Name: להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למד מיקרוסקופיית ספינינג דיסק TIRF מתקדמת לדימות תאים חיים תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת הדמיה מהירה של ממברנת התא ולוקליזציה מדויקת של חלבונים בקרום התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מאוד הקהילה המדעית של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים לתמיכה אותנו עם דגימות להערכה. כלומר, אנחנו תודה סבין Windhorst תאי NIH3T3, אנדריאה Mordhorst עבור YFP-Vinculin ו- Maren רודולף עבור RFP-Lifeact.

1. הכנת תאים
<ol><li>יומיים לפני הניסוי, זרע תאים 3 * 105 הלה או NIH3T3 2 מ של מדיום הגידול מלא בכל טוב של צלחת 6-ובכן תא-תרבות. ודא כי התאים מתבצע במסגרת תא למינארי לאורך כל פרוטוקול זה.</li>
	<li>יום אחד לפני הניסוי, הכן את ריאגנטים תרביות תאים על פי ההמלצות של היצרן או פרוטוקול מדעית נחוש, למשל:<ol>
<li>למהול 1 µg של RFP-Lifeact, 1 µg של YFP-Vinculin סך של 200 µL מופחת סרום בינוני. מערבולת הכימית תרביות תאים בקצרה, להוסיף 4 µL 200 µL DNA ו מערבולת שוב. דגירה המיקס תרביות תאים למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף את המיקס כולו תרביות תאים dropwise ישירות אל התאים. לערבב ע י ניעור לצלחת ומניחים אותו בחזרה לתוך החממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום של הניסוי, הכן את הדגימה עבור הדמיה בשידור חי:<ol>
<li>להכין פתרון µg/mL 10 של fibronectin ב- PBS כדי להרגיע את משטח זכוכית צלחת תחתית זכוכית 35 מ מ. השתמש רק באיכות גבוהה 0.17 מ מ coverslips זכוכית דקה לקבלת ביצועים מיטביים TIRF והימנע מנות התחתון מפלסטיק. לעזוב הפתרון על משטח הזכוכית של פני השטח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר אותו ולתת המנה מילה נהדרת...</li>
		<li>לדלל פתרון חרוזים מרובי פלורסנט מיקרומטר 0.1 צפיפות של 1.8 x 10 חלקיקים9 לכל מ ל מים מזוקקים ולהוסיף את הפתרון עבור 30-60 s השטח מצופים fibronectin זכוכית. להסיר לאלתר את הפתרון, מילה נהדרת לתת המנה. הערה: השלב זה נחוץ רק אם המטוס TIRF צריך להימצא לפני זריעה תאים ו/או לרכוש תמונת ייחוס 2-צבע לרישום תמונה המבוססת על חרוז.</li>
		<li>להכין פתרון חומצה אסקורבית (AA) 0.1 M, למהול אותו כדי ריכוז סופי של 0.1 מ"מ מדיום הגידול (AA-בינוני). מקם את הפתרון באמבט מים 37 º C. הערה: השתמש תא הממוטבים פלורסצנטיות תרבות בינוני במידת האפשר, כזה כמו ללא phenolred, (ribo-) בינוני פלווין-מופחתת. AA הוא סוכן אנטי מחמצן שיכולים להפחית תופעות פוטוטוקסי במהלך דימות חיים14. בדקנו אותה בהצלחה ב- assay זו, דהיינו עוד תאים הופיע בריא בתנאים להחיל יותר ללא תוספת AA. עם זאת, ה-pH של המדיום הונמך 0.17 יחידות pH.