הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול לביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה בודדת על תאי חיידקים חיים כדי לאפשר זיהוי, מעקב וכימות של קומפלקסים מולקולריים פונקציונליים. פרוטוקול זה מתחיל בגידול חיידקים, המייצרים חלבון המתויג למולקולת צבע פלואורסצנטית. לאחר ארבע עד שש שעות, נפח קטן של תאים מופק מהתרבית וחוטי הדגל שלהם נחתכים על ידי גזירה.

החלקה של כיסוי זכוכית בתוך תא זרימה מצופה כדי לאפשר לתאים להיצמד למשטח. תאים מוזרקים לתא הזרימה ונקשרים באמצעות בדל גלר, הנצפה בפלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ עירור לייזר. לאחר מכן מצלמת יעילות קוונטית גבוהה מתעדת את תמונות השדה הבהיר והפלואורסצנטי של הקומפלקסים המולקולריים המתויגים.

שלום, שמי איאן דוי ואני עובד עם מארק לי במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת אוקספורד. אני אלכס רוברטסון שעובד עם מארק לי במחלקה לפיזיקה. אני ניק דה ממעבדת הדליפה, גם היא במחלקה לפיזיקה.

היום נראה לכם את ההליך להדמיית קומפלקסים מולקולריים בודדים בחיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת. אנו משתמשים בהליך זה כדי ללמוד את זה במצב פונקציונלי. אנו משתמשים גם כדי לחקור דינמיקה בזמן אמת של מכונה ביולוגית טבעית וקנה מידה של עדשה ננומטרית.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל להפשיר 50 מיקרוליטר של גבעולים קפואים של חיידקי אי קולי. אלה עברו שינוי גנטי.

כדי לתייג חלבון במולקולת צבע פלואורסצנטי, יש לחסן חמישה מיליליטר של מצע גידול LB ולגדל את החיידקים תוך רעידות אירוביות בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, קח 50 מיקרוליטר מהתרבית הרוויה ותת-תרבית אותה לתוך מדיום תרבית גלוקוז M 63 מינימלי בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד שש שעות. כאן משתמשים בשני זני תאים שונים.

האחד מבטא אלקטרון המעביר ציטוכרום מאוחה ל-GFP. השני מבטא חלבון המעורב במנוע הדגל החיידקי. ניתן לקצור תאי GFP ישירות מתת-התרבות הגדלה אם יש לראות אותם כדגימות משותקות, או שהם עשויים להיגזז כדי לקטום דגלים חיידקיים אם הם נצפים בתנאים קשורים.

כדי לגזור את החיידקים, הנח בין מיליליטר אחד לחמישה מיליליטר של תת-התרבות למכשיר המורכב משני מזרקים סטריליים על ידי צנרת סטרילית. דחיפה חלופית בכל משאבת מזרק כדי לאלץ את התרבית דרך הצינור הצר כ-50 עד 100 פעמים בהתאם למידת הגזירה הנרכשת צנטריפוגה הבאה של התרבית כדי לגלול את התאים ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים במדיה מינימלית כדי להסיר שברי דגלים. לאחר שהתאים מוכנים, הכינו שבע החלקות כיסוי זכוכית נקיות של BK על ידי טבילתם בתמיסה רוויה של אשלגן הידרוקסיד ואתנול למשך 20 דקות.

יש לשטוף היטב במים נטולי יונים ואתנול ולהשאיר לייבוש באוויר למשך שעה לפחות. לאחר מכן, בנו תא זרימה פשוט שיאכלס את התאים במיקרוסקופ. לשם כך, צייר קווים של שומן פרפין על שקופית מיקרוסקופ זכוכית BK שבע זכוכית, ולאחר מכן צור כריך מנהרה על ידי הנחת אחת מהחלקות הכיסוי הנקיות מעל.

לחץ כלפי מטה בעדינות עם זוג מלקחיים. זה אמור לתת נפח תא זרימה של חמישה עד 10 מיקרוליטר. כדי לצפות בתאים משותקים ממלאים את תא הזרימה על ידי הזרקת תמיסה של 0.1% של פולי L ליזין ומאפשרים לו לדגור בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת לפחות.

לאחר מכן, שטפו את תא הזרימה על ידי הזרקת 100 מיקרוליטר של מדיה מינימלית מקצה אחד של תא הזרימה ובמקביל נידוף המדיה דרך תא הזרימה עם נייר טישו מהקצה השני לאחר מכן, WIC זרקה 20 מיקרוליטר של דילול אחד ל-500 של מיקרוספירות לטקס בקוטר 200 ננומטר במדיה מינימלית כדי לסמן את משטח החלקת הכיסוי. הנח את תא הזרימה בתא לחות פשוט ודגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. תא הזרימה הפוך כך שהחלקת הכיסוי פונה כלפי מטה.

