סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש "בטיחות תפוס" מתודולוגיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לסנתז פפטיד BSP פונקציונלי באמצעות טכניקות פאזה מוצקה. זה מושג על ידי העמסת חומצת אמינו BIS מוגנת על שרף חומצה הידרוקסיאתיל בנזואית. לאחר מכן חוזרים על עצמם מחזורי צימוד הגנה עמוקה כדי לחבר חומצות אמינו BIS פונקציונליות, תהליך המאריך את פפטיד ה-BIS ומציג את הפונקציונליות הרצויה.

לבסוף, חומצת האמינו הראשונה של BIS משתנה עם חומצת אמינו אלפא על מנת לבקע את פפטיד ה-BIS מהשרף על ידי היווצרות DI Keto pyrazine. מתקבלות תוצאות המראות סינתזה מוצלחת של פפטיד BSP פונקציונלי בטוהר גולמי טוב ותפוקות מבודדות עקביות של כ-10% בהתבסס על ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון סינתזה מקבילה וספרייה של פפטידי ביס מכיוון שפפטידי ה-BIS מורכבים על שרף מוצק, אשר ניתן למניפולציה בקלות רבה יותר מאשר תגובות בתמיסה ותוצרי לוואי מוסרים בקלות על ידי סינון.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שרבים מהשלבים קשים ללמידה מכיוון שישנם פרטים חשובים רבים הדרושים כדי להבטיח שכל התגובות מתקרבות להשלמה קרוב ככל האפשר. עם סינתזת פאזה מוצקה, אין דרך לטהר חומרי ביניים. אז כדי להשיג מוצר סופי נקי, כל תגובה חייבת להיות מונעת הכי רחוק שהיא יכולה.

אנו ממליצים ליצור רשימת תיוג של נהלים ניסיוניים כדי למנוע בלבול מכיוון שהשלבים חוזרים על עצמם באופיים. פרוטוקול זה מתחיל בהעמסת פפטיד ה-BSP הראשון, ההגנה על פפטיד ה-BSP הראשון ומכסת שרף בו זמנית. כדי להתחיל, טען את פפטיד ה-BSP הראשון על ידי שקילת 114 מיליגרם של שרף H-M-B-A-A לתוך כלי תגובה של שמונה מיליליטר והוסף מוט ערבוב מגנטי.

כסו את החלק העליון של הכלי עם מחיצת הגומי וטהרו את הצינור עם ארגון למשך חמש דקות לפחות. בינתיים, הכינו את תמיסת חומצת האמינו BIS המופעלת כמתואר בפרוטוקול הכתוב. בליווי סרטון זה, העבירו את התמיסה לכלי התגובה באמצעות מזרק וערבבו מתחת לארגון למשך הלילה למחרת, הסירו את המחיצה ונקזו את תערובת התגובה.

שוטפים את השרף על ידי הוספת כשני מיליליטר כלורו מתאן לשרף. מערבבים 30 שניות עד דקה ואז מסננים. חזור על תהליך זה ארבע פעמים עם DCM ולאחר מכן שטוף את השרף חמש פעמים עם דימתילפורממיד.

כדי לבצע הגנה עמוקה על חומצת האמינו הראשונה ומכסת שרף בו זמנית, הוסף לאט לאט שני מיליליטר של תמיסה של 33% מימן ברומיד בחומצה אצטית ו-DCM לכלי התגובה. מניחים לערבב במשך 15 דקות לאחר ניקוז ושטיפת השרף חמש פעמים ב-DCM. חזור על רצף ההגנה D פעם נוספת.

לאחר מכן, שטפו את השרף חמש פעמים ב-DCM ואחריו חמש פעמים ב-DMF, נטרלו את השרף על ידי שטיפה פעמיים עם תמיסת הנפח של 5% של D-I-P-E-A ב-DMF. לאחר מכן שטפו חמש פעמים עם DCM וחמש פעמים עם DMF פעם נוספת. כעת ניתן לבצע צימוד של חומצת האמינו הפונקציונלית המוגנת.

ראשית, הכניסו מחדש אטמוספירה אינרטית לכלי התגובה המכיל שרף על ידי שטיפה שלוש פעמים עם DCM נטול מים. לאחר מכן חבר טיהור קו מחיצה וארגון ושטוף את הכלי על ידי הוספת מיליליטר עד שניים של DCM נטול מים וערבוב במשך 30 שניות. לאחר מכן מסננים את הכלי עד שמבעבע קו הארגון מתחיל לעלות.