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS, להוסיף 250 µL טריפסין-EDTA ולחכות עד התאים הם לגמרי מנותק (2-3 דקות בתוך חממה 37 ° C). Resuspend התאים בזהירות 1 מ"ל מראש חימם AA-בינוני עם פיפטה ולהוסיף אותו 4 מ ל AA-בינוני בשפופרת התרבות התא 15 מ"ל. מקום התליה תא עם מכסה פתוחה מעט אינקובטור נקבע ל- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באזור המיקרוסקופ.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל מראש חימם AA-בינוני למנה התחתון זכוכית ולמקם אותו האוחז המיקרוסקופ מחומם מראש (ראה סעיף הבא).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הדמיה חיה
<ol><li>הפעל שליטה סביבתי של המיקרוסקופ להשגת יציבה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ואווירה לח. הערה: כאן, תא הדגירה העליון במה קטנה כבר בשימוש בהגדרות יציב מותרים בתוך כ-15 דק חממות גדול יותר יהיה עליך עוד פעם כדי להשיג תנאים יציבים.</li>
	<li>לתקן את כל ההגדרות רכישה בהמיקרוסקופ לפני התליה תא מוחל:<ol>
<li>להגדיר את מרווח הזמן 30 s וכן את משך הזמן עד 60-90 דקות להפעיל את הפונקציה מיקוד אוטומטי של מבוססי חומרה-מיקוד האוטומטי על כל נקודת זמן (ערך "1").</li>
		<li>להתאים את החשיפה מצלמה, רווח, כמו גם את עוצמת הלייזר עבור כל ערוץ. רווח גבוה רמות, לייזר נמוך עוצמה וזמן חשיפה נמוכה recommendable להפחית רעילות צילום. הערה: הנתונים המוצגים כאן נרכשה עם חשיפה 200 ms, להשיג רמה 500 ו- 20% לייזר כוח השווה לעירור עוצמות של 0.5 W/cm ² עבור 488 ננומטר, 1 W/cm ² עבור 561 nm, בהתאמה.</li>
		<li>הגדר הערימה-z עבור הערוצים ספינינג-disk 10 מיקרומטר עם מרווח מיקרומטר 0.4. בטל את הבחירה להפעיל z-ערימות עבור הערוצים TIRF. ההיסט התחתון מוגדר "0", כלומר המישור הנמוך יהיה המיקום המוקד של פוקוס האוטומטי חומרה.</li>
		<li>להפעיל את הפונקציה multi-point "הבמה עמדות". הערה: עד 3 עמדות ניתן להקליט במרווח זמן s 30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למצוא את החרוזים פלורסנט עם תאורה פלורסנט-אפי את העינים או על גבי מסך המחשב, ולאחר מכן להפעיל את ערוץ TIRF אחד, לקבוע את זווית תאורה לערך מציין TIRF תאורה. להפעיל את פוקוס האוטומטי על-ידי לחיצה על הכפתור בלוח מיקרוסקופ והתאימו את המוקד עם ההגה היסט. רוכשים של הנתונים (dataset) 2-צבע, כלומר TIRF-488, TIRF-561, לרישום תמונה המבוססת על חרוז עוקבות (ראה הצבע 3.1).<ol>
<li>אופציונלי: כדי להבטיח תאורה TIRF, הוסף כמה microliters של ההשעיה חרוזים ססגוניות פלורסנט בחופשיות צף (ראה הצבע 1.3.2.). הפעל את התצוגה בשידור חי של ערוץ TIRF ולהגדיל את זווית תאורה. החרוזים שאינם מחסידי ייעלמו מעבר הזווית הקריטית, הקפדה על תאורה נכונה TIRF8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לערבב התליה תא שוב על ידי היפוך הצינור סגור 2 - 3 פעמים, ולהחיל 1 מ"ל של התאים על המנה הדמיה.</li>
	<li>למצוא במהירות כפולה-transfected תאים עם תאורה epi-פלורסנט ברמה נמוכה. מרכז את התאים בתצוגה המקדימה מצלמה בשידור חי באמצעות תאורה שדה בהיר, לסמן את המיקום. למצוא עוד 1-2 נקודות עניין ולשמור אותם לרשימת עמדות. הערה: בהתחלה, התאים בקלות ניתן לנתק עקב התנועה הבמה, ומכאן להגדיר עמדות 4-5, לבדוק מחדש כל לפני תחילת ייבוא תמונות. לאחר מכן, להתעלם 1-2 עמדות.</li>
	<li>התחל הנתונים על-ידי לחיצה על כפתור "רצף".</li>
</ol>3. התמונה שלאחר עיבוד ב- ImageJ
<ol><li>על מנת ליצור hyperstack ללא רישום של פיג'י15, מאקרו בשם "SD-TIRF_helper" נכתב כי ניתן ליישם datasets timelapse SD-TIRF של ערוץ 2-4. שמור את הקובץ "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" בפיג'י תיקיית משנה "מאקרו", הפעל את המאקרו באמצעות לחיצה על פקודת התפריט "תוספים > פקודות מאקרו > הפעל...".<ol>
<li>אם ערוצי הצבע צריך תיקון הרישום, בחר באפשרות צור הפניה חדשה המבוססת על חרוז רישום (קובץ. ציון) או להשתמש בקובץ קיים שנוצר לפני. הערה: ה-plugin turboreg16 יוחלו על ידי קרינה פלואורסצנטית חרוזים הפניה תמונות. התקן את התוסף פיג'י תוכנה על פי הנחיות כלליות עבור תוסף התקנות.</li>
		<li>לייבא את הנתונים עם היבואן ביו-תבניות ובחר hyperstack כאפשרות הצפייה. לטעון את התמונה ערכת הנתונים, בחר סדרת ה SD-הצעד הראשון, סדרת ה-TIRF בשלב השני. פיג'י יציג את הנתונים הממוינים לפי ערוץ ואת הבמה עמדה, כלומר בדרך כלל כל SD-ערוצי, TIRF כל-הערוצים יופיע כמו hyperstack אחת עבור כל מיקום הבמה שנבחר. הערה: ייבוא נתונים אפשרית על סוגי קבצים שונים, למשל סדרת-TIFF או קובץ תלויי פלטפורמה סוגי כגון * .nd. ניתן לזיהוי סוג הקובץ רק אם זה לא יוצאו על ידי רכישת תוכנת בתור עצמאית, דחיסה-פחות בתבנית TIFF.</li>
		<li>להחיל את התיקון רישום על הערוצים בהתאמה על-ידי טעינת קובץ ציוני שנקבע מראש.</li>
		<li>בחר את טבלת חיפוש צבעים בצבע הרצוי (LUT) עבור כל ערוץ SD - ו TIRF, למזג אותן hyperstack יחיד, רב-מימדי. הערה: במהלך העיבוד של ערוצי TIRF, מספר z-מטוסים עם אפס ערכי העוצמה מתווספות על גבי המישור התחתון שתואם עם המספר של z-מטוסים ב- SD dataset. שלב זה חשוב עבור הפריט החזותי של hyperstack הסופית. מתודולוגיה זו נכונה, מאז עומק התאורה TIRF (פחות מ- 200nm7) הוא קטן יותר מהגודל z-צעד של הערימה SD (400 ננומטר).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li>
<li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).</li>
<li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li>
<li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li>
<li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+%CE%B1-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li>
<li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
<li>Chen, B. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li>
<li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

