טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

אנו מתמקדים בפיתוח שיטות בידוד וניתוח CTC ביצועים גבוהים לקידום אונקולוגיה מדויקת באמצעות ביופסיה נוזלית. פלטפורמות הבידוד המסחריות הנוכחיות של CTC הן בעלות תפוקה ויעילות נמוכים. הם גם אינם תואמים לפלטפורמות ניתוח במורד הזרם, מה שמגביל את שחזור המידע הביולוגי.

מחקר זה עושה שימוש בפלטפורמת בידוד מיקרופלואידי CTC כדי לשפר משמעותית את קצב הגילויים. אנו גם משתמשים בשבב ריצוף תא בודד נדיר לניתוח ביופסיה נוזלית עמוק יותר. כדי להתחיל, פיפטה של 25 מיקרוליטר של חרוזי מגנטיים שוטפו ומושלים על ידי סטרפטאווידין לצינור המכיל מיקרוגרם אחד של נוגדן EpCAM, ביוטינילט.

דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר תוך סיבוב ב-20 סיבובים לדקה במשך 40 דקות להכנת חרוזי המגנטיות האימונוניים. באמצעות מתקן מגנטי, הפריד את החרוזים מהסופרנטנט. לאחר הסרת הסופרנטנט, החזירו את החרוזים ל-25 מיקרוליטר של בופר בידוד.

פיפט של 20 מיקרוליטר של מתלה חרוז מגנטי בתוך שנייה עד שתיים, כדי להבטיח שלא יוכנסו בועות אוויר. מניחים מיד את השבב אנכית על מגנט ותנו לחרוזים לשקוע חמש דקות ללא הפרעה. אספו ארבעה מיליליטר מדגימת דם לתוך מזרק, כדי לוודא שהבועות באוויר מוסרות.

אטום את הכניסה והיציאה של השבב בנוזל כדי להסיר בועות אוויר, ואז הכנס את צינורות הכניסה והיציאה של הדגימה לשבב. באמצעות משאבת מזרק, הזרקו את הדגימה בקצב זרימה של 1.5 מיליליטר לשעה. לאחר טעינת הדגימה, הזרקו 60 מיקרוליטר DPBS לשבב ה-HB בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לשעה כדי לשטוף תאים לא קשורים.

הסר את המגנט והזריק ידנית 1.5 מיליליטר של 5% BSA כדי לשטוף את השבב ולשחרר תאי גידול שנלכדו. הכינו תמיסה של 10% MPTS באתנול. הכנס מיד 20 מיקרוליטר של התמיסה לשבב ה-HB ודגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה.

שטוף את שבב ה-HB פעם אחת באתנול חסר מים, ואז מייבש אותו ב-100 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הכינו תמיסת GMBS באתנול בריכוז של 0.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר קירור השבב ל-37 מעלות צלזיוס, הכנס את תמיסת GMBS ודגם.

שטוף את שבב ה-HB פעמיים עם מים מזוקקים כפול, ואחר כך שתי שטיפות עם DPBS. מיד הוסיפו 15 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטווידין לשבב ה-HB ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה או לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטוף את שבב ה-HB פעמיים עם סליין DPBS.

כעת הכינו את מאגר נוגדן CD45 על ידי הוספת 0.2% BSA ו-20 מיקרוגרם למיליליטר נוגדן CD45 ביוטינילט ל-DPBS והתאימו לנפח הסופי. הזרקו 20 מיקרוליטר של בופר נוגדנים CD45 לשבב HB לבחירה שלילית של תאי דם לבנים. לאחר אינקובציה של שעה בטמפרטורת החדר, שטוף את השבב ב-DPBS.

הוסף פתרון חסימה המכיל 3% BSA ו-0.05% Tween 20 לשבב ה-HB. שאפו את הדגימה המוכנה למזרק, כדי לוודא שאין בועות אוויר. לאחר מכן אוטם את הכניסה והיציאה של השבב עם נוזל וחבר את צינורות הכניסה והיציאה לשבב.

באמצעות משאבת מזרק, הזרקו את הדגימה בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר לשעה. לאסוף תאי גידול מטוהרים מיציאת השבב לצורך ספירה וריצוף תאים בודדים. פיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסה 0.5% F-68 מוכנה ב-DPBS לתוך פתח השבב.

