Name: ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד טכניקת אלקטרופורציה חוץ גופית לשינוי ביטוי גנים בפרוגניטורים של מוח אחורי עוברי עכברים. שיטה זו מאפשרת מניפולציה ממוקדת בנקודות זמן גסטציונליות מוקדמות לחקר התפתחות מוחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ג&#39;יין ג&#39;ונסון עבור Math1, Ngn1, ואת נוגדנים Ptf1a וקוני Cepko עבור pCAG :: GFP פלסמיד. עבודה זו מומנה על ידי NIH 1R15HD059922 R15-01.

1. ההכנות שקדמו electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את ה-DNA על ידי electroporation הכנה מקסי (בפריים זה או Qiagen). הריכוז של ה-DNA צריך להיות מינימום של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לספיגה יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 495 μL של ה-DNA ומערבבים עם μl 5 של גרין מהיר 0.01% ב 1 X PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) בצינור microcentrifuge. </li></ol> 2. העוברית קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים הזדווגויות זמן קבועים של CD-1 בעכברים (הרלן). יש לבדוק את הימצאותם של אטמי בנרתיק ורואים את התאריך תוסף הנרתיק הוא ציין כיום העוברית (E) 0.5. עוברים יהיה לקצור 11 ימים לאחר חזותי תקע (E11.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כלים סטריליים באתנול 70%. פנקו את הזרימה למינרית מכסה המנוע עם האור האולטרה סגול של לפחות שעה אחת לפני השימוש. מכסה המנוע ריסוס, מגש לנתח, וגם לנתח היקף עם אתנול 70%. חום לפני 1 X PBS על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על E11.5 להרדים את הנקבה על פי התנאים שאושרו על ידי מכוןועדת לאומיים לטיפול ושימוש בעלי חיים (ICCUA). מניחים במגש לנתח בשכונה זרימה למינרית. לרסס את הבטן של הנקבה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הצפק ולהצמיד את הקירות למגש לנתח. להוציא את קרני הרחם כך שהיא נשענת בתוך חלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך לפתוח את הקיר של קרן הרחם. בעזרת כף 20 מ&quot;מ (כלים מדעיים פיין) בעדינות כדי להוציא את העובר בתוך שק החלמון מן השליה. עוברים מקום לתוך צלחת 100 מ&quot;מ רקמת התרבות prefilled עם 10 מ&quot;ל של סטרילית 1 X PBS שהיה שחומם מראש ב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל עוברי הנוכחי. </li></ol> 3. Electroporation של עוברים E11.5 (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כף 20 מ&quot;מ, להעביר את העובר הראשון מנה 100 מ&quot;מ חדש prefilled עם 10 מ&quot;ל של 1XPBS סטריליים שהיה שחומם מראש ל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים 11 ס&quot;מ עם קצה 0.05 0.02 מ&quot;מ x (כלים מדעיים פיין) בזהירות מחדשלהעביר וזורקים שק החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר קבוצה, כך בצד הגב שלה פונה כלפי מעלה, כך שהוא דומה הקריקטורה באיור 1 א. השתמש 7 אלקטרודה מ&quot;מ משוטים (הרווארד Apparatus) בעדינות כדי להחזיק את העובר. האלקטרודות יש למקם בכל צד של הצינור העצבי ברמה של החדר למוח האחורי 4. החדר נראה לעין בלתי מזוינת, אך באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה יכול להקל על מיקום ההנעה מדויקת. המיקום של המשוטים הוא קריטי בקביעת האזור שמקבל את ה-DNA electroporated. אם השפה התחתונה rhombic (LRL) למוח האחורי של העוברית הגב הוא הרצוי, משוטים חייב להיות מקום כזה שהם ישירות לאגף את החלק הרחב ביותר של פתיחת החדר 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מזרק 1 סמ&quot;ק להכין את ה-DNA פלסמיד מעורבב עם ירוק מהיר 0.01%. 