נייר זה הוצג יישומו המוצלח הראשון של מיקרוסקופיית SD ו- TIRF תצורה מתאים לביצוע ניסויים הדמיה התא בשידור חי, כלומר רכישה גבוהה המחירים כגון 2 SD-TIRF אוספי תמונות לדקה בשלב שונה 3 עמדות, המקביל סך של מסגרות 168 (בסביבות 3 מסגרות לשנייה), נרכשו. מיקרוסקופים SD-TIRF כמה שהיו שתוארה לעיל12,13, בעיקר חוסר מהירות הדמיה גבוה מספיק כדי לעקוב אחר תהליכים תאיים תלת-ממד שבו רזולוציה טמפורלית של פחות מ 2 s לכל תמונה מחסנית הוא לעתים קרובות הכרחי. הגדרת שהוצגו ניתן ...

הימים שלנו, מיקרוסקופ אור טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה/סופר ב קבוע מתן הדגימה החיה מפתחים במהירות. סופר-רזולוציה טכניקות כגון גירוי פליטה דלדול (STED), הבנוי תאורה מיקרוסקופ (SIM), צילום-הפעלת מיקרוסקופ לוקליזציה (דקל) או מיקרוסקופית ישירה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה), בהתאמה, הם זמינים מסחרית ולאפשר הדמיה של מבנים subcellular מציג פרטים כמעט על סולם מולקולרית1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה עדיין מוגבלת הישימות לניסויים הדמיה בשידור חי, שבו צריך כמויות גדולות, ניתן לאבחן עם מספר מסגרות לכל השני מהירות הרכישה. סוגים שונים של תהליכים דינאמיים מאוד מוסדרים דרך קרום פלזמה, למשל אנדו- / אקסוציטוזה, הדבקות, העברה או איתות, מתרחשות במהירות גבוהה תוך תאית בנפחים גדולים. לאחרונה, על מנת למלא את הפער הזה, טכניקה משולבת מיקרוסקופ היה המוצע ספינינג שנקרא דיסק-TIRF (SD-TIRF)7. בפירוט, מיקרוסקופ TIRF היתרי במיוחד לבודד, בתרגום של קרום פלזמה8,9, בעוד SD מיקרוסקופ הוא אחד של רגיש ביותר ומהיר לחיות טכניקות הדמיה הדמיה ומעקב של organelles subcellular10,הציטופלסמה11. השילוב של שתי טכניקות הדמיה בכיוונון יחידה כבר כבר הבנתי את העבר12,13, לעומת זאת, המיקרוסקופ המובאת כאן (איור 1) סוף סוף עונה על הקריטריונים כדי לבצע ניסויים SD-TIRF הדמיה בשידור חי התהליכים הנ ל- 3 מסגרות לכל השני מהירות. מאז מיקרוסקופ זה זמין מסחרית, המטרה של כתב יד זה היא לתאר בפרטים ולספק כלי קוד פתוח ופרוטוקולים ייבוא תמונות, רישום של ויזואליזציה הקשורים עם מיקרוסקופ SD-TIRF.
הגדרת מבוסס על מיקרוסקופ הפוכה מחוברת סריקה שתי יחידות באמצעות יציאות עצמאיות - הנמל שמאל קשורה יחידת SD והנמל בחזרה את יחידת הסורק עבור TIRF וצילום-הפעלה/הלבנת-ניסויים. עד 6 לייזרים (405/445/488/515/561/640 ננומטר) יכול לשמש עירור. עבור עירור וזיהוי של האות פלורסצנטיות, או 100 x / NA1.45 שמן או 60 x / NA1.49 שמן TIRF המטרה, בהתאמה, יש כבר מועסקים. האור הנפלט הוא מפוצל על ידי מראה ודיקרואיק זוהר (561 nm פס ארוך או לונג nm 514-מעבר...), מסוננים על ידי הלהקה לעבור מסננים שונים (55 ננומטר רחב מרוכז בכל 525 nm, 54 nm רחב מרוכז בכל 609 ננומטר על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק ואדום, בהתאמה) הניח לפני EM-CCD מצלמת שני תקופות. הינכם מתבקשים לשים לב כי לקבלת פרטים טכניים נוספים אודות הגדרת רשומים Zobiak. et al. 7. בתצורה TIRF, יחידת SD עזב את נתיב האור בתוך בערך 0.5 s כך שתי מצלמות אותו יכול לשמש לצורך זיהוי, ומאפשר מעבר מהיר יותר בין שתי שיטות הדמיה בהשוואה בסביבות 1 s שדווח בעבר13 < /c2 >. תכונה זו מאפשרת רכישה סימולטני ערוץ כפול, ובכך 4 ערוצי SD-TIRF הדמיה ב בעבר לא תואמות מהירות, דיוק יכול להתבצע. יתר על כן, יישור בין תמונות SD ו- TIRF אינה נחוצה. יישור תמונה בין שתי מצלמות, אך יש לבדוק לפני תחילת הניסוי, תוקן במידת הצורך. בפרוטוקול הבא, שיגרה תיקון הרישום בוצע במאקרו ImageJ עצמית בכתב. יתר על כן, המאקרו בעיקר נועדה לאפשר ויזואליזציה סימולטני של SD, TIRF datasets למרות שלהם dimensionality שונים. רכישת התוכנה עצמה לא סיפקו תכונות אלה.

