זיהוי ביטוי אנזימי מטרה בתאים חיידקיים מהונדסים גנטית
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:01 דק׳ • November 28th, 2025
התחל עם צינורות המכילים תאי חיידקים מהונדסים גנטית. כל חיידק נושא פוסמידים בעלי עתירות גבוהה שמקודדים אנזימים שונים.
דגרו את הצינורות עם ניעור כדי להקל על ביטוי של אנזימים תוך-תאיים שונים.
הוסיפו סובסטרט ייעודי לאנזים המטרה למבחנה והוסיפו נפח שווה של בופר לצינור הבקרה.
תדגר עם רעידות. הסובסטרט נכנס לתאים, שם האנזימים המטרה חותכים אותו ויוצרים מוצר פלואורסצנטי.
טעין את צינור הבקרה לתוך ציטומטר זרימה מכויל מראש.
כאשר כל תא עובר דרך קרן לייזר, הוא מפזר אור. צרו גרף פיזור לזיהוי תאים בודדים, שמפזרים פחות אור מאשר גושים.
להוציא את גושי התאים, ולשרטט את אות הפלואורסצנציה של התאים הבודדים כדי לקבוע פלואורסצנציה בסיסית.
הניחו את הצינור המטופל בסובסטרט בציטומטר הזרימה כדי למדוד את אות הפלואורסצנציה.
אות פלואורסצנציה מוגבר בתאים שטופלו בסובסטרט בהשוואה לתאי הביקורת מאשר את ביטוי האנזים היעד.
כדי לסנן את האנזימים המטאגנומיים הרלוונטיים, דגרו את התאים הממוינים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד עד שה-OD600 מגיע ל-0.5. לאחר מכן מוסיפים 1 מיקרוליטר של תמיסת השראת העתק כדי להעצים את מספר העותקים התוך-תאי.
לאחר שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד, משלבים 0.5 מיליליטר של התאים עם המצע המתאים בצינור תחתית עגולה בנפח 14 מיליטר לריכוז סופי של 100 מיקרומולר. לאחר מכן דגרו את דגימות הביקורת והנ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים