זיהוי ביטוי אנזימי מטרה בתאים חיידקיים מהונדסים גנטית

התחל עם צינורות המכילים תאי חיידקים מהונדסים גנטית. כל חיידק נושא פוסמידים בעלי עתירות גבוהה שמקודדים אנזימים שונים.

דגרו את הצינורות עם ניעור כדי להקל על ביטוי של אנזימים תוך-תאיים שונים.

הוסיפו סובסטרט ייעודי לאנזים המטרה למבחנה והוסיפו נפח שווה של בופר לצינור הבקרה.

תדגר עם רעידות. הסובסטרט נכנס לתאים, שם האנזימים המטרה חותכים אותו ויוצרים מוצר פלואורסצנטי.

טעין את צינור הבקרה לתוך ציטומטר זרימה מכויל מראש.

כאשר כל תא עובר דרך קרן לייזר, הוא מפזר אור. צרו גרף פיזור לזיהוי תאים בודדים, שמפזרים פחות אור מאשר גושים.

להוציא את גושי התאים, ולשרטט את אות הפלואורסצנציה של התאים הבודדים כדי לקבוע פלואורסצנציה בסיסית.

הניחו את הצינור המטופל בסובסטרט בציטומטר הזרימה כדי למדוד את אות הפלואורסצנציה.

אות פלואורסצנציה מוגבר בתאים שטופלו בסובסטרט בהשוואה לתאי הביקורת מאשר את ביטוי האנזים היעד.

כדי לסנן את האנזימים המטאגנומיים הרלוונטיים, דגרו את התאים הממוינים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד עד שה-OD₆₀₀ מגיע ל-0.5. לאחר מכן מוסיפים 1 מיקרוליטר של תמיסת השראת העתק כדי להעצים את מספר העותקים התוך-תאי.

לאחר שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד, משלבים 0.5 מיליליטר של התאים עם המצע המתאים בצינור תחתית עגולה בנפח 14 מיליטר לריכוז סופי של 100 מיקרומולר. לאחר מכן דגרו את דגימות הביקורת והניסיוניות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך שלוש שעות נוספות.

בזמן שהדגימות רועדות, הגדר את פרמטרי מכונת ה-FACS כפי שהוצג זה עתה. לאחר מכן, הוסיפו 5 מיקרוליטר של תאים מכל דגימה לצינורות בודדים בגודל 5 מיליליטר עם תחתית עגולה המכילות 1 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, טעינו את תאי הדגימה והגדרו את קצב האירועים ל-1000 עד 3000 אירועים בשנייה.

צור תרשים פיזור אזור פיזור קדמי בקנה מידה לוגיתמי לעומת אזור פיזור צדדי בקנה מידה לוגריתם, והתאם את שער הפיזור R1 כך שיכלול את תאי האירוע החיידקיים היחידים. לאחר מכן יוצרים תרשים פיזור קדמי בקנה מידה לוגריתמי לעומת פיזור שטח FITC בקנה מידה לוגריתמי וקבע שער מיון R2 כך שפחות מ-0.1% מהתאים השליליים יזוהו. כעת, טען את צינור הדגימה וכוון את קצב האירוע ל-1000 עד 3000 אירועים בשנייה, לפי הצורך.