<table><tbody><tr><td><חזק>מיקרוסקופ ואביזרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-TIRF מיקרוסקופ</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti עם מערכת מיקוד מושלמת</td><td>מעמד מיקרוסקופ הפוך</td><td>ניקון</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 T2</td> יחידת דיסק מסתובבת <td>Yokogawa</td><td></td><td>בתצורת מצלמה כפולה</td></tr><tr><td>iLAS2&nbsp;</td><td>סורק Roper Scientific</td><td></td><td>TIRF/FRAP</td></tr><tr><td>Evolve&nbsp;</td><td>פוטומטריקס</td><td></td><td>EM-CCD מצלמות</td></tr><tr><td>PiezoZ שלב</td><td>Ludl מוצרים אלקטרוניים</td><td></td><td>ממונע Z שלב</td></tr><tr><td>Bioprecision2 XY שלב</td><td>Ludl מוצרים אלקטרוניים</td><td></td><td>ממונע XY שלב</td></tr> תא <tr><td>הדגירה העליון</td><td>Okolab</td><td>Bold Line</td><td>טמפרטורה, CO2 ואספקת לחות</td></tr> <tr><td><חזק>תרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי סרטן צוואר הרחם</td><td>HeLa DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 פיברובלסטים</td><td>DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS) של Dulbecco</td><td></td> <td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM</td><td>)Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>סרום מופחת בינוני</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (PenStrep)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גדילה מלא (DMEM בתוספת 10% FCS ו-1% PenStrep)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td>Transfection מגיב</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית (AA)</td> <td>Sigma</td><td>A544-25G</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 6 בארות</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>35 מ"מ, כיסוי זכוכית 0.17 מ"מ</td></tr><tr><td>פיברונקטין, פלזמת בקר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer תא משופר</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי TetraSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RFP-Lifeact</td><td></td><td></td><td>Maren Rudolph, המכון למיקרוביולוגיה רפואית, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג אפנדורף, גרמניה</td></tr><tr><td>YFP-Vinculin</td><td></td><td></td><td>Andrea Mordhorst, המכון למיקרוביולוגיה רפואית, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג אפנדורף, גרמניה</td></tr> <tr><td>תוכנה ותוספים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td>גרסה 3</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>גרסה 1.52c</td></tr><tr><td>תוסף</td><td></td><td></td> Turboreg <td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr> <tr><td>מאקרו "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"</td> <td>פרסום</td><td></td> <td>זהhttps://github.com/bzobiak/ImageJ</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>גרסה 6.2.2</td></tr></tbody></table>

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

בתאים חיים, תהליכים כגון היווצרות אדהזיה כרוך ביצוע שינויים מבניים נרחב קרום פלזמה ואת החלק הפנימי של התא. על מנת להמחיש את האירועים דינמי מאוד, חברו יחד שתי שיטות משלימות מיקרוסקופ אור לאפשר הדמיה מהיר של דגימות בשידור חי: ספינינג דיסק מיקרוסקופ (אס די) עבור ברזולוציה גבוהה ומהירה נפח הקלטה של החזרה גמורה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) עבור לוקליזציה מדויק והדמיה של קרום פלזמה. פרוטוקול דימות מקיף ושלם יוצג עבור המנחה דרך הכנת הדוגמא, מיקרוסקופ כיול, התמונה היווצרות ורכישה, וכתוצאה מכך צבע רב SD-TIRF בשידור חי סדרת הדמיה עם רזולוציה גבוהה-עתיים. כל השלבים עיבוד דפוס תמונה נחוץ ליצירת רב ממדית datasets הדמיה בשידור חי, כלומר רישום ושילוב של והערוצים, ניתנים במאקרו עצמית בכתב עבור תוכנת קוד פתוח ImageJ. ההדמיה של חלבונים פלורסנט במהלך החניכה, ההבשלה של מתחמי אדהזיה, כמו גם היווצרות של הרשת cytoskeletal אקטין, שימש הוכחה של עיקרון עבור גישה חדשנית זו. השילוב של מיקרוסקופיית תלת-ממד ברזולוציה גבוהה TIRF סיפק תיאור מפורט של התהליכים המורכבים האלה בתוך הסביבה התאית, באותו הזמן, לוקליזציה מדויק של מולקולות ממברנה-הקשורים מזוהה עם גבוה יחס אות-כדי-ברקע.

כדי להראות הפוטנציאל של SD-TIRF הדמיה, שוזמינותו פותחה זה לחשוף את הארגון-עתיים תא מטריצה אדהזיה מתחמי והאינטראקציה שלהם עם שלד התא במהלך אדהזיה הסלולר. לכן, מחסידי הלה או, לחילופין, NIH3T3 התאים היו transfected עם YFP-Vinculin ו- RFP-Lifeact עבור ה' 18-24, trypsinized, נזרע על גבי זכוכית מצופים fibronectin התחתון מנות. שורות תאים אלה נבחרו עבור שלד התא בולטת שלהם ועמידות גבוהה יותר בניסויים הדמיה בשידור חי, בניגוד, לדוגמה, ראשי תאים. אלה לא יכול לעמוד. הדמיה במצב מאוד רגיש כפי שהם לאחר ה...