החרוזים הלא כרוכים נשטפים לאחר מכן על ידי נידוף דרך 100 מיקרוליטר של מדיה מינימלית עם נייר טישו. כדי לצפות בתאים קשורים, דלג במקום זאת על שלב הדגירה של פולי L ליזין, מלא את תא הזרימה בחמישה מיקרוגרם לתמיסת נוגדן גלאן נגד מיליליטר, ולאחר מכן הנח אותו בתא לחות למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את תא הזרימה על ידי פתילה עם נייר טישו.

לאחר מכן, WIC 20 מיקרוליטר של תרבית התאים דרך תא הזרימה עם נייר טישו, או באמצעות הדגימה הגזורה כדי לצפות בתאים קשורים או בדגימה הלא משותפת לצפייה בתאים משותקים, תא הזרימה הופך ומונח בתא הלחות למשך 20 דקות. התאים הלא קשורים נשטפים לאחר מכן על ידי פתילה דרך 100 מיקרוליטר של מדיה מינימלית. הניחו טיפת שמן טבילה במרכז המשטח העליון של החלקת הכיסוי.

הנח את תא הזרימה בעדינות על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ הקרינה שנבנה בהתאמה אישית. זה אמור ליצור מגע אופטי עם עדשת האובייקט עם הצמצם המספרי הגבוה. לאחר מכן, הפעל את מצלמת מכפיל האלקטרונים של המיקרוסקופ והגדר את המצלמה להתקרר למינוס 70 מעלות צלזיוס.

התוכנה מוגדרת לרכוש תמונות בקצב פריימים טיפוסי של 25 הרץ. במצב העברת מסגרת. הפעל את תאורת שדה הבהירות והביא את התמונה למיקוד.

בחר תא מתאים או קבוצת תאים להדמיה על בסיס היותם תקועים בציר הארוך שלהם. במקביל למשטח החלקת הכיסוי, כוונן את המיקוד כדי להבטיח שחרוזי הלטקס בגודל 200 ננומטר הדבוקים למשטח החלקת הכיסוי נמצאים בדיוק במיקוד. רכוש רצף תמונות בשדה בהיר כדי לתעד את קווי המתאר של גוף התא.

לאחר מכן מכבים את תאורת השדה הבהיר ורווח המצלמה מופעל למקסימום להדמיה באמצעות פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת, הידועה גם בשם דשא. התחל את רכישת המצלמה ופתח את תריס הלייזר כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים בתוך החיידקים. הפרמטרים לעוצמת הלייזר ומהירות הרכישה צריכים להיות מותאמים למערכת הביולוגית המסוימת.

הדגימות במחקר מוארות עד להלבנת צילום, מה שבדרך כלל לוקח כ-10 שניות. לאחר איסוף הנתונים, התמונות מוזנות לתוכנת ניתוח כתובה מותאמת אישית, המזהה אוטומטית את מיקומם של כתמי פלואורסצנט בתאים בדיוק של כמה ננומטרים ומחלצת את גודלם ובהירותם. הבהירות של עקבות הלבנת הצילום ביחס לזמן המשיכה של קומפלקס מולקולרי משמשת לאחר מכן להערכת השימוש בסטויכיומטריה.

בשיטה זו, התמונה של התאים שנצפו בשדה בהיר היא מאוד ברורה, כך שהיקפי גופי התאים כהים כנגד גוף תא אפור לבן באמצעות פלואורסצנטיות עם תאים משותקים. ניתן לראות כתמים מובהקים בעוצמה של 250 עד 300 ננומטר ברוחב בדרך כלל מוצגים כאן בצבע כוזב. ניתן לראות תאים קשורים בריאים מסתובבים סביב נקודת החיבור של הקשירה בתמונות שדה בהיר תחת עירור פלואורסצנטי.

ניתן לראות כמה קומפלקסים מולקולריים גם בנקודת ההתקשרות המעידים על לוקליזציה של החלבון המיכל עם מנוע גלר. כתמים אלה הם קומפלקסים מולקולריים בודדים. מספר אלה שנראים יהיה תלוי במצב התאורה בו נעשה שימוש וכמה מהקומפלקסים נמצאים בפועל בתא בכל זמן נתון.

אם צפיפות הכתמים גבוהה מאוד בתחילה, כפי שקורה בציטוכרומים המסומנים המשמשים כאן, אז ביצוע אקונומיקה ראשונית של frap יכול לשפר את ניגודיות ההדמיה. ניידות הכתמים תלויה במערכת הביולוגית הספציפית. במחקר, זה עתה הראינו לך כיצד לדמיין קומפלקסים מולקולריים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב שלא יהיו תאי גזירה מכיוון שהדבר עלול לפגוע בפונקציונליות של מנוע הדגל. חשוב גם לא להשאיר את התאים על שקופיות המיקרוסקופ במשך יותר משעה אם הם עלולים להתרוקן בחמצן. נדרשת אוטומציה כדי למצוא את תנאי ההדמיה הטובים ביותר.

זה יכול לעזור בשימוש ב-GFP מטוהר בלבד כדי לוודא את עוצמת הלייזר הנכונה עבור מערכת המיקרוסקופ הספציפית שלך. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.