Name: הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למד מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולות בודדות בתאי חיידקים חיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי, מעקב וכימות של מכלולים מולקולריים פונקציונליים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים את התרומות סוג של זני חיידקים מן הקבוצות של פרופ &#39;יהודית ארמיטג&#39; (אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה), פרופ&#39; קונרד Mullineaux (המלכה מרי באוניברסיטת לונדון, אנגליה). IMD ממומנת במשותף על ידי המחלקה לביוכימיה (אוניברסיטת אוקספורד) ו OCISB: AR ממומנת על ידי הנדסה המדעים הפיזיקליים המועצה למחקר (EPSRC) מלגת הלימודים DTC; ND ממומנת מן ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC); MCL הוא במימון מלגה החברה המלכותית מחקר באוניברסיטה.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה, 50 μl של מניות קפוא של חלבון פלואורסצנטי להביע coli Escherichia תאים חיידקיים הם מפשיר הראשון גדלו aerobically עם רועד 5 מ&quot;ל LB התקשורת צמיחה לילה ב 37 מעלות צלסיוס בבוקר, 50 μl של תרבות זו רווי מופק ותת תרבות מינימלית M63 לתוך תרבות מדיה גלוקוז, דוגרים ב-C 30 מעלות למשך 4 עד 6 שעות. כאן אנו מדגימים באמצעות שני זני תאים שונים, אשר אחד מהם מבטא העברת אלקטרונים ציטוכרום התמזגו GFP, השני המבטא חלבון מעורב המנוע flagellar חיידקי התמזגו GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עשויים לקצור במישרין מן התרבות קטן גדל אם הצפייה בהם דגימות משותקת, או שהם עשויים להיות טעון לחתוך שוטונים חיידקי אם צפייה בתנאים &quot;קשור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שירינג כרוך בדרך כלל הצבת 1-5 מ&quot;ל של תרבות המשנה לתוך מכשיר המורכב משתי מזרקים סטריליים הצטרפו צנרת סטרילית. הגז נעשית על ידי לסירוגין דוחפים משאבה כל מזרק כדי לדחוף את תרבות דרך צינור צר. הדבר נעשה 5-10 פעמים, בהתאם להיקף הגז הנדרשת. תרבות היא centrifuged אז גלולה התאים, אשר resuspended בתקשורת מינימלי להסיר שברי שוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן אנו מכינים לנקות BK7 coverslips זכוכית ידי טבילה בתמיסה רוויה של KOH באתנול במשך 20 דקות, ואז לשטוף ביסודיות במים דה מיונן אתנול ולהשאיר לייבוש באוויר לפחות 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו פשוט לבנות תזרים תאים לבית התאים במיקרוסקופ. זה כרוך ציור קווים של שומן פרפין על שקופית BK7 מיקרוסקופ זכוכית ולאחר מכן יצירת מנהרה-כריך ידי הצבת אחד coverlips ניקו למעלה, ולחיצה מטה בעדינות עם זוג מלקחיים, נותן נפח תא זרימה של μl 5-10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לצפות בתאים משותקת אנחנו ממלאים את זרימת תאים בזריקה עם פתרון w / v 0.1% פולי-L-ליזין, ולאפשר לו דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקות לפחות 1. לאחר מכן לשטוף החוצה באמצעות מדיה מינימלי 100 μl ידי הזרקת התקשורת מקצה אחד של התא זרימה ועל הפתילה בנייר טישו מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, אנו הפתיל דרך μl 20 של דילול 1:500 בקוטר של 200 ננומטר לטקס microspheres (Polysciences) בתקשורת מינימלי כדי לסמן את השטח coverslip. זרימת תאים הוא הפוך כזה coverslip פונה כלפי מטה, מונח על מצע ברור של השטח בתא לחות פשוט, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. חרוזים מאוגד נשטפים אז במרחק של 100 הפתילה דרך התקשורת מינימלי μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אנו רוצים לשמור התאים קשורים אנו להשמיט את הצעד poly-L-ליזין, ובמקום למלא את זרימת תאים עם נוגדן אנטי flagellin 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. זרימת תא הוא מקום בתא לחות במשך 10 דקות, והוא הסמיק מכן דרך על ידי הפתילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl של התרבות התא ואז הרשעים דרך התא זרימה, בין אם באמצעות מדגם טעון התבוננות אם התאים קשורים או מדגם unsheared ב צפייה תאים משותקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת תאים היא הפוכה והניח בתא לחות עבור 20 דקות. תאים מאוגד נשטפים החוצה ואז על ידי מדיה הפתילה דרך 100 μl מינימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה של שמן טבילה ממוקם במרכז המשטח העליון של coverslip ואת זרימת תאים ממוקם אז בעדינות לבעל המדגם של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המנהג בנוי, ביצירת קשר עם עדשה אופטית מטרה גבוהה מספרי הצמצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצלמה מיקרוסקופ אלקטרונים הכפלת מופעל ונמצא המצלמה מוגדר להיות מקורר -70 מעלות