחלון ה-console.תוצג הודעה לחיפוש גנים במאגר המידע של Arabidopsis או TAIR. העתיקו והדביקו את הקישור המופיע בטקסט בדפדפן האינטרנט. ייפתח חלון שיבקש לפתוח או לשמור את הקובץ.בחרו בשמור. בחרו שם לקובץ והוסיפו את הסיומת. בצעו x ls.לאחר מכן לחצו על שמירה (save). מוצגת כאן תוצאה טיפוסית צפויה. לאחר ניתוח הנתונים שהתקבלו ממערך גנום Arabidopsis H one, איור זה מייצג דוגמה למיפוי של מוטציית Columbia zero באמצעות שבב גנים של Arabidopsis, היברידיזציה של גנום H one, כאשר הפסים האופקיים מייצגים את ספי הגילוי.המוטציה בדוגמה זו ממוקמת על כרומוזום 1, ומוגדרת באמצעות קווים אנכיים. פתחו את הקובץ dot XLS כדי למצוא את הקואורדינטה של המוטנט בתוך האזור הממופה. בקריאות ה-Illumina המורכבות של גנום המוטנט, זהו מעברים (transitions) ספציפיים של EMS בקרב פולימורפיזמי הנוקלאוטיד הבודד (SNPs).לאחר השליטה בגישה, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר זה למיפוי גנים בפרק זמן קצר יותר בהשוואה לשיטת המיפוי הקלאסית.

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של זיהוי גודל פלואורסצנטי כדי לסנן יציבות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-התיך חלבון ממברנה ב- Escherichia coli לאחר מסיסות חומרי ניקוי. חלבונים המציגים שיא סימטרי בפרופיל אי הכללת הגודל עם מעט או ללא GFP חופשי מצביעים על חלבונים מטוהרים עם מינימום פירוק וצבירה, אשר לאחר מכן ניתן לבחור אותם לניתוח מבנה-פונקציה.

כרומטוגרפיה של זיהוי פלואורסצנטיות של אי הכללת גודל: טכניקה לזיהוי שלמות חלבוני הממברנה הפלואורסצנטית בעת מסיסות חומרי ניקוי

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיית מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות מרובות של C. elegans במהלך ההזדקנות.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

חקור זיהוי גנים המשמרים את שלמות האברונים בצמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וריצוף דור-הבא. שיטה זו מאפשרת למיפוי מוטציות רצסיביות ולמציאת גנים קריטיים לביולוגיה תאית.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

גלה סרטונים נוספים