קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

יישומים המשתמשים בתאים עטופים בטיפות קטנות בגודל פיקוליטר הוגבלו לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת לשלוט במספר התאים לטיפה. פרוטוקול זה מדגים שיטה לשליטה באנקפסולציה של תאים על ידי שילוב של שתי תופעות מיקרופלואידיות נפרדות, סדר תאים דינמי נוזלי ויצירת טיפות בזרבובית מיקרו ממקדת זרימה. בערוץ במעלה הזרם, ניתן קצב זרימה גבוה מספיק של תמיסה מימית עם תאים או חלקיקים תלויים כדי לגרום להיווצרות רכבות עם מרווח שווה בכיוון הזרימה במורד הזרם.

זרבובית ליצירת טיפות מיקוד זרימה משמשת ליצירת טיפות מימיות בקצבי קילו-הרץ בנוזל נושא שמן קביל מיוצב על ידי פעילי שטח. רכבות חלקיקי התא המסודרות משולבות לאחר מכן עם ייצור טיפות על ידי כוונון קצבי זרימת המים והשמן כדי לספק קצבי ייצור טיפות המסונכרנים עם הגעתם של תאים או חלקיקים מסודרים לאורך לזרבובית ייצור הטיפה, בעוד שחלקיקים משמשים כתחליפים לתאים. כדי להדגים פרוטוקול זה קצבי הזרימה חייבים להיות קטנים מספיק כדי להגביל את הנוזל.

לחצים עצומים על תאים ביולוגיים, חפיפה של סדר התאים, יצירת טיפות וכדאיות התא. אילוצי קצב זרימה מימיים מספקים משטר תפעולי אידיאלי למעטפת מבוקרת של תאים בודדים ומרובים. ניתוח נתוני מיקרוסקופיית וידאו מראה כי יעילות אנקפסולציה של תאים בודדים וכפולים או חלקיקים עולה על יעילות אנקפסולציה אקראית ומפחית מאוד את מספר הטיפות, שאינן מכילות את המספר הרצוי של תאים או חלקיקים.

כליאת תאים וטיפות מגבילה את דילול הפרשות התאים, מדגישה את ההטרוגניות של התאים וגם שולטת באותות בין-תאיים בהשוואה לתרחיף בתפזורת. אמצעים יעילים לעטיפת תאים אלה לטיפות מספקים כלי רב ערך לחוקרים ביולוגיים להתחיל בהליך זה. תכנן תבנית מיקרו-ערוצים כפי שמוצג באיור זה בתוכנת AutoCAD.

קטע התעלה הארוך מייצג את תעלת סדר הזרימה המימית ברוחב של 27 מיקרון. סכימת הזרבובית המוגדלת מציגה רוחב תעלה שווה של 27 מיקרון עבור תעלת ההזמנה המימית ותעלת השמן, ואחריה התכווצות הזרבובית של 22 מיקרון והתרחבות פתאומית לתעלה רחבה יותר של 61 מיקרון. גובה המכשיר הוא 52 מיקרון.

גם למפרצונים מימיים וגם למפרצוני שמן יש מסנני פסולת גדולים עם מרווחים בסדר רוחב תעלת ההזמנה כפי שמודגם על ידי סכימה מוגדלת זו של כניסת השמן. המוצג. הנה תמונה אמיתית של תעלת ההזמנה והזרבובית שהוזרקה בצבע. העסיק יצרן צד שלישי כדי להדפיס מסכת שקיפות ברזולוציה גבוהה על סרט מיילר או קוורץ שבו הערוצים שקופים על רקע כהה.

לאחר מכן צור מאסטר פוטו-רזיסט סיליקון ו-SU 8 ליציקת העתק. הדביקו את תבנית המאסטר על תחתית צלחת פטרי ליציקת העתק PDMS. לאחר השלמת יציקת העתק וקווי המתאר של המכשיר נחתכו, השתמש באגרוף ביופסיה בקוטר חיצוני של 0.75 מילימטר כדי לנקב יציאות נוזליות בשלושת האזורים העגולים המוצגים באיור זה סקוטש יקר לצד התבנית של ה-PDMS ולקלף כדי להסיר אבק לאחר הדבקת פלזמה.

