הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם
8 בספטמבר 2009
כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.
כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול לביצוע מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת בתאי חיידקים חיים, כדי לאפשר זיהוי, מעקב וכימות של קומפלקסים מולקולריים תפקודיים. פרוטוקול זה מתחיל בגידול חיידקים המבטאים חלבון המסומן באמצעות מולקולת צבע פלואורסצנטי. לאחר ארבע עד שש שעות, מופק נפח קטן של תאים מהתרבית וסימני השוטים (flagella) שלהם מקוצרים על ידי גזירה (shearing).
לוחית כיסוי מזכוכית בתוך תא זרימה מצופה כדי לאפשר לתאים להיקשר לפני השטח. תאים מוזרקים לתא הזרימה ומעוגנים באמצעות gellar stub, הנצפה בפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופיית עירור בלייזר. מצלמה בעלת יעילות קוונטית גבוהה מקליטה תמונות brightfield ופלואורסצנציה בהירות של הקומפלקסים המולקולריים המסומנים.
שלום, שמי איאן דוי ואני עובד עם מארק לי במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת אוקספורד. אני אלכס רוברטסון, עובד עם מארק לי במחלקה לפיזיקה. אני ניק דה ממעבדת leak, שגם היא ממוקמת במחלקה לפיזיקה.
היום נדגים את הפרוצדורה לוויזואליזציה של קומפלקסים מולקולריים בודדים בחיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור אותם במצב תפקודי. אנו משתמשים בה גם כדי לחקור דינמיקה בזמן אמת של מכונות ביולוגיות טבעיות בקנה מידה ננומטרי.
אם כן, נתחיל. ראשית, הפשיתו 50 µL של מקלוני frozen של חיידקי e coli. אלו עברו שינוי גנטי.
כדי לסמן חלבון באמצעות מולקולת צבע פלואורסצנטי, יש להחדיר תרבית למספר חמישה מיליליטר של מצע גידול LB ולגדל את החיידקים באופן אירובי תחת ניעור למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, יש לקחת 50 µL מהתרבית הרוויה ולהעבירה לתרבית משנה במצע גידול Glucose M 63 מינימלי, להדגירה בטמפרטורה של 30 °C למשך ארבע עד שש שעות. בשלב זה נעשה שימוש בשני זני תאים שונים.
אחד מבטא ציטוכרום מעביר אלקטרונים המחובר ל-GFP. השני מבטא חלבון המעורב במנוע השוטון החיידקי. תאים המחוברים ל-GFP יכולים להיות נאספים ישירות מתרבית המשנה הצומחת אם הם אמורים להיבחן כדגימות מקובעות, או שהם יכולים לעבור גזירה כדי לקטוע את השוטונים החיידקיים אם הם נבחנים בתנאי עיגון (tethered conditions).
כדי לבצע גזירה (shearing) של החיידקים, העבירו באמצעות צינור סטרילי נפח של 1 עד 5 מיליליטר של התרבית המשנית למכשיר המורכב משתי מזרקים סטריליים. לחצו לסירוגין על בוכנות המזרקים כדי לדחוף את התרבית דרך הצינור הצר כ-50 עד 100 פעמים, בהתאם למידת הגזירה שהושגה. לאחר מכן, סבבו את התרבית בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים, ואז השביחו את התאים מחדש במצע מינימלי (minimal media) כדי להסיר שברי שוטים. לאחר שהתאים מוכנים, הכינו כיסויי זכוכית נקיים מסוג BK seven על ידי טבילה שלהם בתמיסה רוויה של פוטסיום הידרוקסיד ואתנול למשך 20 דקות.
שטפו היטב במים דאיוניים ובאתנול והשאירו לייבוש באוויר למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, הכינו תא זרימה פשוט להוצאת התאים במיקרוסקופ. לשם כך, שרטטו קווי גריז פראפין על זכוכית BK seven של שקופית מיקרוסקופ, ואז צרו מבנה דמוי מנהרה על ידי הנחת אחת מהכיסויות המנוקות מעל.