500 μL של התערובת צריך להיות מספיק electroporation של לפחות 8-10 עוברים (ראה 3.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לנקב OV roofplateerlying החדר 4 עם מחט טוברקולין 25 גרם 5/8 מצורף מזרק 1 סמ&quot;ק להזריק את התערובת-DNA צבע לתוך החדר. זריקות מוצלחות מתאפיינות תערובת ה-DNA צבע מילוי המערכת חדרית שלמה (איור 1 ג). כמות תערובת ה-DNA צבע מוזרק בדרך כלל הוא פחות מ 50 μL. הסכומים המדויקים משתנים בין העוברים כמו חלק תערובת נוטה לדלוף לתוך החדר של PBS המקיף את העובר. אמצעי חלופי של מתן תערובת ה-DNA צבע תהיה דרך גישה למערכת חדרית ידי ניקוב וילונות שמעל המוח התיכון. שוב, זריקות מוצלחות מתאפיינות תערובת ה-DNA צבע מילוי המערכת החדר כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק חמש פולסים מרובעים באמצעות גנרטור חשמלי הדופק (BTX) ו -7 אלקטרודה משוטים מ&quot;מ. כל פעימה הוא 50 V לאורך 5 ms לכל הדופק עם 500 מילישניות בין הדופק בכל. רקמת הקרוב האלקטרודה במטען חיובי תאפשר טאקה את הפלסמיד. </li></ol> 4. תרבות של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה זרימה למינרית, למלא את בארות החיצוניים של מנה של 12 גם בתרבות עם 2 מ&quot;ל של DMEM/F12 התקשורת השלימו עם סרום 10% שור עוברית, 5% סוסים סרום, גלוטמין 1%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין שהיה שחומם מראש עד 37 ° C. התנאים תרבות הותאמו מ דה דייגו ועמיתיו. 15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב זרימה למינרית מכסה המנוע עוברים שלוחץ הבטן (מתחת ללב) עם מלקחיים ולהסיר החלק האחורי של העובר. מניחים את החלק הקדמי לאחת הבארות המלאים של מנה של 12 גם בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל העוברים. למלא רק את בארות החיצוניים של הצלחת 12-היטב כדי למנוע זיהום של תרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות עוברים ב 37 ° C חממה עם 5% CO 2. ביטוי של הפלסמיד electroporated יש הנצפה בתוך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צריך עוד פעמים תרבות להיות הרצוי, למלא את הבארות מתוך צלחת 12 חדש היטב עם 2 מ&quot;ל שלהתקשורת המשמשים 4.1. בעזרת כף להעביר את העוברים עיקור היטב בצלחת החדש. מניחים בחזרה 37 ° C חממה. תרבות של עד 48 שעות אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר זמן תרבות הרצוי הוא הגיע, לתקן עוברים לניתוח (ראה להלן). </li></ol> 5. אופן ההכנה של עוברים לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף עוברים 1 X PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן עוברים לניתוח paraformaldehyde 2% (PFA) ב 1XPBS עבור 2 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף עוברים 1 X PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עוברים