בצע סוניקציה באמבט מים תוך כדי החזקת השבב. כאשר בועות נראות ברחבי האזור המיקרו-נקבובי, המשך סוניקציה למשך 30 שניות כדי להסיר בועות מהבארות הכפולות. לאחר מכן, הזריק 200 מיקרוליטר של תליית תאי גידול לשבב המכיל 60,000 בארות כפולות.

העבירו בעדינות את מתלי התא בשבב למעלה ולמטה פעמיים. לאחר מכן מניחים שוב שייקר מסיר צבע למשך חמש דקות כדי להחזיר תאים שלא נתפסו ולאפשר להם לשקוע שוב. עכשיו תוסיף 200 מיקרוליטר DPBS ו-0.5% תמיסת F-68 דרך כניסה ושאיפה מהיציאה.

לאחר החזרת מתלה החרוזים עם הברקוד, הזרקו מיד 200 מיקרוליטר של מתלים לכניסת השבב ונערו במהירות של 10 סיבובים לדקה למשך 20 שניות. בעדינות תליית חרוזים עם פיפט פעמיים לפני שמניחים אותו חזרה על המנעל. כעת להסיר את תמיסת החרוזים הברקודית מהיציאה, ואז לפיפטה 200 מיקרוליטר של 20X Tris-EDTA ותמיסת דיתיותרייטול 50 מילימולר.

למשוך נוזל מהשקע. ללכידת תאי ולכידת MRN, הוסיפו בהדרגה 200 מיקרוליטר של בופר ליזיס תא לכניסת השבב. הוסף מיד 200 מיקרוליטר שמן מינרלי כדי לאטום את שני הבארות.

הסר את התמיסה שזורמת מיציאת השבבים למאגר הפסולת. לאחר מכן מניחים את השבב אופקי ותשאירו את החדר בטמפרטורת החדר חמש דקות. הוסיפו לאט 200 מיקרוליטר של תמיסת נתרן ציטראט מלוחות 6X לתוך הכניסה למים.

הסר את הנוזל הפסולת ושאף את התמיסה שנותרה מיציאת השבבים. הוסף לאט 200 מיקרוליטר של 6X מלח נתרן ציטראט כדי למלא את השבב. החזק מגנט קרוב לפני השטח של השבב והזיז אותו לאט מהכניסה ליציאה כדי לאסוף חרוזים עם ברקוד.

שאפו במהירות תמיסה וחרוזים לצינור צנטריפוגה המכיל 6X נתרן ציטראט מלח. שטפו את החרוזים עם ברקוד שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של 6X מלח נתרן ציטראט, ואחר כך פעם אחת עם בופר שעתוק הפוך. התפלגות אחידה של חרוזים אימונומגנטיים נצפתה תחת שדה מגנטי, בעוד שהחרוזים המינימליים שנותרו לאחר הסרה מגנטית אישרו שחרור מוצלח.

שבב הבידוד של ה-CTC לכד ביעילות תאי גידול מדגימות של 1 מיליליטר ו-10 מיליליטרים. הוספת שבב הטיהור העלתה עוד יותר את טוהר תאי הגידול. בדגימות דם היקפיות עם תאי LNCaP מינימליים, מערכת המיון של CTC שמרה על יעילות קליטה גבוהה וטוהר גבוהים.

שבב הברקודינג התא היחיד השיג יחס תפוסה של חרוזים מקודד של 85.6% ו-95.7% ברקוד, מה שהוביל לשיעור זיווג של 81.9%. הגדלת מספר התאים הטעונים שיפרה את יחס התפוסה של באר המיקרו מבלי להפחית את יעילות התפיסה. תהליך הבידוד המשולב של CTC ותהליך ריצוף תאים בודדים יצר תאי גידול טהורים מאוד ושמרו במדויק על יחסי תאי הגידול המקוריים. ניתוח TSNE הפריד בבירור בין תאי PC3, LNCaP ו-Jurkat לשלושה אשכולות, שכל אחד מהם מאופיין בביטוי סמן ייחודי.

אשכול תאי הג'ורקט זוהה על ידי ביטוי חזק של TRBC1, IGLL1, CD1E ו-CD3D, שאושר על ידי העשרת מסלול להפעלת תאי T. אשכולות PC3 ו-LNCaP הובחנו על ידי גנים המובעים באופן שונה, כאשר PC3 הראה ביטוי גבוה של מיקרוסמינופרוטאין ו-LNCaP שהביע NEDD4.