ה-PDMS לשקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה. מכניסים את המכשיר כולו לתנור ומחממים את התנור בהדרגה ל -120 מעלות צלזיוס. השאירו את המכשיר בתנור של 120 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים את ההדבקה ולהחזיר את ה-PDMS למצבו ההידרופובי המקורי

שיטה חלופית להפיכת משטח הזכוכית של התעלה להידרופובי היא הזרקת ציפוי כגון אקווה לתוך יציאות הנוזל ולאחר מכן טיהור באוויר. בעזרת מזרק מיליליטר אחד ומחט מזרק שאבו פנימה כמה מאות מיקרוליטרים של אוויר, ואחריו כמות זעירה של אקיל מספיק כדי למלא רק את מזרק המתכת קצה בזהירות, אך הזרקו היטב את האקווה ואחריו האוויר המטהר לתוך יציאות הנוזל. מבלי לשבור את ה-PDMS לזכוכית באגרסיביות.

חזור על טיהור האוויר בכל יציאות הכניסה והיציאה תוך ניגוב עודפי אקווה על מנת למנוע משקעים שעלולים לסתום את התעלות בעת הייבוש. שליטה בריכוז התאים חיונית להשגת מספר התאים הנכון למספר הטיפות הנכון. יש לכך שני מרכיבים מאתגרים.

הראשון הוא הערכת הריכוז הנכון מראש, והשני הוא שמירה על ריכוז זה במהלך הניסוי עבור המכשיר המסוים ששימש במחקר זה, שמונה עד 15 מיקרון תאים או חלקיקים צריכים להזמין כראוי לאנקפסולציה מבוקרת. בהדגמה זו, מיקרוספירות יומן פוליס 9.9 מיקרון ישמשו כתחליפים לתאים להכנת ריכוז תרחיף החלקיקים המימיים כדי להשיג אנקפסולציה אידיאלית של ביקורת, התחל עם ריכוז מלאי מיקרוספרה של 1% מוצקים לפי משקל תוך שימוש בנתונים קודמים להזמנה מלאה. כמדריך, הגדל את הריכוז ל-1.5% מוצקים על ידי צנטריפוזיה עדינה של מיליליטר אחד מדגימת המלאי, הסרת 250 מיקרוליטר של נוזל סופינט ו-Resus משהה את החלקיקים על ידי ערבוב מערבולת או ערבוב עדין יותר.

בעת שימוש בתאים, גם לתאים וגם לחלקיקי פוליסטירן יש משקל סגולי גדול מאחד, אם כי לא מוצג בסרטון זה. עבור ניסויים ארוכי טווח הנמשכים בסדר גודל של דקות עד שעות רבות, התמיסה עשויה להיות מותאמת לציפה על ידי הוספת מומס כגון סידן כלורי לחלקיקים או אופטי פרפ לתאים. לאחר שמתלה התא או החלקיקים מוכן, הכינו דגימה של 10 מיליליטר של שלב הנפט הפלואורו-פחמן הרציף במערבולת צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

מערבבים את חומר פעילי השטח ושמן הפלואורוקרבון למשקל של כ-2.5%. כאן אנו משיגים תערובת משקל של 2.4 במשקל, המקובלת להקים את ניסוי המיקרו אנקפסולציה. ראשית, הפעל את הכוח עבור המיקרוסקופ האופטי ההפוך והמצלמה המהירה.

התמקדו בשכבת המיקרו-ערוצים ובדקו את התעלות לאיתור סתימות ופסולת שעלולה להיעקר. בחר ערוץ נקי מפסולת גדולה או סתימות ברורות. חתוך שלושה אורכים של צינורות PVC שקופים טיגון לכניסת שמן הכניסה המימית ויציאת האמולסיה כדי למזער את הנפח המת.

חותכים מספיק צינורות כדי להגיע ממשאבות המזרק למיקרוסקופ. שלב צינורות חתוכים מסתיימים בזווית של 45 מעלות כדי להקל על ההחדרה ליציאות הנוזל, השתמש בפינצטה כדי ללחוץ על קצוות הצינור לתוך יציאות הנוזל. לאחר מכן לחץ על מחט מזרק נירוסטה עם קצה קהה של 30 מד לקצה החופשי של צינור הכניסה הימי.

חזור על הפעולה עבור צינור כניסת השמן. הזז את המכשיר והצמד צינורות למיקרוסקופ stage באמצעות יישור אובייקטיבי פי 20 והתמקד בזרבובית המכשיר. כוונן ידנית את המיקרוסקופ לתאורת קוהלר כדי לספק תאורה אופטימלית במישור המוקד.

באמצעות חיתוך תוכנת המצלמה המהירה, שדה הראייה סביב הזרבובית כדי לאפשר קצבי פריימים גבוהים יותר ולאחר מכן הגדר את קצב הפריימים, זמן החשיפה והגדרות מצלמה אחרות כנדרש להקלטה אופטימלית. לאחר מכן, מלאו מזרק מיליליטר אחד בתמיסת השלב המימי המעורבבת היטב שהוכנה בעבר. מלאו מזרק של שלושה מיליליטר בתמיסת שלב השמן.

הטה את אחד המזרקים המלאים אנכית והחלק כדי להעביר בועות אוויר לשקע המזרק. לחץ לאט על הבוכנה מספיק זמן כדי לדחוף את האוויר לקצה המזרק המחזיק את המזרק אנכית. חבר את המזרק למחט המזרק המתאימה שכבר מחוברת למכשיר.

לחץ על הבוכנה כדי לאלץ את האוויר דרך הנפח המת של מחט המזרק עד שהנוזל נדחף דרך הצינור כמעט למכשיר, הרכיב היטב את המזרק למשאבת מזרק וחבר את בלוק הבוכנה. חזור על חיבורים למזרק השני והרכיב אותו לכוח משאבת מזרק שני בכל משאבת מזרק ותכנת כל משאבה. באמצעות פרוטוקולי היצרן, הגדר את קצבי הזרימה הראשוניים ל-50 מיקרוליטר לדקה עבור שלב השמן וחמישה מיקרוליטר לדקה.

לתחילת השלב הימי, המשאבות ממתינות לכל נוזל שייכנס למכשיר וממלאות את התעלות ודוחפות החוצה את האוויר המת שנותר. זה עשוי להימשך מספר דקות באמצעות קצבי הזרימה הראשוניים. שימו לב להיווצרות טיפות בזרבובית.

הגדל לאט את קצב הזרימה המימי כדי לצפות בסדר החלקיקים בתעלת התמיסה המימית הארוכה. מכיוון שקצב הזרימה עולה אינו מגדיל את קצב הזרימה עד לנקודה שבה מופעלת סילון של זרם הנוזל המימי בזרבובית כפי שמוצג בדוגמה זו, באמצעות פתק זרבובית שונה ליצירת טיפות, הזרימה הלא יציבה והירידה הלא עקבית נמצאת כאן. אם ריכוז החלקיקים נמוך מכדי לספק לרכבות לסירוגין מעט חלקיקים חסרים יחסית והדגימה לא הייתה תואמת לציפה, הטה פיזית את משאבת המזרק לכיוון יציאת המזרק כדי לספק שקיעה הדרגתית של חלקיקים לכיוון שקעי המזרק.

לאחר שמתרחשת הזמנה נאותה, התאם את קצב זרימת השמן כדי לכוונן את תדירות הייצור וגודל הטיפות. התאם באופן איטרטיבי את שני קצבי הזרימה כדי להשיג קצבי עטיפה רצויים ונפחי ירידה. לאחר אישור עטיפה מסודרת יציבה, העבר את צינור היציאה ממאגר הפסולת למאגר איסוף לשימוש עתידי.

ניתן להשיג אנקפסולציה של חלקיקים בודדים וכפולים או תאים ביעילות גבוהה. השימוש בפרוטוקול זה המוצג כאן הוא תוצאה מייצגת של אנקפסולציה של חלקיק בודד עם קצב זרימת שמן של 60 מיקרוליטר לדקה וקצב זרימה מימי של תשעה מיקרוליטר לדקה. למבדה, המספר הממוצע של חלקיקים לטיפה הוא 0.95.