סוכרוז 30% ב 1 X PBS לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ עוברים בטמפרטורה אופטימלית מתחם (אוקטובר) חיתוך באמצעות אמבט קרח יבש / אתנול. עוברים ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף עוברים על cryostat (לייקה) ל -30 חלקים מיקרומטר ו הר בשקופיות (VWR, Superfrost פלוס). חנות ב -20 ° C. </li></ol> 6. Immunohistochemistry ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימונוהיסטוכימיה בוצע כמתואר 16. דילולים נוגדנים ראשוניים המשמשים במחקר זה כוללים ארנב α-GFP (Invitrogen) 1:2500, עכבר α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100, ארנב α-Ngn1 (ג&#39;יין ג&#39;ונסון) 1:5000, ארנב α-Ptf1a (ג&#39;יין ג&#39;ונסון ) 1:2500, ארנב Math1 (ג&#39;יין ג&#39;ונסון) 1:100. דגירה שטוח שקופיות, לצד הדגימה על מגש מכתים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות נותחו על מיקרוסקופ מתחם (אולימפוס BX51). </li></ol> 7. נציג תוצאות סכמטית באיור 1 א &#39;מתאר את הניסוי electroporation. 1B איור מראה נוף sagittal העובר E11.5 לפני מניפולציה. העובר גם לאחר הזרקה של החטיבה פלסמיד המכיל :: GFP בירוק מהיר 0.01% מוצגת באיור 1 ג ו העובר שאינו מקובע נציג מציג GFP חד צדדיתביטוי התרבות למוח האחורי הגב 24 שעות הבאה מוצג איור 1D. היקף בתחום LRL כי הוא electroporated בהצלחה הוא משתנה נראה תלויה מאוד המיקום של האלקטרודות. במחקרים שלנו נמצא כי 52 מתוך 65 (80%) של עוברי electroporated בהצלחה לידי ביטוי ה-GFP. רקמת נחשב להיות electroporated בהצלחה אם זה היה חיובי GFP באזורים מקומיים על כמה סעיפים לאחר ניתוח קיבוע immunohistochemical (ראה להלן). העוברים שלא הצליחו לענות על הקריטריונים דורגו כמו ניסיונות לא מוצלחים ב electroporation. הערכה נוספת של יעילות electroporation ניתן לוודא על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה נגד ה-GFP על חלקים רוחביים של עוברי electroporated ברמה של החדר 4. תרשים 2 מציג חלקים סדרתיים נציג מעובר הצגת חד צדדיתה-GFP. איור 2 א הביטוי מראה סכימטי אידיאלית כי זה ממחיש את הצד השמאלי של העובר היה לכיוון האלקטרודה החיובית. חלקים רוחביים (ברמות המיוצגים על ידי קריקטורה אמצע איור 2 א) לחשוף את הביטוי GFP מקומי אך ורק בצד שמאל של רקמת למוח האחורי (איורים 2 ג ו 2 ד). אזור electroporated של LRL לא להאריך את ציר כולו הקדמי, האחורי של הצינור העצבי כמו בחינת סעיפים 300 מיקרומטר מקורי או יותר לזה שמוצג באיור 2 ג אין אקספרס GFP (איור 2 ב). השירות של assay זה מניפולציה של ביטוי גנים תלוי ביציבות של תחומים ביטוי חלבונים אנדוגניים. LRL התאפיינה כבעל תחומים אב ייחודיים המאופיינים ביטוי ההפרש של גורמי תעתוק proneural (נבדקה ב 1).