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

מיקרוסקופיה TIRF דיסק מסתובב יכול להיות כלי שימושי לחקר התפקיד של חלבון במהלך היווצרות רשת cytoskeletal. טכניקה זו אפשרה הדמיה תלת מימדית של גישות תאיות מהירות המתרחשות בתא ובה בעת ובעונה אחת לוקליזציה מדויקת של מולקולת פלואורסצנטיות המוצבת בקרום הפלזמה. שיטה זו יכולה לספק תובנה לתחומי מחקר כמו מיקרוביולוגיה, ביולוגיה של התא, וכל הענפים שבהם חשוב לחקור את האינטראקציה בין קרום הפלזמה לסביבה התאית.שיטה זו יכולה להיות מורחבת לאותם ניסויי הדמיה חיים שבהם חשוב לוקליזציה של המבנים בממברנת הפלזמה והיכן שאתה גם רוצה לשמור על רזולוציה גבוהה של נפח התא הנותר. הדברים הקריטיים שיש לקחת בחשבון הם הבחירה של קו התא הנכון כדי להגדיר את תאורת TIRF ואת הפרמטרים הדמיה אחרים כדי למצוא את המוקד של תאים מנוקד. ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה בהחלט תסייע למנוע בעיות בטיפול בתאים במהלך רכישת תמונה.יומיים לפני הניסוי, זרע 3, 000 HELA או NIH 3T3 תאים בשני מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה לתוך כל באר של צלחת תאים שש באר. למחרת, הכינו את הריג'נטים הטרנס-אדביקים. ראשית, לדלל מיקרוגרם אחד של RFP Livact ומיקרוגרם אחד של YFP וינקולין בסך הכל 200 microliters של מדיום סרום מופחת.וורטקס הטרנסג'נט בקצרה. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של התערובת ל-200 מיקרוליטרים של דנ"א. Vortex reagents שוב ולאחר מכן להחריג את תערובת transfection במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, מוסיפים את כל תערובת ההיפוגה ישירות לתאים. מערבבים את בארות על ידי טלטול הצלחת ולאחר מכן למקם בחזרה לתוך החממה. ביום הניסוי, להכין את המדגם להדמיה חיה על ידי ציפוי הראשון צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר עם פתרון 10 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונצין ב PBS.השאירו את הפתרון על משטח הזכוכית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז הסירו אותו ותנו לאוויר המנה להתייבש. לאחר מכן, לדלל תווי חרוזים רב-פלואורסצנטיים בקוטר 0.1 מיקרון לצפיפות של 1.8 מיליארד חלקיקים למיליליטר במים מזוקקים. הוסיפו את הפתרון למשטח הזכוכית מצופה הפיברונאטין למשך 30 עד 60 שניות.לאחר מכן להסיר את הפתרון ולתת את האוויר צלחת להתייבש. צבוע מראש של הכלים עם קדימות פלואורסצנטיות נחוץ רק משתי סיבות, תחילה אם אתה רוצה למצוא את המטוס TIRF לפני זריעת התאים או לרכוש תמונת חרוזים דו צבעונית לרישום תמונה. עכשיו להכין מדיום צמיחה נגד חמצון על ידי הוספת 0.1 תווי חומצה אסקורבית טוחנת בריכוז הסופי של 0.1 מילימולר במדיום הצמיחה.לפני המלחמה התקשורת על ידי הצבתו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS ולהוסיף 250 microliters של טריפסין EDTA לכל באר של הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ולחכות שתיים עד שלוש דקות עד התאים מנותקים לחלוטין.תוסיפו את התאים בזהירות למיליליטר אחד של מדיום צמיחה נגד חמצון לפני המלחמה ותוסיפו אותם לארבעה מיליליטר נוספים של המדיום בצינור תרבות תאים של 15 מיליליטר. מניחים את ההשעיה התא עם מכסה פתוח מעט באינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס אגירה עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להתחיל, להתחיל את השליטה הסביבתית של המיקרוסקופ כדי להשיג תנאי תרבות תאים יציבים.לאחר מכן מניחים את המנה התחתונה זכוכית המכילה מיליליטר אחד של מדיום צמיחה נגד חמצון מראש לתוך מחזיק המדגם של מיקרוסקופ שחומם מראש. לאחר מכן, בתוכנת ההדמיה, הגדר את הגדרות הרכישה במיקרוסקופ. הגדר את מרווח זמן הרכישה ל- 30 שניות ואת משך הזמן בין 60 ל- 90 דקות.כמו כן, הפעל את פונקציית הפוקוס האוטומטי של הפוקוס האוטומטי המבוסס על חומרה עבור כל נקודת זמן על-ידי הגדרת הערך לנקודה אחת. כעת כווננו את החשיפה למצלמה ל-200 אלפיות שנייה, את רמת ההעליה ל-500 ואת עוצמת הלייזר ל-20% עבור כל ערוץ. רמות רווח גבוהות, זמן חשיפה נמוך וכוח לייזר נמוך מומלץ להפחית פוטוטוקסיות.