מרווח החלקיקים בכיוון הזרימה הוא כ-17 עד 18 מיקרון עבור חלקיקים מתחלפים בסדר מלא. קצב יצירת הירידה בדוגמה זו הוא 6.1 קילו-הרץ עם גודל טיפה ממוצע של 24.4 פיקוליטר. ההיסטוגרמה משווה את יעילות החלקיקים של אנקפסולציית הטיפה בסדר של אנקפסולציה של חלקיק בודד עם פלוס.

בסטטיסטיקה, האנקפסולציה האקראית עבור גודל מדגם של 517 טיפות, השבר הממוצע של טיפות המכילות חלקיק אחד הוא 79.5% בניגוד לשבר אנקפסולציה אקראי חזוי של 36.7%חלק החלקיקים שמגיעים לטיפות העטופות כהלכה נצפה כ-83.7%עבור גודל מדגם של 491 חלקיקים, בעוד שחלק האנקפסולציה האקראית היה 37.3%, אנקפסולציה כפולה של חלקיקים מושגת פשוט על ידי הפחתת קצב זרימת השמן ל-30 מיקרוליטר לדקה תוך שמירה על קצב הזרימה המימית של תשעה מיקרוליטר לדקה. כאן למבדה, מספר החלקיקים הממוצע לטיפה הוא 1.8. בדומה לאנקפסולציה של חלקיק בודד.

מרווח החלקיקים בכיוון הזרימה הוא כ-17 עד 18 מיקרון עבור חלקיקים מתחלפים בסדר מלא. לטיפות הגדולות יותר יש גודל טיפה ממוצע של 39.8 פיקוליטר והן נוצרו בקצב של 3.8 קילו-הרץ בהשוואה לאנקפסולציה אקראית. עבור גודל מדגם של 383 טיפות, השבר הממוצע של טיפות אנקפסולציה מסודרות המכילות שני חלקיקים הוא 71.5% בניגוד לשבר אנקפסולציה אקראי חזוי של 26.8%חלק החלקיקים שנוטה לטיפות העטופות כהלכה נצפה כ-79.5% עבור גודל מדגם של 689 חלקיקים, בעוד שחלק האנקפסולציה האקראית היה 33.4%נלקח.

יחד, תוצאות אלה מראות כי יעילות אנקפסולציה של חלקיקים בודדים וכפולים עולה על יעילות אנקפסולציה אקראית ביותר מפי שניים ומפחיתים מאוד את מספר הטיפות, שאינן מכילות את המספר הרצוי של תאים או חלקיקים. החשיבות של ריכוזי חלקיקים או תאים נאותים ליעילות אנקפסולציה גבוהה מודגמת בריצת ניסוי זו. בעוד שקצב הזרימה של השמן והמים זהה לזה של ריצת אנקפסולציה של חלקיקים כפולים שהוצגה קודם לכן, מספר התאים הממוצע לטיפה למבדה יורד ל-1.57.

כתוצאה מכך, לא מתרחש סדר מלא, וכך נוצרים חורים ברכבות שמשאירים טיפות שמש עם פחות חלקיקים מהצפוי. היסטוגרמה זו מציגה את הירידה ביעילות עבור אנקפסולציה של שני חלקיקים עקב הערך הנמוך יותר של למבדה. עבור גודל מדגם של 324 טיפות, החלק הממוצע של טיפות המכילות שני חלקיקים היה 55.9% עם כמעט אותו מספר טיפות של חלקיק בודד כמו טיפות של חלקיקים כפולים.

זה מצביע על כך שלמבדה צריכה להיות שווה או קרובה למספר התאים הרצוי לטיפה כדי למקסם חלקיקים או תאים עטופים כהלכה עם הערך המדויק של למבדה שנבחרה, בהתאם לנסבלות פחות או יותר תאים לטיפה. בהדגמה זו, אנו מנצלים אי התאמות ציפה כדי לאפשר שליטה בזמן אמת על הריכוז במהלך הניסוי. עם זאת, עבור ניסויים ארוכי טווח, ייתכן שיהיה מומלץ להתאים את הציפה לתוצאות עקביות יותר לאחר עטיפת התאים לטיפות מימיות.

ניתן לבצע ניסויים תלויי זמן בצינור צנטריפוגה או תחת מיקרוסקופ על ידי הזרקה חוזרת של הטיפות למערכים מיקרופלואידיים.