תת קבוצה של גורמים אלה (Mash1, Math1, Ngn1, ו Ptf1a) נבחרו לניתוח בשל ו המוצע / או תפקידים שאפיינו במפרט של תת עצביים precerebellar ב LRL, נושא למחקרים עתידיים 16-18. כל ארבעה חלבונים יש תחומים הביטוי האופייניות ביותר ב למוח האחורי הזנב ב E11.5 16-18. הבחנו כי עוברים שהונחו תרבויות הצליחו להגדיל את שטחו וגם לא ליזום הייצור של האפיתל מקלעת דמית העין ו invagination של אירועים, LRL ו roofplate מורפולוגיים המתרחשים בין E11.5 ו E12.5 5. בהתבסס על תצפיות אלה נקבע כי התפתחות תקינה של עוברים אלה הופסק או עוכב גסה ואת השליטה להשוות את העוברים בתרבית צריך להיות עוברים שאין להם תרבות ב E11.5. על מנת להבטיח כי תרבות electroporation לא להפריע רמות של חלבונים אנדוגניים, ניתחנו ארבעה חלבונים שונים על ידי immunohistochemistry (IHC) ב -34 עוברים שונים שהיו electroporated ותרבותיים אז עבור שעות לפחות 24. לוח מראה את מספר העוברים ניתוח לכל הסמן כל אחוז העוברים ניתחו כי שמר על רמות חלבון נורמלי. איור 3 מציג נציג IHC נתונים מ 2 חלבונים ניתחו, Mash1 (איורים 3 א ו 3 ב) ו Math1 (איורים 3C ו 3D). הבחנו כי רוב העוברים שמר רמות נורמליות של electroporation הביטוי הבא ותרבות (איורים 3 ב ו 3D) לעומת העוברים הבקרה E11.5 (איורים 3 א ו 3 ג). חשוב לציין, תחומים הביטוי האופייני של חלבונים אלה לא היו מוטרדים. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Electroporation העוברים על E11.5. () סכמטי של הelectroporation דואר הניסוי. העובר E11.5 מופרד ביטוי פלסמיד בירוק מהיר 0.01% מוזרק לתוך החדר הרביעי. העובר הוא מוקף מכן על ידי משוטים האלקטרודה נתון 50 V הדופק לפני שיוצבו בתרבות (ב &#39;) צפו sagittal העובר E11.5 לפני ההזרקה. (ג) העובר באותו E11.5 בעקבות הזרקת פלסמיד בירוק מהיר 0.01%. (ד) ביטוי למוח האחורי חד צדדי של ה-GFP שנצפתה העובר E11.5 לאחר 24 שעות של תרבות. MB-המוח התיכון, 4V-4 החדר. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הביטוי של ה-GFP של רקמות Electroporated. (א &#39;) קריקטורה משמאל מתאר את המיקום של אלקטרודות סביב העובר E11.5. הקריקטורה מתארת ​​את ספיגת התיכון ולהביא לידי ביטוי את ה-GFP קידוד פלסמיד בצד השמאלי של העובר. בקריקטורה מימין הוא סכימטי של סעיף רוחבי האידיאלי לקחת את העובר על levels כונה על ידי קווים שחורים הקריקטורה התיכון. (ב-D) אימונוהיסטוכימיה של ה-GFP על חלקים רוחביים באמצעות העובר E11.5 electroporated לאחר 24 שעות של תרבות. החיצים מצביעים על (RP) roofplate אשר מלכודות נוגדנים משני. תמונות נלקחים בהגדלה 10X. הרמות היחסיות של הסעיפים המוצגים מתוארים על ידי הקווים האופקיים באמצעות קריקטורה התיכון (). MB-המוח התיכון, 4V-4 החדר אני, RP-roofplate. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ביטוי של חלבונים אנדוגניים השפה Rhombic תחתון אימונוהיסטוכימיה עבור Mash1 (A ו-B) או Math1 (C ו-D) השוואת חלקים רוחביים של עוברי E11.5 שלא היו מתורבת (C) עם העוברים שהיו electroporated עם החטיבה.: : GFP ותרבותיים עבור שעה 24 (B ו-D). תמונות שצולמו בהגדלה של 10X. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Proneural Transcriptiעל פקטור ניתחו </td><td> מספר העוברים ניתחו </td><td> אחוז שימור דפוסי הביטוי רגיל </td></tr><tr><td> Math1 </td><td> 15 </td><td> 86.7% </td></tr><tr><td> Mash1 </td><td> 12 </td><td> 83.3% </td></tr><tr><td> Ngn1 </td><td> 7 </td><td> 71.4% </td></tr><tr><td> Ptf1a </td><td> 6 </td><td> 100% </td></tr></tbody></table> לוח ט אחוז העוברים Electroporated ותרבותיים תמך רגיל Proneural גורם שעתוק דומיינים ב LRL.

