פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

מטרת ניסוי זה היא לזהות את הגן או הגנים האחראים לשלמות המורפולוגית והתפקודית של אברוני הצמח. זה מושג על ידי הוספת אתל מתאן סולפונאט כחומר כימי לזרעי אטופיה מוטגניים הנושאים את הסמן הפלואורסצנטי של האברון. השלב השני הוא איסוף זרעים מצמחים בודדים מדור המוטגנים הראשון כדי לגדל קווים של הדור המוטנטי הבא M שתיים.

לאחר מכן, זרעי המוטגן א אליאנה נצפים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנטי כדי לזהות את הפנוטיפ האורגני החריג. השלב האחרון הוא ליצור את דור המוטגן השלישי ולאשר את נוכחותו של הפנוטיפ המוטנטי. בסופו של דבר, ניתן למפות את המוטציה הרצסיבית באמצעות כלי ריצוף מהדור הבא.

לאחר זיהוי המיקום של הגן המוטנטי, טרנספורמציה עם הגן מסוג הבר אמורה לשחזר את הפנוטיפ האורגני החריג. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשמירה על שלמות מורפולוגית ותפקודית של אברוני הצמח. אטיל מתאן, טיפול סולפונאט על גבי זרעי סטה גורמים לשינויים בתזמון ציטוזין בגנום וכתוצאה מכך ציטוזין גוואן לתזמון.

הוספת מוטציות. טיפול EMS הוא שלב מפתח בפרוטוקול זה כדי להבטיח מוטציה ביחס מושלם בתוך M שני אנשים. כדי להתחיל להשיג זרעי Arabidopsis מסוג קולומביה אקוטייפ פראי שתוכננו בעבר לשאת סמן פלואורסצנטי רלוונטי של אברון .

מעבירים 0.8 גרם או כ-40,000 זרעים לצינור בז של 50 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 25 מיליליטר מים מזוקקים ו-0.2% אתל מתאן סולפונט. דגרו את התערובת למשך 16 שעות על מערבל מוטציה במהירות נמוכה לאחר הדגירה, שאפו את הנוזל והשליכו אותו לתוך פלאס המכיל נתרן הידרוקסיד מולארי אחד.

כדי לנטרל את ה-EMS, הוסף 25 מיליליטר מים לצינור הבז המכיל את הזרעים. סוגרים את הצינור והופכים חמש פעמים כדי לשטוף את הזרעים. לאחר שכל הזרעים התייצבו, שאבו את המים והשליכו לתוך בקבוק נתרן הידרוקסיד טוחנת אחת.

חזור על שלב כביסה זה עד 10 פעמים לאחר הכביסה הסופית, ריס מוציא את הזרעים בכמות מינימלית של מים. המשך לעיקור זרעים על ידי הוספת 25 מיליליטר של 10% אקונומיקה וניעור נמרץ למשך 30 שניות. לאחר שהזרעים מתיישבים לתחתית, שפכו את האקונומיקה ושטפו עם 25 מיליליטר מים סטריליים.

לאחר הסרת המים הסטריליים, יש להוסיף 25 מיליליטר של אתנול 70%. מנערים את הצינורות למשך 30 שניות ומניחים לזרעים להתיישב לתחתית. שופכים את האתנול ושוטפים עם 25 מיליליטר מים סטריליים.

חזור על שטיפת המים הסטרילית פעמיים. לאחר מכן שפכו את הזרעים על צלחת פטרי מפלסטיק המכילה נייר פילטר של שלושה מ"מ. הניחו לזרעים להתייבש מתחת למכסה המנוע לאחר דגירה של הזרעים במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס.

מניחים את הזרעים בצלחת פטרי בגודל 150 מילימטר בכ-250 עד 300 זרעים לצלחת בחצי מגי ומדיום סקוג המכיל ג'ל קרב. כחומר ג'לינג, גדלו את הזרעים מדור M1 על צלחות למשך שבועיים. השתל את השתילים לאדמה ואפשר לצמחים להמשיך לצמוח.

