ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

המטרה הכללית של הליך זה היא להשפיע על ביטוי הגנים בתאי אב (progenitors) של המוח האחורי העוברי, באמצעות הכנסת DNA פלסמיים על ידי אלקטרופורציה בנקודות זמן מוקדמות יותר של ההיריון. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד עוברים ביום ה-11.5 להריון וסידורם כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה בתמיסת סליין פוספטית (PBS) סטרילית. השלב השני הוא הזרקת כ-50 µL של הפלסמיד לביטוי ב-0.01% fast green.

בהזרקה מוצלחת, כל מערכת הפרוקיות תתמלא בתערובת ה-DNA fast green. לאחר מכן, העובר יעבור פולס חשמלי. הצד של העובר הקרוב ביותר לאלקטרודה בעלת המטען החיובי יספוג את ה-plasmid DNA.

הצד השני ישמש כביקורת שלילית פנימית. השלב הסופי הוא העברת העוברים לתרבית רקמות למשך 24 שעות לפחות. בסופו של דבר, הגן שעבר אלקטרופורזה יבטא עצמו לאחר 24 שעות של תרבית וניתן יהיה להעריכו באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לבצע מניפולציה של תאי פרוגניטורים של המוח האחורי העוברי בנקודות זמן מוקדמות יותר של ההיריון. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום, כגון כיצד גנים עצביים שונים יכולים להשפיע על גורלם של פרוגניטורים עובריים. התחילו את הפרוצדורה על ידי עיקור כלי הניתוח ומנדף הזרימה הלמינרית בהתאם לכתב היד המצורף.

כדי לקצור את העובריים, הניחו על מגש הניתוח בתוך המנדף נקבת עכבר שהורדמה והיא בהריון ביום גסטציוני E 11.5. לאחר מכן, רססו את בטנו של העכבר ב-70% ethanol. פתחו את חלל הפריטונאום והקבעו את הדפנות למגש הניתוח באמצעות סיכות.

לאחר מכן, משכו החוצה את קרני הרחם כך שיישענו בתוך חלל הפריטונאום. בעזרת פינצטה, פתחו בזהירות את דופן קרן הרחם. השתמשו בכף של 20 millimeter כדי להוציא בעדינות את העוברים בשק החלמון מהשליה.

לאחר מכן, העבירו את העוברים לכלי תרבית רקמות בנפח 100 מילימטר, הממולא מראש ב-10 מיליליטר של 1x PBS סטרילי שחומם מראש. בשלב זה, העבירו את העובר הראשון לכלי 100 מילימטר חדש, הממולא מראש ב-10 מיליליטר של 1x PBS סטרילי שחומם מראש ל-37 °C.

בשלב הבא, הסר בזהירות את שקיק החלמון והשלך אותו. לאחר מכן, מקם את העובר כך שצדו הגבי (dorsal) פונה כלפי מעלה. החזק בעדינות את העובר באמצעות אלקטרודות בעלות פלטות של שבעה מילימטרים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

מקמו את האלקטרודות משני צדי צינור העצבים בגובה החדר הרביעי של המוח האחורי. לאחר מכן, השתמשו במזרק של 1 cc כדי לשאוב את התערובת של ה-plasmid DNA ו-0.01% Fast screen; באופן כללי, 500 µL מהתערובת אמורים להספיק לאלקטרופורציה של לפחות שמונה עד 10 עוברים. לאחר מכן, נקבו בעדינות את ה-roof plate המכסה את החדר הרביעי באמצעות מחט טוברקולין במידה 25 gauge ואורך 5/8 אינץ', המחוברת למזרק ה-1 CC.

לאחר מכן, הזרק כ-50 µL של תערובת ה-DNA DI לתוך החדר. הזרקות מוצלחות מאופיינות במילוי של כל מערכת החדרים על ידי תערובת ה-DNA DI. דרך חלופית להחדרת תערובת ה-DNA DI תהיה באמצעות גישה למערכת החדרים על ידי ניקוב ה-vellum, המכסה את המוח האמצעי; הפעל את מחולל הפולסים, ולאחר מכן הוסף חמישה פולסים מרובעים באמצעות מחולל פולסים אלקטרודי ומגדי אלקטרודות של 7 mm לרקמה הקרובה ביותר לאלקטרודה בעלת המטען החיובי.

בזמן שאתם לוקחים את הפלסמיד תחת מנדף זרימה למינרית, מלאו את בארות הגידול של צלחת תרבית בעלת 12 בארות בשני מיליליטרים של מצע DME MF 12 המועשר ב-10% fetal bovine serum, 5% equine serum, 1% glutamine, 1% penicillin streptomycin שחומם מראש ל-37 °C. לאחר מכן, צבטו את העובר במקטע האמצעי באמצעות פינצטה. הסירו את החלק האחורי של העובר, והניחו את החלק הקדמי באחת מהבארות המלאות בצלחת התרבית.

חזרו על הפרוצדורה עבור כל העוברים ומלאו רק את הבארים החיצוניות של פלטת 12 הבארים. כדי למנוע זיהום של התרביות, דגרו את העוברים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 24 שעות לצורך ביטוי הפלסמיד שעבר אלקטרופורציה. אם נדרש זמן דגירה ממושך יותר, מלאו את הבארים של צלחת 12 בארים חדשה בשני מיליליטר של מצע D-M-E-M-F 12.

העבירו את העוברים באמצעות כף סטרילית לבארות של פלטה חדשה. לאחר מכן, החזירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וגדלו אותם למשך עד 48 שעות כדי לקבע את העוברים לצורך אנליזה. מלאו פלטה של 12 בארות ב-one times PBS, לאחר מכן העבירו את העוברים ושטפו בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך חמש דקות.

בשלב הבא, קבעו את העובריים ב-2%paraldehyde ב-one times PBS למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב-one times PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שוב, לאחר מילוי פלטה חדשה של 12 בארות ב-30%sucrose ב-one times PBS.

העבירו את העוברים לבארים אלו והמתינו להשגת שיווי משקל למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, הטמיעו את העוברים בתרכובת OCT (optimal cutting temperature compound) באמצעות אמבט של אתנול וקרח יבש, או שמרו אותם בטמפרטורה של 20- °C. לבסוף, בצעו חיתוך של העוברים לפרוסות בעובי 30 µm באמצעות קריוסטט.

העלה אותם על זכוכיות והשמר אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עבור צביעה היסטוכימית. המחקר המוצג כאן מראה תוצאות מייצגות של צביעה אימונוהיסטוכימית ל-GFP בחתכים רוחביים של עובר E 11.5 שעבר אלקטרופורציה לאחר 24 שעות של תרבית. החצים המוצגים כאן מצביעים על ה-roof plate, אשר לוכד את הנוגדן המשני.

התוצאות מראות כי האזור שעבר אלקטרופורציה בשפה התחתונה של ה-ROIC היה מוגבל ולא התפשט לכל הציר הקדמי-אחורי של צינור העצבים. כאן מוצגות התוצאות של שניים מהחלבונים שנותחו, MASH one ו-math one. הבחנו כי רוב העוברים שומרים על רמות ביטוי נורמליות לאחר אלקטרופורציה ותרבית בהשוואה לעוברים בקבוצת הביקורת ביום 11.5. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן השימוש במבחן electroporation in vitro למניפולציה של ביטוי גנים בתאי פרוגניטור של קרומי העובר בעכבר.