לאחר מכן, הגדר את מחסנית ה- Z עבור ערוצי הדיסק המסתובב ל- 10 מיקרון עם מרווח של 0.4 מיקרון ולאחר מכן הגדר את ההיסט התחתון לאפס כך שהמישור הנמוך ביותר יהיה מיקום המוקד של פוקוס אוטומטי של החומרה ויהשבית את ערימות ה- Z עבור ערוצי TIRF. לבסוף, הפעל את מיקומי שלב הפונקציות מרובות הנקודות. פעולה זו תאפשר עד שלוש עמדות להירשם על פני מרווח של 30 שניות.עכשיו למצוא את חרוזים פלואורסצנטיים עם תאורה epifluorescent, להפעיל ערוץ TIRF אחד ולהגדיר את זווית התאורה לערך המציין תאורת TIRF. לאחר מכן, הפעילו את הפוקוס האוטומטי על-ידי לחיצה על הלחצן בלוח המיקרוסקופ והתאימים את המוקד באמצעות גלגל ההיסט. לאחר ההתמקדות, רכוש ערכת נתונים דו-צבעית באמצעות TIRF 488 ו- TIRF 561 לרישום תמונה מבוסס חרוזים עוקב.מוציאים את התאים מהאינקובטור ומערבבים את מתלי התא על ידי היפוך הצינור הסגור פעמיים עד שלוש פעמים. לאחר מכן להחיל מיליליטר אחד של התאים על צלחת ההדמיה. מצא במהירות תאים מדבקים כפולים עם תאורת אפיפלורסנט ברמה נמוכה.לאחר שנמצא, מרכז את התאים בתצוגה המקדימה של המצלמה החיה באמצעות תאורת שדה בהיר וסמן את המיקום. לאחר מכן למצוא עוד אחת עד שתי נקודות עניין, לשמור אותם לרשימת הפוזיציות ולהתחיל רכישת נתונים על ידי לחיצה על כפתור הרצף. בהתחלה, התאים יכולים להתנתק בקלות עקב תנועת הבמה ולכן עדיף להגדיר ארבע עד חמש עמדות ומאוחר יותר להשליך אחד או שניים.על מנת ליצור היפרסטאק ללא רישום בפיג'י, הורד תחילה ושמור את הקובץ שסופק SD-TIRF_helper_jove. ijm בפקודות המאקרו של תיקיית המשנה של פיג'י. הפעל את המאקרו על-ידי לחיצה על פקודת התפריט החל בתוספים ולאחר מכן פקודות מאקרו ולבסוף הפעלה.אם ערוצי הצבע זקוקים לתיקון רישום, בחרו באפשרות וצורו הפניה חדשה לרישום מבוססת חרוזים הידועה כקובץ ציון דרך. לאחר מכן, יבא את הנתונים עם יבואן הביופורמאטים ובחר בהיפרסטאק כאפשרות צפייה. טען את ערכת נתוני התמונה, בחר את סדרת הדיסקים המסתובבים בשלב הראשון ואת סדרת TIRF בשלב השני.בשלב זה, פיג'י תציג את הנתונים ממוינים לפי ערוץ ומיקום במה. החל את תיקון הרישום על הערוצים המתאימים על-ידי טעינת קובץ ציון הדרך המוגדר מראש. לאחר מכן בחר את טבלת בדיקת המידע הרצויה עבור כל דיסק מסתובב וערוץ TIRF ומזג אותם לתוך מערכת-יתר רב-מימדית אחת.במהלך העיבוד של תמונות TIRF, מספר מטוסי zed מתווספים למישור התחתון ומספר זה תואם למספר המישורים בערכות הנתונים של הדיסק המסתובב. זה מאוד חשוב לייצוג החזותי של ההיפרסטאק האחרון. באמצעות ההתקנה המתוארת בסרטון זה, נבחרו תאים מבטאי YFP ו- RFP ותהליך ההיתוך שלהם נצפה במהלך 60 דקות של timelapse.כצפוי, התאים היו עגולים בצורתם ורק חסידים חלשים בהתחלה עם בלטים ממברנה חשים את הסביבה וצורים קשר עם המצע. מגע מטריצת התא התחזק במהירות עם היווצרות של מה שנקרא הידבקויות המתהווה. במהלך הזמן, מתחמי הידבקות מוגדלים והתבגרו להיתיקים מוקדיים.מבנים מוארכים אלה ניכרו בעיקר בשולי התא. זה נבע כוחות שהופעלו על ידי סיבי actomyosin אשר גרמו לחיזוק הידבקויות מטריצת התא, כמו גם את הצרור של סיבי actin. התא השתטח גם כתוצאה מהיווצרות רשת Actin.מהירות הרכישה תלויה בפרמטרים הבאים, במרווח הזמן, בזמן החשיפה, במספר מטוסי zed ובמספר המיקומים. ולכן חשוב מאוד לייעל פרמטרים אלה עבור שיעורי רכישה גבוהים. הטמעת טכנולוגיית הדיסק המסתובבת החדשה ביותר תהפוך מיקרוסקופיה TIRF של דיסק מסתובב לטכניקת מיקרוסקופיה חדשה ברזולוציית-על שתאפשר הדמיה בקצבי זמן גבוהים.מיקרוסקופ דיסק מסתובב היא טכניקה חזקה מאוד לחקר תהליכים המתרחשים בין פנים התא לבין קרום התא. הוכחנו שאנחנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של עניין על ידי רכישת ערימות תמונה גדולות מאוד בתוך שניות ספורות. אור לייזר נאסף מסוכן לעיניים.לעולם אל תסתכל ישירות לתוך הקרן ולהשתמש באמצעי הבטיחות של המכשיר, כדי למנוע חשיפה ישירה לאור.