לאחר 30 עד 45 יום, הצמחים יגיעו לשלב הבוגר שבו הם מתבגרים, כך שניתן לראות נזילות בבירור. בשלב זה, אספו M שני זרעים מצמחי M1 בודדים כדי ליצור 1000 קווים M שני עצמאיים. על מנת להתבונן בשתילים במיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנטי, גדלו 60 זרעים מכל קו M שני במשך שבעה עד 10 ימים על צלחות פטרי מפלסטיק לשניים.

מדיום מוריש וסקוג המכיל ג'ל קרב מגדלים גם חמישה שתילים של בקרת EMS לא מטופלת על אותה צלחת. לאחר גידול השתילים, הרכיבו חמישה עד 10 מובילים עם צד אטם ABAC לכיוון עדשת 40 פעמים על שקופית מיקרוסקופ וסגורים בהחלקת כיסוי מתחת לפלואורסצנטיות, התבונן בכל אולאין מהאזור הקורטיקלי למדיאלי להפצה תת-תאית משתנה של סמן האברון. לאחר השתלת צמחים חיוביים באדמה וגידול שהשתילים כפי שתוארו זה עתה, מאשרים שהפנוטיפ המוטנטי נמצא בדור M שלוש.

הסר את מוטציות הרקע המזהמות באמצעות הצלבה לאחור לפחות שלוש פעמים לגנום מסוג פרא המכיל את הסמן הפלואורסצנטי האורגני הרצוי כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל במיפוי, השתמש בערכת מיני צמח cogen DN Easy Z כדי לחלץ כשלושה מיקרוגרם של DNA גנומי מ-M שלוש, המייצג את ה-DNA המוטנטי ההומוזיגוטי של קולומביה. שלח את ה-DNA הזה עבור מנתח הגנום של Illumina שני ריצוף 14.

השלב הבא הוא לחצות את מוטנט הזאגו קולומביה וויל לאס ברגר כדי ליצור את הצאצא היחיד לאחר האבקה עצמית שבו השילוב יכול להתרחש. יצירת השיניים החירשות תיווצר ובסופו של דבר תשמש כאוכלוסיית מיפוי המכילה את הגן המעניין, הגורם למוטציה. על ידי השוואת ה-DNA הגנומי של אוכלוסייה זו עם ה-DNA הגנומי של צמחים מסוג באר, ניתן לזהות את מיקום המוטציה בגנום.

לאחר צמיחת שני צמחי F, אספו בין 70 ל-100 F שני פרטים המציגים את הפנוטיפ החריג ומספר זהה של F שני צמחים עם פנוטיפ מסוג בר, אספו דיסק עלים מכל צמח באמצעות אגרוף שלם. יש לאסוף את דיסק העלים מעלים באותו גיל. כדי להבטיח כמויות דומות של DNA, ניתן לעבד את הדגימות למיצוי גנומי בנפרד או בקבוצות.

במקרה זה, ניתן לאסוף חמש עד 10 דגימות עבור כל צינור אורף eend כך שיהיו פחות צינורות שמהם יש לחלץ DNA גנומי. השתמש בערכת טיהור ה-DNA של עלי הצמח הטהורים כדי לחלץ את ה-DNA הגנומי. לאחר מכן ניתן לכמת את ה-DNA הגנומי המתקבל מכל דגימה באמצעות NanoDrop.

לאחר מכן שילוב כמות שווה של DNA מכל דגימה עד לסך של 300 ננוגרם תוך שמירה על דגימות מוטנטיות ופראיות נפרדות כדי לבצע את תגובת התיוג תחילה, להוסיף 60 מיקרוליטר של תמיסת פריימר אקראית פי 2.5 ו-42 מיקרוליטר מים. לאחר דנטורציה של ה-DNA בטמפרטורה של יותר מ-95 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות, קראו לדגימות על הקרח כדי לפרק את ה-DNA. הוסף 15 מיקרוליטר של 10 X DN tps.