לחץ בעדינות בעזרת פינצטה. פעולה זו אמורה להניב נפח תא זרימה של חמישה עד 10 µL. כדי לצפות בתאים מקובעים, מלא את תא הזרימה על ידי הזרקה של תמיסת poly L lysine בריכוז 0.1% והשאר להדגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת לפחות.
בשלב הבא, שטפו את תא הזרימה על ידי הזרקת 100 µL של מצע מינימלי מקצה אחד של תא הזרימה, ובמקביל ספיגת המצע דרך תא הזרימה באמצעות נייר סופג מהקצה השני. לאחר מכן, ספגו 20 µL של מיהול של 1:500 של מיקרוספירות לטקס בקוטר 200 nm במצע מינימלי כדי לסמן את פני השטח של לבישת הכיסוי. הניחו את תא הזרימה בתא לחות פשוט והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הפכו את תא הזרימה כך שלבישת הכיסוי תפנה כלפי מטה.
לאחר מכן, שוטפים את החרוזים שאינם קשורים על ידי ספיגה של 100 µL של מצע מינימלי באמצעות נייר סופג. כדי לצפות בתאים קשורים, דלגו על שלב הדגירה עם poly L lysine, ובמקום זאת מלאו את תא הזרימה בתמיסת נוגדן Anti-Flag gellan בריכוז של 5 µg/mL, ולאחר מכן הניחו אותו בתא לחות למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את תא הזרימה על ידי ספיגה עם נייר סופג.
בשלב הבא, ספגו 20 microliters של תרבית התאים דרך תא הזרימה באמצעות נייר סופג; השתמשו בדגימה שעברה גזירה כדי לצפות בתאים מעוגנים, או בדגימה שלא עברה גזירה כדי לצפות בתאים מקובעים. הפכו את תא הזרימה והניחו אותו בתא לחות למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים שלא נקשרו על ידי ספיגת 100 microliters של מצע גידול מינימלי. הניחו טיפה של שמן טבילה במרכז המשטח העליון של זכוכית הכיסוי.
הניחו בעדינות את תא הזרימה על מחזיק הדגימות של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה המותאם אישית. פעולה זו אמורה ליצור מגע אופטי עם עדשת היעד בעלת הממספר האפראלי הגבוה. לאחר מכן, הפעילו את מצלמת הכפל האלקטרוני של המיקרוסקופ והגדירו קירור של המצלמה למינוס 70 מעלות צלזיוס.
התוכנה מוגדרת לרכישת תמונות בקצב פריימים טיפוסי של 25 hertz, במצב העברת פריימים (frame transfer mode). הדלק את תאורת השדה המואר (brightfield) והגדר את התמונה לפוקוס.
בחרו תא או קבוצת תאים מתאימים לצילום על בסיס העובדה שהם מודבקים כאשר הציר הארוך שלהם מקבילי למשטח לכיסוי (cover slip). כוון את המוקד כדי להבטיח שחלקיקי הלטקס בעלי קוטר 200 nanometer המודבקים למשטח לכיסוי נמצאים בדיוק במיקוד. רכשו רצף תמונות במיקרוסקופיית שדה בהיר (brightfield) כדי לתעד את קווי המתאר של גוף התא.
לאחר מכן מכבים את תאורת השדה הבהיר (brightfield) ומפעילים את הגברת המצלמה (gain) למקסימום לצורך הדמיה באמצעות פלואורסצנציית השתקלה פנימית מלאה, הידועה גם כ-TIRF. התחילו את רכישת התמונה במצלמה ופתחו את תריס הלייזר כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים בתוך החיידקים. יש לאופטימיזציה את הפרמטרים של עוצמת הלייזר ומהירות הרכישה עבור המערכת הביולוגית הספציפית.