visualizing-adhesion-formation-cells-means-advanced-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של לימוד שלד ציטו-שלד והידבקויות מוקדיות בתאי סרטן המעי הגס האנושיים הראשוניים כדי להבין את הווריאציות שלו בהתאם לקשיחות המצע. תרבית זו של תאים סרטניים על מצעים רכים וקשים מאפשרת מדידות ביופיזיקליות שונות במורד הזרם לפרוגנוזה של סרטן.

בדיקת ארגון ציטו-שלד והדבקה מוקדית: שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לחקר הידבקות תאים והתפשטותם על מצעים

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

משטח TGT הוא פלטפורמה חדשנית לחקר גורם גדילה-אינטגרין crosstalk. תכנון הבדיקה הגמיש, הספציפיות של ליגנד ההדבקה והמודולציה המדויקת של תנאי הגירוי מאפשרים הערכות כמותיות חזקות של יחסי הגומלין בין EGFR-integrin. התוצאות מדגישות את EGFR כ'מכנו-מארגן' המכוון את מכניקת האינטגרין, ומשפיע על מכלול הידבקות המוקד ועל התפשטות התאים.

מד מתח קשירה בדיקות לכימות גורם גדילה מתווך מכניקת אינטגרין והדבקה

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

למד מיקרוסקופיית ספינינג דיסק TIRF מתקדמת לדימות תאים חיים תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת הדמיה מהירה של ממברנת התא ולוקליזציה מדויקת של חלבונים בקרום התא.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

גלה סרטונים נוספים