צלזיוס, התוכנה מוגדרת לרכוש תמונות בקצב מסגרת טיפוסית של 25 הרץ במצב מסגרת העברה, בתחילה disenabling לקבל שליטה על המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאורה brightfield מופעל ואת התמונה הוא הביא אל המוקד, בחירת תא או קבוצת תאים מתאים להיות צילמו על בסיס היותם תקועים עם מקביל לציר הארוך שלהם אל פני השטח coverslip. הדגש הוא מותאם היטב על מנת להבטיח כי לטקס 200 ננומטר חרוזים תקוע אל פני השטח coverslip הם רק בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף התמונה היא רכשה brightfield להקליט את קווי המתאר של גוף התא. תאורה brightfield הוא כיבה את המצלמה מופעלת רווח מרבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רכישת תקן באמצעות השתקפות מסך פלואורסצנטי פנימי (או TIRF) קרן לייזר על הגל המתאים (כאן, עירור ירוק חלבון פלואורסצנטי, אנו משתמשים לייזר 473 ננומטר) היא שנקבע מראש כדי להיות ממוקד במישור המוקד האחורי של העדשה אובייקטיבי אבל העקורים רוחבית מהציר האופטי כדי ליצור שדה חלוף עבור עירור הקרינה לתוך המדגם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכישה המצלמה התחיל את התריס נפתח לייזר כדי להלהיב את חלבוני ניאון בתוך החיידק. הפרמטרים עבור עוצמת הלייזר ואת המהירות של הרכישה צריך להיות מותאם למערכת ביולוגית מסוימת תחת חקירה על ידי התנסות עם ערכים שונים, אלא מגוון טיפוסי relevant ללימוד קומפלקסים חלבונים ניידים קרום התא הם 1-10 כוח mW הלייזר על פני שטח עירור עגולה בקוטר ~ 30 מיקרומטר, עם זמן חשיפה לכל מסגרת של 50-40 אלפיות השנייה. דוגמאות מוארים עד photobleached, בדרך כלל עבור ~ 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תאים קשור בו גוף התא הוא מסתובב על נקודת ההתקשרות בין coverslip ועל בדל flagellar, ועל תאים משותקת אשר קבועים ונוקשים אל פני השטח coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה זנים התא שבו יש מספר גבוה עותק של קומפלקסים תועלת אקונומיקה הראשונית עקיפה מוגבל לייזר ממוקדת על מוט אחד של התא לפני TIRF הדמיה. אקונומיקה זה שווה כי בשימוש התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (או FRAP). באמצעות מיקרוסקופ המנהג שלנו קצת אור לייזר עירור יכול להיות מוזן לתוך נתיב עצמאי second המשמש FRAP מסוג הלבנה. בדרך כלל 1-10mW כוח לייזר משמש, עם זמן אקונומיקה טיפוסי בטווח 10-300 מילישניות. התוצאה היא הרבה יותר גבוהה לעומת הדמיה באזור מולבן של התא ומאפשר מתחמי יחיד אשר לאחר מכן מפוזר לאזור זה יהיה בקלות רבה יותר דמיינו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חזותי מתחמי בציטופלסמה של התא אשר מפוזר הרבה יותר מהר מאשר אלה קרום התא מצב תאורה שונים בשם &quot;slimfield&quot; הוא מועסק. הנה לייזר ממוקדת מורחבת רוחבית כדי להקיף רק תא בודד. זה מייצר שדה חזק מאוד ומאפשר חשיפה הרבה יותר מהר בדרך כלל של אלפית השנייה להילקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הרכישה נתונים, תמונות מוזנים לתוך התוכנה כתובה מותאמת אישית (מקודד LabVIEW 8.5). זה מזהה אוטומטית את עמדות נקודות פלורסנט בתאים עד לדיוק של ננומטרים ספורים בדרך כלל ותמציות גודלם ואת הבהירות. Brightnessof עקבות photobleaching ביחס לזמן ממכלול מולקולרית מעקב לאחר מכן נעשה שימוש כדי להעריך את stoichiometry, כלומר כמה חלבוני ניאון הפרט לפצות קומפלקס מולקולרי יחיד. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה את התמונות של התאים שנצפו ב brightfield שונה מאוד, עם היקפה של גופי התא כהה נגד גוף תא לבן / אפור (איור 1 א). ב הקרינה משותקים באמצעות תאים, אנו יכולים לראות עוצמת כתמים ברורים, בדרך כלל של 250-300 ננומטר רוחב (איור 1b). בריאים, התאים קשורים יראו לסובב סביב נקודת ההתקשרות לקשור בתמונות brightfield. תחת עירור הקרינה מתחמי כמה מולקולרית במקרה שלנו יכול להיות גם לראות בנקודת ההתקשרות, מה שמעיד על לוקליזציה של החלבון מתוייגים עם המנוע flagellar. כתמים אלה הם קומפלקסים מולקולריים בודדים ומספר להם לראות יהיה תלוי במצב תאורה המשמשים וכמה מתחמי הם בעצם להציג בתא בכל רגע נתון. הניידות של כתמים תלוי מערכת ביולוגית ספציפית תחת מחקר. אם את הצפיפות של הנקודות בהתחלה הוא גבוה מאוד, כפי שקורה עם cytochromes שכותרתו משמש כאן, ולאחר מכן ביצוע אקונומיקה FRAP הראשוני יכול לשפר את הניגודיות הדמיה. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> באיור 1. (א) brightfield ו (ב) התמונה TIRF (צבע שקר) עבור תא Escherichia coli משותקת לבטא חלבון התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אשר ידוע להיות מעורב המנועים flagellar של חיידקים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

יש להקפיד שלא &quot;על גזירה&quot; התא מסתכל חיידקים קשור, שכן הדבר עשוי לפגום את הפונקציונליות של מנועים flagellar. חשוב להשתמש בתאי הרבה יותר משעה אחת בשקופית מיקרוסקופ שכן הם עלולים להפוך חמצן מדולדל. אופטימיזציה ניכרת ייתכן שיהיה צורך למצוא הדמיה את התנאים הטובים ביותר מיקרוסקופ ששירתה המערכת הביולוגית הספציפית שלך תחת חקירה. זה יכול להיות חכם לניסיון הדמיה באמצעות מטוהרים GFP לבד לברר את העוצמה הנכונה לייזר עירור הנדרש עבור מערכת מיקרוסקופ הספציפית שלך.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד in vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

התובנה המלאה לתוך המנגנונים של תאים חיים יכולה להיות מושגת רק על ידי חוקר את תהליכי המפתח לעורר ולכוון אירועים ברמה התאית. עד כה מורכבות גזירה של מערכות ביולוגיות גרמה ניסויים מדויקים מולקולה בודדת להיות תובעני מדי, במקום התמקדות במחקרים של מערכות יחיד באמצעות בתפזורת גולמי יחסית ההרכב הממוצע מדידות. עם זאת, תהליכים חשובים רבים המתרחשים בתא החי ברמה של רק אחת או כמה מולקולות; מדידות ההרכב כלל להסוות את טבעו סטוכסטיים והטרוגניות של אירועים אלה. כאן, בעזרת מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת כלי ניתוח אנליטיים תמונה אנחנו מדגימים כיצד לפקח חלבונים בתוך תא חי בודד החיידק עד לדיוק של מולקולות בודדות וכיצד אנו יכולים לצפות הדינמיקה בתוך קומפלקסים מולקולריים בתפקוד מכונות ביולוגיות. טכניקות רלוונטיים ישירות פיזיולוגית. הם מינימלית perturbative ולא פולשנית המדגם ביולוגי תחת לימוד מכוונים באופן מלא בחקירות בחומר חי, תכונות לא זמינים מולקולה בודדת גישות אחרות של ביופיזיקה. בנוסף, דגימות ביולוגיות למד לייצר כל חלבון fluorescently-tagged ברמות אשר כמעט זהים לצלילי תא ללא שינוי (&quot;הקידוד הגנומי&quot;), בניגוד לגישה נפוצה יותר אך פחות אידיאלי להפקת חלבון משמעותי יותר היה להתרחש באופן טבעי (&#39;פלסמיד ביטוי &quot;). לפיכך, בפועל דגימות ביולוגיות אשר תיחקר באופן משמעותי קרוב יותר אורגניזמים טבעיים, ולכן התצפיות רלוונטי יותר תהליכים פיזיולוגיים אמיתי.

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

ניתן להשיג הבנה מלאה של המנגנונים בתאי חיים רק באמצעות חקירת התהליכים המרכזיים שמעוררים ומכוונים אירועים ברמה התאית...

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול לביצוע מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת בתאי חיידקים חיים, כדי לאפשר זיהוי, מעקב וכימות של קומפלקסים מולקולריים תפקודיים. פרוטוקול זה מתחיל בגידול חיידקים המבטאים חלבון המסומן באמצעות מולקולת צבע פלואורסצנטי. לאחר ארבע עד שש שעות, מופק נפח קטן של תאים מהתרבית וסימני השוטים (flagella) שלהם מקוצרים על ידי גזירה (shearing).לוחית כיסוי מזכוכית בתוך תא זרימה מצופה כדי לאפשר לתאים להיקשר לפני השטח. תאים מוזרקים לתא הזרימה ומעוגנים באמצעות gellar stub, הנצפה בפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופיית עירור בלייזר. מצלמה בעלת יעילות קוונטית גבוהה מקליטה תמונות brightfield ופלואורסצנציה בהירות של הקומפלקסים המולקולריים המסומנים.שלום, שמי איאן דוי ואני עובד עם מארק לי במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת אוקספורד. אני אלכס רוברטסון, עובד עם מארק לי במחלקה לפיזיקה. אני ניק דה ממעבדת leak, שגם היא ממוקמת במחלקה לפיזיקה.היום נדגים את הפרוצדורה לוויזואליזציה של קומפלקסים מולקולריים בודדים בחיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור אותם במצב תפקודי. אנו משתמשים בה גם כדי לחקור דינמיקה בזמן אמת של מכונות ביולוגיות טבעיות בקנה מידה ננומטרי.אם כן, נתחיל. ראשית, הפשיתו 50 µL של מקלוני frozen של חיידקי e coli. אלו עברו שינוי גנטי.כדי לסמן חלבון באמצעות מולקולת צבע פלואורסצנטי, יש להחדיר תרבית למספר חמישה מיליליטר של מצע גידול LB ולגדל את החיידקים באופן אירובי תחת ניעור למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, יש לקחת 50 µL מהתרבית הרוויה ולהעבירה לתרבית משנה במצע גידול Glucose M 63 מינימלי, להדגירה בטמפרטורה של 30 °C למשך ארבע עד שש שעות. בשלב זה נעשה שימוש בשני זני תאים שונים.אחד מבטא ציטוכרום מעביר אלקטרונים המחובר ל-GFP. השני מבטא חלבון המעורב במנוע השוטון החיידקי. תאים המחוברים ל-GFP יכולים להיות נאספים ישירות מתרבית המשנה הצומחת אם הם אמורים להיבחן כדגימות מקובעות, או שהם יכולים לעבור גזירה כדי לקטוע את השוטונים החיידקיים אם הם נבחנים בתנאי עיגון (tethered conditions).כדי לבצע גזירה (shearing) של החיידקים, העבירו באמצעות צינור סטרילי נפח של 1 עד 5 מיליליטר של התרבית המשנית למכשיר המורכב משתי מזרקים סטריליים. לחצו לסירוגין על בוכנות המזרקים כדי לדחוף את התרבית דרך הצינור הצר כ-50 עד 100 פעמים, בהתאם למידת הגזירה שהושגה. לאחר מכן, סבבו את התרבית בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים, ואז השביחו את התאים מחדש במצע מינימלי (minimal media) כדי להסיר שברי שוטים. לאחר שהתאים מוכנים, הכינו כיסויי זכוכית נקיים מסוג BK seven על ידי טבילה שלהם בתמיסה רוויה של פוטסיום הידרוקסיד ואתנול למשך 20 דקות.שטפו היטב במים דאיוניים ובאתנול והשאירו לייבוש באוויר למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, הכינו תא זרימה פשוט להוצאת התאים במיקרוסקופ. לשם כך, שרטטו קווי גריז פראפין על זכוכית BK seven של שקופית מיקרוסקופ, ואז צרו מבנה דמוי מנהרה על ידי הנחת אחת מהכיסויות המנוקות מעל.לחץ בעדינות בעזרת פינצטה. פעולה זו אמורה להניב נפח תא זרימה של חמישה עד 10 µL. כדי לצפות בתאים מקובעים, מלא את תא הזרימה על ידי הזרקה של תמיסת poly L lysine בריכוז 0.1% והשאר להדגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת לפחות.בשלב הבא, שטפו את תא הזרימה על ידי הזרקת 100 µL של מצע מינימלי מקצה אחד של תא הזרימה, ובמקביל ספיגת המצע דרך תא הזרימה באמצעות נייר סופג מהקצה השני. לאחר מכן, ספגו 20 µL של מיהול של 1:500 של מיקרוספירות לטקס בקוטר 200 nm במצע מינימלי כדי לסמן את פני השטח של לבישת הכיסוי. הניחו את תא הזרימה בתא לחות פשוט והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הפכו את תא הזרימה כך שלבישת הכיסוי תפנה כלפי מטה.לאחר מכן, שוטפים את החרוזים שאינם קשורים על ידי ספיגה של 100 µL של מצע מינימלי באמצעות נייר סופג. כדי לצפות בתאים קשורים, דלגו על שלב הדגירה עם poly L lysine, ובמקום זאת מלאו את תא הזרימה בתמיסת נוגדן Anti-Flag gellan בריכוז של 5 µg/mL, ולאחר מכן הניחו אותו בתא לחות למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את תא הזרימה על ידי ספיגה עם נייר סופג.בשלב הבא, ספגו 20 microliters של תרבית התאים דרך תא הזרימה באמצעות נייר סופג; השתמשו בדגימה שעברה גזירה כדי לצפות בתאים מעוגנים, או בדגימה שלא עברה גזירה כדי לצפות בתאים מקובעים. הפכו את תא הזרימה והניחו אותו בתא לחות למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים שלא נקשרו על ידי ספיגת 100 microliters של מצע גידול מינימלי. הניחו טיפה של שמן טבילה במרכז המשטח העליון של זכוכית הכיסוי.הניחו בעדינות את תא הזרימה על מחזיק הדגימות של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה המותאם אישית. פעולה זו אמורה ליצור מגע אופטי עם עדשת היעד בעלת הממספר האפראלי הגבוה. לאחר מכן, הפעילו את מצלמת הכפל האלקטרוני של המיקרוסקופ והגדירו קירור של המצלמה למינוס 70 מעלות צלזיוס.התוכנה מוגדרת לרכישת תמונות בקצב פריימים טיפוסי של 25 hertz, במצב העברת פריימים (frame transfer mode). הדלק את תאורת השדה המואר (brightfield) והגדר את התמונה לפוקוס.בחרו תא או קבוצת תאים מתאימים לצילום על בסיס העובדה שהם מודבקים כאשר הציר הארוך שלהם מקבילי למשטח לכיסוי (cover slip). כוון את המוקד כדי להבטיח שחלקיקי הלטקס בעלי קוטר 200 nanometer המודבקים למשטח לכיסוי נמצאים בדיוק במיקוד. רכשו רצף תמונות במיקרוסקופיית שדה בהיר (brightfield) כדי לתעד את קווי המתאר של גוף התא.לאחר מכן מכבים את תאורת השדה הבהיר (brightfield) ומפעילים את הגברת המצלמה (gain) למקסימום לצורך הדמיה באמצעות פלואורסצנציית השתקלה פנימית מלאה, הידועה גם כ-TIRF. התחילו את רכישת התמונה במצלמה ופתחו את תריס הלייזר כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים בתוך החיידקים. יש לאופטימיזציה את הפרמטרים של עוצמת הלייזר ומהירות הרכישה עבור המערכת הביולוגית הספציפית.הדגימות הנבדקות מוארות עד להגעה להלבנה פוטו-כימית (photo bleaching), תהליך שארכה בדרך כלל כ-10 שניות. לאחר איסוף הנתונים, התמונות מוזנות לתוכנת ניתוח שנכתבה במיוחד, המזהה באופן אוטומטי את מיקומי הנקודות הפלורסצנטיות בתאים בדיוק של מספר ננומטרים ומחלצת את גודלן ועוצמתן. עוצמת הגרף של ההלבנה הפוטו-כימית ביחס לזמן של קומפלקס מולקולרי מושך משמשת לאחר מכן להערכת הסטוכיומטריה.