<ol><li>Ray, R. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rautenlippe+Redux+--+toward+a+unified+view+of+the+precerebellar+rhombic+lip%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip.</a> Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li>
<li>Wingate, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+rhombic+lip+in+avian+cerebellum+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The role of the rhombic lip in avian cerebellum development.</a> Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+Cerebellar+System%3A+In+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+function%22">Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+brainstem+cochlear+nuclear+complex+is+revealed+by+intersectional+and+subtractive+genetic+fate+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps.</a> Neuron. 50, 205-218 (2006).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+the+precerebellar+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Origin of the precerebellar system.</a> Neuron. 27, 475-486 (2000).</li>
<li>Taber-Pierce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+nuclei+griseum+ponitis%2C+corporis+pontobulbaris+and+reticularis+tegmenti+pontis+%28bechterew%29+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse.</a> J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).</li>
<li>Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+levels+regulate+mossy+fiber+neuron+position+and+axon+laterality+choice+in+the+ventral+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem.</a> Neuroscience. 162, 560-573 (2009).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+cadherins+regulate+tangential+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).</li>
<li>Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+nucleogenesis+of+mouse+precerebellar+neurons+visualized+by+in+utero+electroporation+of+a+green+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene.</a> Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).</li>
<li>de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+on+the+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla.</a> Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).</li>
<li>Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+rhombic+lip+is+comprised+of+discrete+progenitor+cell+populations+allocated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6.</a> Neuron. 48, 933-947 (2005).</li>
<li>Hoshino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47, 201-213 (2005).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+climbing+fiber+neurons+and+their+developmental+dependence+on%5BTitle%5D)+AND+%22Ptf1a.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on.</a> Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בטכניקה electroporation במבחנה הציג במחקר זה היא מתודולוגיה חדשנית יכול להיות מנוצל ביעילות לתמרן ביטוי גנים העוברים מתחת לגיל 12 ימים של הריון. המיקום של העוברים לתוך תרבות מאפשרת ביטוי של גן הציג עוקף הקטלניות נצפתה כאשר עוברים electroporated מותר להישאר in vivo. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים עובריים אבות שהיו נגישים בעבר עבור electroporation מבוססי מחקרים. הטכניקה electrop...