ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתפעל את ביטוי הגנים באבות המוח האחורי העוברי באמצעות החדרת DNA פלסמיד על ידי אלקטרופורציה בנקודות זמן הריון מוקדמות יותר. זה מושג על ידי בידוד ראשוני של עוברים בגיל 11.5 ימי הריון והכוונתם לצד הגב כלפי מעלה בתמיסת מלח סטרילית עם פוספט. השלב השני הוא הזרקת כ-50 מיקרוליטר של פלסמיד הביטוי ב-0.01% ירוק מהיר.

בהזרקה מוצלחת, כל מערכת החדרים תתמלא בתערובת הירוקה המהירה של DNA. לאחר מכן, העובר נתון לדופק חשמלי. הצד של העובר הקרוב ביותר לאלקטרודה הטעונה חיובית יתפוס את ה-DNA של הפלסמיד.

הצד השני ישמש כשליטה שלילית פנימית. השלב האחרון הוא הכנסת העוברים לתרבית רקמה למשך 24 שעות לפחות. בסופו של דבר, הגן המדורג אלקטרו יבוא לידי ביטוי לאחר 24 שעות של תרבית וניתן להעריך אותו על ידי אימונוהיסטוכימיה.

היתרון של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמניפולציה של אבות המוח האחורי העוברי אפשרית בנקודות זמן הריון מוקדמות יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום, כגון כיצד גנים שונים של אורל יכולים להשפיע על גורלם של אבות עובריים. התחל בהליך זה על ידי עיקור כלי החיתוך ומכסה הזרם של הלמינה בהתאם לכתב היד הנלווה.

כדי לקצור את העוברים, הניחו עכברה מורדמת שנמצאת בהריון עם פופים ביום ההריון E 11.5 על מגש החיתוך במכסה המנוע. לאחר מכן, רססו את בטן העכבר באתנול 70%. פתח את חלל הצפק והצמד את הקירות למגש החיתוך.

לאחר מכן משוך החוצה את קרני הרחם כך שינוח בתוך חלל הצפק. בעזרת פינצטה פתחו בזהירות את דופן קרן הרחם. השתמש בכף של 20 מילימטר כדי להסיר בעדינות את העוברים בשק החלמון מהשליה.

לאחר מכן, הניחו את העוברים בצלחת תרבית רקמות בגודל 100 מילימטר. מלא מראש ב -10 מיליליטר סטרילי שחומם מראש פעם אחת PBS. בשלב זה, העבירו את העובר הראשון לצלחת חדשה של 100 מילימטר ממולאת מראש ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי פעמי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הסר בזהירות והשליך את שק החלמון. לאחר מכן מקם את העובר כך שהצד הגבי שלו פונה כלפי מעלה. החזק בעדינות את העובר עם משוטי האלקטרודה של שבעה מילימטר תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

הנח את האלקטרודות אחת בכל צד של הצינור העצבי בגובה החדר הרביעי של המוח האחורי. לאחר מכן, השתמש במזרק של סמ"ק אחד כדי לצייר את תערובת ה-DNA של הפלסמיד ו-0.01% מסך מהיר באופן כללי, 500 מיקרוליטר מהתערובת אמורים להספיק לאלקטרופורציה של לפחות שמונה עד 10 עוברים. לאחר מכן, נקב בעדינות את לוחית הגג המכסה את החדר הרביעי עם מחט טוברקולין בגודל 25 חמש שמיניות המחוברת למזרק CC אחד.

לאחר מכן הזרקו כ-50 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA DI לחדר. הזרקות מוצלחות מאופיינות בתערובת DNA DI הממלאת את כל מערכת החדרים. אמצעי חלופי להעברת תערובת ה-DNA DI יהיה באמצעות גישה למערכת החדרים על ידי ניקוב הקלף, כיסוי המוח האמצעי, הפעלת מחולל הדופקים, ואז העברת חמישה פולסים מרובעים באמצעות מחולל דופק אלקטרודה והאלקטרודה של שבעה מילימטר חותרת ברקמה הקרובה ביותר לאלקטרודה הטעונה חיובית.

תוך כדי קח את הפלסמיד במכסה המנוע של זרימת למינה, מלא את בארות הכיב של צלחת 12 מתורבתת היטב בשני מיליליטר של מדיה DME MF 12 בתוספת סרום בקר עוברי 10%, סרום סוסים 5%, 1% גלוטמין, 1% סטרפטומיצין פניצילין שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. ואז צבט את העובר באמצע בעזרת זוג מלקחיים. הסר את החלק האחורי של העובר לאחר מכן, הנח את החלק הקדמי באחת הבארות המלאות של צלחת התרבות.

חזור על ההליך עבור כל העוברים ומלא רק את הבארות החיצוניות של צלחת 12 הבארות. כדי למנוע זיהום של תרביות תרבית, העוברים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות כדי לבטא את הפלסמיד האלקטרופוט. אם רוצים זמן גידול ארוך יותר, מלאו את בארות הסר של צלחת חדשה של 12 לווייתנים בשני מיליליטר של מדיה D-M-E-M-F 12.

העבירו את העוברים בעזרת כף מעוקרת לבארות של צלחת חדשה. לאחר מכן החזירו אותם לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ותרבו אותם עד 48 שעות כדי לתקן את העוברים לניתוח. ממלאים צלחת של 12 בארות ב-PBS חד פעמי, ואז מעבירים את העוברים ושוטפים בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, תקן את העוברים ב-2% פרלדהיד ב-PBS פעם אחת למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים בפעם אחת PBS בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שוב, לאחר מילוי צלחת חדשה של 12, באר עם 30% סוכרוז בפעם אחת PBS.

העבירו את העוברים לבארות הללו ושיווי משקל בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הטמיעו את העוברים בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית באמצעות אמבט אתנול קרח יבש או אחסנו אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. בחלק הסופי העוברים מקטעים של 30 מיקרון עם קריוסטט.

הרכיבו אותם על מגלשות ואחסנו אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס מבית uni Histochemical. המחקר המוצג בהמשך כאן הוא התוצאות המייצגות של האימונוהיסטוכימיה עבור GFP על החתכים הרוחביים של עובר E 11.5 אלקטרופוט לאחר 24 שעות של תרבית. החיצים המוצגים כאן מציינים את לוחית הגג הלוכדת את הנוגדן המשני.

התוצאות מראות כי האזור האלקטרופוטרי של שפת ה-ROIC התחתונה היה מוגבל ולא השתרע לכל הציר האחורי הקדמי של הצינור העצבי. כאן מוצגות התוצאות של שניים מהחלבונים שנותחו MASH אחד ומתמטיקה אחת. ראינו שרוב העוברים שומרים על רמות ביטוי תקינות לאחר אלקטרופורציה ותרבית בהשוואה לעוברי הביקורת ב-11.5 לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה עד שעתיים אם מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, כעת אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד להשתמש במבחן אלקטרופורציה במבחנה כדי לתפעל את ביטוי הגנים באבות הממברנה העוברית של העכבר.