בשימוש בשיטה זו, תמונת התאים הנצפית בשדה בהיר (brightfield) היא ברורה מאוד, כך שהיקפי גופי התאים כהים על רקע גוף תא אפור-לבן בשימוש בפלואורסצנציה עם תאים מקובעים. ניתן לראות כאן, המוצגים בצבעים מלאכותיים, נקודות עצימות מובחנות ברוחב טיפוסי של 250 עד 300 nanometers. תאים בריאים קשורים נראים כמסתובבים סביב נקודת חיבור הקשירה בתמונות שדה בהיר תחת עירור פלואורסצנטי.ניתן יהיה לראות חלק מהקומפלקסים המולקולריים גם בנקודת החיבור, מה שמעיד על מיקום של החלבון המסומן יחד עם מנוע ה-Geller. נקודות אלו הן קומפלקסים מולקולריים בודדים. מספר הקומפלקסים שייראו תלוי במצב התאורה שבו נעשה שימוש ובכמות הקומפלקסים שנמצאים בפועל בתא בכל רגע נתון.אם צפיפות הנקודות גבוהה מאוד בתחילה, כפי שקורה עם הציטוכרומים המסומנים שנעשה בהם שימוש כאן, ביצוע הבהרה ראשונית בשיטת FRAP עשוי לשפר את ניגודיות הדימוי. ניידות הנקודות תלויה במערכת הביולוגית הספציפית הנחקרת. הרגע הראינו לכם כיצד להדמינ קומפלקסים מולקולריים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת.בביצוע פרוצדורה זו, חשוב להימנע מכוחות גזירה על התאים, שכן אלו עלולים לפגוע בתפקוד מנוע השוט. כמו כן, חשוב שלא להשאיר את התאים על תזריות המיקרוסקופ למשך יותר משעה, שכן הם עלולים לסבול ממחסור בחמצן. נדרשת אוטומציה כדי למצוא את תנאי הדמיון האופטימליים.ניתן להשתמש ב-GFP מנוקה לבדו כדי לקבוע את עוצמת הלייזר הנכונה עבור מערכת המיקרוסקופ הספציפית שלכם. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקת קלם הותאמה לנתח מורפולוגיה ultrastructural של קרומים, האברונים, ומבני subcellular מושפעים מולקולות microinjected. שיטה זו משלבת טכניקות רבות העצמה של המיקרומניפולציה / microinjection, מיקרוסקופיה confocal ניאון, וכן במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאפשר מילימטר לרזולוציה רבה ננומטר. טכניקה זו היא נוחה למגוון רחב של יישומים.

אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

שיטה correlative מיקרוסקופ אלקטרונים אור (קלם) מוחל על התמונה הנוצרות על-ידי וירוס תאיים מבנים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) בתאים שנבחרו קודם לכן על ידי מיקרוסקופ אור (LM). באימות LM ו- EM משולבים כמו בגישה הדמיה היברידי להשיג תצלום המשולב של וירוס-פונדקאי אינטראקציות.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופ אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הטבעה של Epon באמצעות חלבון פלואורסצנטי הנקרא mScarlet. שיטה זו יכולה לשמור על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. טכניקה זו מקובלת על מגוון רחב של יישומים ביולוגיים.

הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר מנגנון לשימוש במיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה כדי להמחיש את האינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים המסומנים ב-mEosEM ו-APEX2, בהתאמה.

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה דו-צבעונית להדמיית אינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים

למד מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולות בודדות בתאי חיידקים חיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי, מעקב וכימות של מכלולים מולקולריים פונקציונליים בזמן אמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

גלה סרטונים נוספים