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> CM-1850 </td><td></td></tr><tr><td> Biologie עצה Dumoxel טיפול דומונט מלקחיים </td><td> כלים מדעיים יפות </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 מ&quot;מ מוריה כף מחוררת </td><td> כלים מדעיים יפות </td><td> 10370-17 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 electroporation כיכר Wave Generator </td><td> BTX (VWR) </td><td> 47745-928 </td><td></td></tr><tr><td> הרווארד Apparatus Tweezertrodes 7 מ&quot;מ * אלקטרודות </td><td> BTX (פישר) </td><td> BTX450165 </td><td></td></tr><tr><td> פישר Isotemp CO 2 החממה </td><td> דיג </td><td> 1325525 </td><td></td></tr><tr><td> NAPCO CO 2 גז הרגולטור </td><td> דיג </td><td> 15497020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ובכן בתרבית רקמה צלחות </td><td> BD פלקון (פישר) </td><td> 877229 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone נוזלי מדיה DMEM/F-12 (1:1), עם גלוטמין-L ו HEPES: 500 מ&quot;ל </td><td> Thermo Scientific (פישר) </td><td> SH3002301 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * תורמים סוסים סרום </td><td> Thermo Scientific (פישר) </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> העובר שור סרום, מוסמך, מומת חום </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-063 </td><td></td></tr><tr><td> cellgro * 10,000 IU פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין </td><td> Mediatech (פישר) </td><td> MT-30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * L-גלוטמין L-גלוטמין: 200mM ב NaCl 0.85% </td><td> Thermo Scientific (פישר) </td><td> SH3003401 </td><td></td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> דיג </td><td> AC41053-0250 </td><td> 0.01% </td></tr></tbody></table>

ב electroporation חוץ גופית של השפה rhombic התחתון של עוברי עכברים midgestation

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

השפה היא rhombic neuroepithelium עובריים למוח האחורי ממוקם בצומת שבין הצינור העצבי ואת roofplate של החדר הרביעי (בדיקה ב 1). השפה rhombic נחלקים השפה rhombic העליון (URL) הכולל rhombomere 1 (R1), ויוצר הנוירונים של המוח הקטן ואת השפתיים rhombic נמוך (LRL), אשר מעלה את מגוון שושלות גזע המוח נוירונים 2-4. נגזרים LRL כוללים הנוירונים קולי של גרעינים שבלול ושל גרעינים precerebellar המעורבים בוויסות איזון ושליטה מוטורית 5-8. Neurogenesis מ LRL מתרחשת מעל חלון הזמני גדול שמקיף ימים עובריים (ה) 9.5-16.5 5, 9. שושלות עצביים שונים לצאת מן LRL כמו תאים postmitotic (או נולדו) במהלך ימים התפתחותיים שונים במהלך חלון זה neurogenic. Electroporation של מבנים ביטוי גנים יכולה לשמשלתפעל ביטוי גנים אבות LRL ואף עלולים לשנות את גורלם של נוירונים המופקים באזור זה 10-12. ביטוי גנים שינוי של אבות LRL של העכבר באמצעות ב electroporation ברחם היה מוצלח מאוד עבור מניפולציה שושלות שנולדו ביום עובריים E12.5 או במאוחר 10, 12-14. ב electroporations ברחם לפני E12.5 לא הצליחו בעיקר בשל הקטלניות קשור ניקוב roofplate החדר הרביעי, צעד הכרחי באספקת DNA אקסוגני אשר electroporated אל LRL. עם זאת, רבים שושלות הנגזרות LRL נובעים LRL לפני E12.5 9. שושלות אלו שנולדו לפני כן כוללים הנוירונים המרכיבים את הרשתית לרוחב, דמויי יתד? חיצוני, גרעינים olivary הנחות של מערכת precerebellar שבה לתפקד להתחבר כניסות מ חוט השדרה אל קליפת המוח הקטן 5. על מנת לתפעל ביטוי LRLעוברים מתחת לגיל E12.5, פיתחנו במערכת במבחנה שבה עוברים ממוקמים בתרבות בעקבות electroporation. מחקר זה מציג שיטה יעילה ואפקטיבית על מניפולציה של ביטוי גנים של אבות LRL ב E11.5. עוברים electroporated עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מונע מן האמרגן החטיבה פעילה רחב reproducibly הביע GFP לאחר 24 שעות של תרבות. היבט חשוב של assay זה הוא ביטוי גנים משתנה רק בגלל הביטוי של הגן אקסוגני ולא בגלל השפעות משניות הנובעות electroporation וטכניקות culturing. נקבע כי ביטוי את דפוסי גנים אנדוגניים להישאר ללא הפרעה עוברים electroporated ותרבותיים. Assay זה יכול להיות מנוצל כדי לשנות את גורלו של תאים המתפתחים מתוך LRL של עוברים מתחת לגיל E12.5 באמצעות הקדמה של פלסמידים עבור ביטוי יתר או להפיל (באמצעות RNAi) של אחר בעדגורמי שעתוק עצביים.

המחקר מתאר את התפתחות<em&gt; במבחנה</em&gt; Electroporation טכניקה המאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים שפתיים rhombic התחתון של עוברי midgestation.

ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

השפה המעוינת (rhombic lip) היא נוירואפיתל עוברי הממוקם במוח האחורי, בחיבור שבין צינור העצבים לבין לוח הגג (roofplate) של הגומחה הרביעית...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשפיע על ביטוי הגנים בתאי אב (progenitors) של המוח האחורי העוברי, באמצעות הכנסת DNA פלסמיים על ידי אלקטרופורציה בנקודות זמן מוקדמות יותר של ההיריון. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד עוברים ביום ה-11.5 להריון וסידורם כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה בתמיסת סליין פוספטית (PBS) סטרילית. השלב השני הוא הזרקת כ-50 µL של הפלסמיד לביטוי ב-0.01% fast green.בהזרקה מוצלחת, כל מערכת הפרוקיות תתמלא בתערובת ה-DNA fast green. לאחר מכן, העובר יעבור פולס חשמלי. הצד של העובר הקרוב ביותר לאלקטרודה בעלת המטען החיובי יספוג את ה-plasmid DNA.הצד השני ישמש כביקורת שלילית פנימית. השלב הסופי הוא העברת העוברים לתרבית רקמות למשך 24 שעות לפחות. בסופו של דבר, הגן שעבר אלקטרופורזה יבטא עצמו לאחר 24 שעות של תרבית וניתן יהיה להעריכו באמצעות אימונוהיסטוכימיה.היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לבצע מניפולציה של תאי פרוגניטורים של המוח האחורי העוברי בנקודות זמן מוקדמות יותר של ההיריון. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום, כגון כיצד גנים עצביים שונים יכולים להשפיע על גורלם של פרוגניטורים עובריים. התחילו את הפרוצדורה על ידי עיקור כלי הניתוח ומנדף הזרימה הלמינרית בהתאם לכתב היד המצורף.כדי לקצור את העובריים, הניחו על מגש הניתוח בתוך המנדף נקבת עכבר שהורדמה והיא בהריון ביום גסטציוני E 11.5. לאחר מכן, רססו את בטנו של העכבר ב-70% ethanol. פתחו את חלל הפריטונאום והקבעו את הדפנות למגש הניתוח באמצעות סיכות.לאחר מכן, משכו החוצה את קרני הרחם כך שיישענו בתוך חלל הפריטונאום. בעזרת פינצטה, פתחו בזהירות את דופן קרן הרחם. השתמשו בכף של 20 millimeter כדי להוציא בעדינות את העוברים בשק החלמון מהשליה.לאחר מכן, העבירו את העוברים לכלי תרבית רקמות בנפח 100 מילימטר, הממולא מראש ב-10 מיליליטר של 1x PBS סטרילי שחומם מראש. בשלב זה, העבירו את העובר הראשון לכלי 100 מילימטר חדש, הממולא מראש ב-10 מיליליטר של 1x PBS סטרילי שחומם מראש ל-37 °C.בשלב הבא, הסר בזהירות את שקיק החלמון והשלך אותו. לאחר מכן, מקם את העובר כך שצדו הגבי (dorsal) פונה כלפי מעלה. החזק בעדינות את העובר באמצעות אלקטרודות בעלות פלטות של שבעה מילימטרים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.מקמו את האלקטרודות משני צדי צינור העצבים בגובה החדר הרביעי של המוח האחורי. לאחר מכן, השתמשו במזרק של 1 cc כדי לשאוב את התערובת של ה-plasmid DNA ו-0.01% Fast screen; באופן כללי, 500 µL מהתערובת אמורים להספיק לאלקטרופורציה של לפחות שמונה עד 10 עוברים. לאחר מכן, נקבו בעדינות את ה-roof plate המכסה את החדר הרביעי באמצעות מחט טוברקולין במידה 25 gauge ואורך 5/8 אינץ', המחוברת למזרק ה-1 CC.לאחר מכן, הזרק כ-50 µL של תערובת ה-DNA DI לתוך החדר. הזרקות מוצלחות מאופיינות במילוי של כל מערכת החדרים על ידי תערובת ה-DNA DI. דרך חלופית להחדרת תערובת ה-DNA DI תהיה באמצעות גישה למערכת החדרים על ידי ניקוב ה-vellum, המכסה את המוח האמצעי; הפעל את מחולל הפולסים, ולאחר מכן הוסף חמישה פולסים מרובעים באמצעות מחולל פולסים אלקטרודי ומגדי אלקטרודות של 7 mm לרקמה הקרובה ביותר לאלקטרודה בעלת המטען החיובי.