הדגימות הנבדקות מוארות עד להגעה להלבנה פוטו-כימית (photo bleaching), תהליך שארכה בדרך כלל כ-10 שניות. לאחר איסוף הנתונים, התמונות מוזנות לתוכנת ניתוח שנכתבה במיוחד, המזהה באופן אוטומטי את מיקומי הנקודות הפלורסצנטיות בתאים בדיוק של מספר ננומטרים ומחלצת את גודלן ועוצמתן. עוצמת הגרף של ההלבנה הפוטו-כימית ביחס לזמן של קומפלקס מולקולרי מושך משמשת לאחר מכן להערכת הסטוכיומטריה.
בשימוש בשיטה זו, תמונת התאים הנצפית בשדה בהיר (brightfield) היא ברורה מאוד, כך שהיקפי גופי התאים כהים על רקע גוף תא אפור-לבן בשימוש בפלואורסצנציה עם תאים מקובעים. ניתן לראות כאן, המוצגים בצבעים מלאכותיים, נקודות עצימות מובחנות ברוחב טיפוסי של 250 עד 300 nanometers. תאים בריאים קשורים נראים כמסתובבים סביב נקודת חיבור הקשירה בתמונות שדה בהיר תחת עירור פלואורסצנטי.
ניתן יהיה לראות חלק מהקומפלקסים המולקולריים גם בנקודת החיבור, מה שמעיד על מיקום של החלבון המסומן יחד עם מנוע ה-Geller. נקודות אלו הן קומפלקסים מולקולריים בודדים. מספר הקומפלקסים שייראו תלוי במצב התאורה שבו נעשה שימוש ובכמות הקומפלקסים שנמצאים בפועל בתא בכל רגע נתון.
אם צפיפות הנקודות גבוהה מאוד בתחילה, כפי שקורה עם הציטוכרומים המסומנים שנעשה בהם שימוש כאן, ביצוע הבהרה ראשונית בשיטת FRAP עשוי לשפר את ניגודיות הדימוי. ניידות הנקודות תלויה במערכת הביולוגית הספציפית הנחקרת. הרגע הראינו לכם כיצד להדמינ קומפלקסים מולקולריים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת.
בביצוע פרוצדורה זו, חשוב להימנע מכוחות גזירה על התאים, שכן אלו עלולים לפגוע בתפקוד מנוע השוט. כמו כן, חשוב שלא להשאיר את התאים על תזריות המיקרוסקופ למשך יותר משעה, שכן הם עלולים לסבול ממחסור בחמצן. נדרשת אוטומציה כדי למצוא את תנאי הדמיון האופטימליים.
ניתן להשתמש ב-GFP מנוקה לבדו כדי לקבוע את עוצמת הלייזר הנכונה עבור מערכת המיקרוסקופ הספציפית שלכם. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים פרוטוקולים למיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת בתאי חיידקים חיים. השיטה מאפשרת זיהוי, מעקב וכימות של קומפלקסים מולקולריים תפקודיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
- ביולוגיה של התא
- דימיון מולקולרי
רקע
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית על מולקולות בודדות בתאים חיים.
- טכניקה זו חיונית לחקר תהליכים דינמיים בסביבות תאיות.
- הבנת קומפלקסים מולקולריים היא קריטית להשגת תובנות לגבי תפקודי התא.
- תאי חיידקים חיים משמשים כמערכת מודל למחקרים אלו.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת.
- לאפשר לחוקרים להדמיות ולכימות של קומפלקסים מולקולריים בתאים חיים.
- להגביר את ההבנה של אינטראקציות מולקולריות בתאים חיידקיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול חיידקים המבטאים חלבון המסומן בצבע פלואורסצנטי.
- הוצאת תאים וקיצור של סיבי השוטים (flagella) באמצעות גזירה (shearing).
- ציפוי של כיסית זכוכית בתא זרימה כדי להקל על היצמדות התאים.
- הזרקת תאים לתא הזרימה ושימוש במיקרוסקופיית עירור בלייזר לצורך דימוי.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של קומפלקסים מולקולריים מתויגים בתאי חיידקים חיים.
- כימות של אינטראקציות מולקולריות באמצעות דימוג פלואורסצנטי.