ערבבו עם ביוטין DCTP והשלימו עם שלושה מיקרוליטר. גלן פולימראז. דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

למחרת מוסיפים 15 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט טוחנת ו -400 מיקרוליטר אתנול 100% קר. דגרו את הדגימות המעורבות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר צנטריפוגה ב-20, 500 פעמים G למשך 15 דקות. שוטפים את הגלולה עם 500 מיקרוליטר אתנול קר, 75% לאחר סיבוב שני.

יבש את כדורי ה-DNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השהה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר מים והשתמש בחמישה מיקרוליטר כדי לבדוק את התפוקה והאיכות על ביו ג'ל. תגובות תיוג אקראיות ראשוניות הועמסו על ג'ל 1% aros ממאגר של צמחי בר מסוג F שני צמחים ומבריכה של שני צמחים מוטנטיים F.

כצעד אחרון, שלח 95 מיקרוליטר של תגובת תיוג מסוג פרא ומוטנטי עבור שבב הגנים arabidopsis עם הכלאה של מערך גנום אחד. לאחר סריקת המחק, קבצי הנקודות CL המתקבלים מנותחים באמצעות התוכנה שלנו. לאחר התקנת התוכנה שלנו, פתח את התוכנית והדבק את מחרוזת המוליכים הביולוגיים שנמצאת בהליך הכתוב.

לאחר מכן לחץ על מקש ההחזרה, שיתקין את חבילות ה-BIOCONDUCTOR הסטנדרטיות מאתר המערך, הגנוטיפ והמיפוי. הורד ופתח את הקבצים המפורטים בטקסט לתיקיה חדשה בשולחן העבודה. השאר את הנתונים שהתקבלו מניסוי שבב הגנים לסוג C, L ומוטציה C.כעת העתק את נתוני שבב הגנים עבור סוג C ומוטציה C פראית לתוך התיקיה.

לאחר מכן, פתח את R למחשב. לחץ על קובץ ולאחר מכן לחץ על שינוי ספריה. בחר את התיקיה המכילה את הקבצים, לחץ על סביבת העבודה של טעינת הקבצים ולאחר מכן בחר A V 5 R נתונים פתוחים לקרוא C do R באמצעות פנקס רשימות והעתק את כל הטקסט ל- R עבור Mac, לחץ על mis ולאחר מכן לחץ על שנה ספריית עבודה.

בחר את התיקייה המכילה את הקבצים. לחץ על workspace load workspace file ובחר ATH one V five R data. באופן דומה, פתח גם את SFP R וגם את MAP R באמצעות טקסט, ערוך והעתק את הטקסט ל-R בחלון המסוף.

תופיע הודעה לחיפוש גנים במשאב המידע Arabidopsis או TAIR. העתק והדבק את הקישור שנמצא בטקסט בדפדפן האינטרנט. יופיע חלון ויבקש לפתוח או לשמור את הקובץ.

בחר שמור. בחר שם קובץ וצרף את הסיומת. האם ?? ls.

לאחר מכן לחץ על שמור. מוצגת כאן תוצאה טיפוסית צפויה. לאחר ניתוח הנתונים שהתקבלו ממערך הגנום של שבב הגנים Arabidopsis H one, איור זה מייצג דוגמה למיפוי של מוטציה אפס קולומביה באמצעות שבב הגנים Arabidopsis, הכלאה של גנום H one, כאשר הפסים האופקיים מייצגים את הסף לזיהוי.

המוטציה בדוגמה זו ממוקמת על כרומוזום אחד, תחום על ידי פסים אנכיים. פתח את הקובץ נקודה XLS כדי למצוא את הקואורדינטות עבור המוטאנט בתוך האזור הממופה. בקריאות Illumina המורכבות של הגנום המוטנטי, זהה מעברי EMS ספציפיים בין הפולימורפיזמים של הנוקלאוטידים הבודדים.

לאחר השליטה בגישה המתארת פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי למפות גן שלוש מסגרת זמן קצרה בהשוואה לשיטת המיפוי הקלאסית.