בזמן שאתם לוקחים את הפלסמיד תחת מנדף זרימה למינרית, מלאו את בארות הגידול של צלחת תרבית בעלת 12 בארות בשני מיליליטרים של מצע DME MF 12 המועשר ב-10% fetal bovine serum, 5% equine serum, 1% glutamine, 1% penicillin streptomycin שחומם מראש ל-37 °C. לאחר מכן, צבטו את העובר במקטע האמצעי באמצעות פינצטה. הסירו את החלק האחורי של העובר, והניחו את החלק הקדמי באחת מהבארות המלאות בצלחת התרבית.חזרו על הפרוצדורה עבור כל העוברים ומלאו רק את הבארים החיצוניות של פלטת 12 הבארים. כדי למנוע זיהום של התרביות, דגרו את העוברים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 24 שעות לצורך ביטוי הפלסמיד שעבר אלקטרופורציה. אם נדרש זמן דגירה ממושך יותר, מלאו את הבארים של צלחת 12 בארים חדשה בשני מיליליטר של מצע D-M-E-M-F 12.העבירו את העוברים באמצעות כף סטרילית לבארות של פלטה חדשה. לאחר מכן, החזירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וגדלו אותם למשך עד 48 שעות כדי לקבע את העוברים לצורך אנליזה. מלאו פלטה של 12 בארות ב-one times PBS, לאחר מכן העבירו את העוברים ושטפו בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך חמש דקות.בשלב הבא, קבעו את העובריים ב-2%paraldehyde ב-one times PBS למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב-one times PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שוב, לאחר מילוי פלטה חדשה של 12 בארות ב-30%sucrose ב-one times PBS.העבירו את העוברים לבארים אלו והמתינו להשגת שיווי משקל למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, הטמיעו את העוברים בתרכובת OCT (optimal cutting temperature compound) באמצעות אמבט של אתנול וקרח יבש, או שמרו אותם בטמפרטורה של 20- °C. לבסוף, בצעו חיתוך של העוברים לפרוסות בעובי 30 µm באמצעות קריוסטט.העלה אותם על זכוכיות והשמר אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עבור צביעה היסטוכימית. המחקר המוצג כאן מראה תוצאות מייצגות של צביעה אימונוהיסטוכימית ל-GFP בחתכים רוחביים של עובר E 11.5 שעבר אלקטרופורציה לאחר 24 שעות של תרבית. החצים המוצגים כאן מצביעים על ה-roof plate, אשר לוכד את הנוגדן המשני.התוצאות מראות כי האזור שעבר אלקטרופורציה בשפה התחתונה של ה-ROIC היה מוגבל ולא התפשט לכל הציר הקדמי-אחורי של צינור העצבים. כאן מוצגות התוצאות של שניים מהחלבונים שנותחו, MASH one ו-math one. הבחנו כי רוב העוברים שומרים על רמות ביטוי נורמליות לאחר אלקטרופורציה ותרבית בהשוואה לעוברים בקבוצת הביקורת ביום 11.5. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן השימוש במבחן electroporation in vitro למניפולציה של ביטוי גנים בתאי פרוגניטור של קרומי העובר בעכבר.

in-vitro-electroporation-lower-rhombic-lip-midgestation-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

אנו מדגימים שיטה להשתלת תאים מתורבתים לאתרים מוגדרים של עוברי עכברים מוקדמים כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם in vivo. אנו מציגים גם שיטת אלקטרופורציה אופטימלית המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת העברה מדויקת של DNA אקסוגני לכמה תאים בעוברים.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

למד טכניקת אלקטרופורציה חוץ גופית לשינוי ביטוי גנים בפרוגניטורים של מוח אחורי עוברי עכברים. שיטה זו מאפשרת מניפולציה ממוקדת בנקודות זמן גסטציונליות מוקדמות לחקר התפתחות מוחית.

ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

גלה סרטונים נוספים