- הדגמה של יעילות הפרוטוקול בהקשר של תאים חיים.
- אספקת שיטה הניתנת לשחזור עבור חוקרים בתחום.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקרים מפורטים של קומפלקסים מולקולריים בתאים חיים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת היא כלי רב עוצמה לביולוגיה תאית.
- ניתן להתאים שיטה זו ליישומים שונים בדימות מולקולרי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה של קומפלקסים מולקולריים בודדים בתאי חיידקים חיים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטיים של תיקוף מטרה (target validation) על ידי חשיפת דינמיקה סטוכסטית והטרוגנית המוסתרת במדידות של אוכלוסיות (ensemble measurements). גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת תצפיות רלוונטיות פיזיולוגית ובעלות הפרעה מינימלית של מכונות ביולוגיות פונקציונליות ברמות ביטוי קרובות למצב טבעי. השיטה משפרת את הרציפות התרגומית משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים, באמצעות אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על אינטראקציות מולקולריות בהקשרים פונקציונליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות תצפית ישירה על סטוכיומטריה ודינמיקה של מולקולה בודדת במתחמיים פונקציונליים.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות של אינטראקציות מולקולריות בתנאים קרובים למצב טבעי, ובכך מפחית את ההסתמכות על ארטיפקטים הנובעים מביטוי יתר.
- ערך אסטרטגי: תומך בהערכת רמת הביטחון במטרה על ידי חשיפת הטרוגניות ומצבים פונקציונליים שאינם גלויים בבדיקות מסה (bulk assays).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים מרחביים וזמניים בדיוק גבוה על קומפלקסים מולקולריים לצורך כיול ותיקוף של בדיקות.
- ערך תפעולי: מספק תוצרי פלואורסצנציה הניתנים לשחזור וניתנים לגילוי באמצעות פלטפורמות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בסטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות מדידה כמותית של בהירות מולקולה בודדת וקינטיקה של הבהרה (bleaching).
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך מדעי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית באמצעות קידוד גנומי של תגים פלואורסצנטיים.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב ארוכי טווח אחר דינמיקות מורכבות בתאים חיים כדי לספק מידע למחקרי מנגנון פעולה.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קורלציה בין התנהגות קומפלקסים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת רזולוציה של מולקולה בודדת של מעורבות המטרה והרכבת קומפלקסים, ובכך היא מסייעת בזיהוי מובילים באמצעות תובנות מכניסטיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות ויזואליזציה ישירה של היווצרות ופירוק של קומפלקסים מולקולריים בתאים חיים.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה (assay) באמצעות הכנה סטנדרטית של תאים קשורים או מקובעים עם זיהוי כמותי של נקודות פלואורסצנטיות.
- אנליטיקה: מספק נתוני מיקום בקנה מידה ננומטרי ומסלולי בהירות להערכת סטוכיומטריה וכימות גודל הקומפלקס.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור רמות ביטוי טבעיות ומינימום הפרעה תאית במהלך הדימוי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימוי הניתנת לשימוש חוזר עבור מטרות מרובות באמצעות תיוג פלואורסצנטי גמיש והכנת תא זרימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באמצעות תצפית ישירה על התנהגות מולקולרית סטוכסטית בהקשרים פונקציונליים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה באמצעות הכנת תאים הניתנת לשחזור, הרכבת תא זרימה ופרמטרי רכישת תמונות.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתונים כמותיים של דינמיקת מולקולה בודדת.
שיקולי יישום
- מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תרביות חיידקים ותיוג חלבונים.
- ציוד הכולל עדשות בעלות מפתח מספרי גבוה, עירור בלייזר ומצלמות EMCCD מקוררות.
- סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי גזירה, הכנת תאי זרימה ונתיבי ניתוח תמונות.
- שיקולי התאמה עבור זני חיידקים שונים, תגים פלואורסצנטיים וקומפלקסים של מטרות.
- מגבלות מעשיות כוללות הגבלות של פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) ורגישות לגזירה של תפקוד השוטים.