חזור על תהליך זה לפחות פעם נוספת. לאחר מכן, הכינו תמיסה של חומצת אמינו ביס פונקציונלית במבחנה מיובשת בלהבה מתחת לאטמוספירת ארגון. מוסיפים 47 מיקרוליטר DIC ומערבבים 90 דקות.

לאחר מכן הוסיפו לשרף 35 מיקרוליטר של D-I-P-E-A ב-666 מיקרוליטר והידרוס DMF וערבבו במשך חמש דקות נוספות. העבירו את תמיסת חומצת האמינו BIS המופעלת מראש לכלי באמצעות מזרק וערבבו למשך הלילה למחרת. מסננים את תערובת התגובה ושוטפים פעמיים עם DCM נטול מים מתחת לארגון.

שלב קריטי בהליך זה הוא צימודי חומצות האמינו ביז. כדי להבטיח סגירת טבעות של די קטו פיפרזינים, אנו משתמשים בזמני תגובה ארוכים יותר עם חומרים מפעילים נוספים. כדי לקדם את סגירת ה- di keto pyrazine, הוסף תמיסת HOAT ו- DIC מערבבים מתחת לארגון למשך שעה.

לאחר מכן, הסר את המחיצה ונקז את תערובת התגובה. שטפו את השרף חמש פעמים עם DCM וחמש פעמים עם DMF. סעיף זה מכסה את ההגנה העמוקה של חומצת האמינו BIS הפונקציונלית, ההגנה העמוקה של F moc והאצילציה של חומצת האמינו BIS הראשונה.

כדי לבצע הגנה עמוקה על חומצת האמינו הפונקציונלית המוגנת, הוסף לאט שני מיליליטר של תמיסה של TFA ו-TIPS לכלי התגובה וערבב במשך שעה לאחר הניקוז, שטוף את השרף עם DCM למשך כ-30 שניות ולאחר מכן נקז את שטיפת DCM חוזרת חמש פעמים. לאחר מכן חזור על כל רצף שטיפת השרף להגנה עמוקה לאחר שטיפת A-D-C-M-D-M-F. נטרל את השרף על ידי שטיפה פעמיים עם תמיסת נפח של 5% נפח של D-I-P-E-A ב-DMF.

לאחר מכן בצע שטיפת D-C-M-D-M-F נוספת. מכאן, ניתן להאריך את פפטיד ה-BIS עם חומצות אמינו BIS פונקציונליות אחרות או לתפקד על חומצה קרבוקסילית חנקנית מובילה או שניהם. כדי להגן על קבוצת ה- FM, הוסף תמיסה של שני מיליליטר של 20% צינור פארידין ב- DMF וערבב את התגובה למשך 20 דקות.

מסננים ושוטפים את השרף חמש פעמים ב-DMF. חזור על תהליך זה פעם נוספת לאחר שטיפה נוספת של השרף. A בודד את חומצת האמינו הראשונה על ידי הוספת תמיסת חומצת האמינו המוכנה לכלי התגובה וערבב במשך שש שעות כשלב אחרון.

שטפו את השרף חמש פעמים עם DCM וחמש פעמים עם DMF. החלק האחרון של פרוטוקול זה כולל הסרה של קבוצת באך מחומצת האמינו הקשורה לשרף ומחשוף מהשרף. ראשית, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת T-F-A-D-C-M אחד לאחד לכלי התגובה וערבבו במשך 30 דקות.

מסננים ושוטפים את השרף חמש פעמים ב-DCM. ואז חזור על תהליך זה פעם נוספת. שוטפים ומסננים את השרף למשך 30 שניות, חמש פעמים עם DCM וחמש פעמים עם DMF.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסה של 10% D-I-P-E-A ב-DMF נטול מים וערבבו במשך 24 עד 48 שעות. לבסוף, אוספים את תערובת התגובה לבקבוק תחתון עגול שנשקל מראש. העבר 30 מיקרוליטר של תמיסה זו ל-450 מיקרוליטר של Tetra Hydro FU בקובץ lc MS והגש אותו לניתוח.

שוטפים את השרף עם כמויות נוספות של DMF ואוספים לבקבוק התחתון העגול. ניתן להשתמש בשיטות הבאות כדי לנטר טרנספורמציות כימיות של שרף לאורך הסינתזה. כדי לזהות קבוצות הידרוקסיל חופשיות, בצע את בדיקת המתיל אדום על ידי הסרת כמיליגרם אחד של שרף יבש באמצעות פיפטה חד פעמית.

שוטפים לכלי תגובה של ארבעה מיליליטר. מוסיפים תמיסת מתיל אדומה שהוכנה כמתואר בטקסט ומערבבים במשך חמש עד 10 דקות. מסננים ושוטפים את השרף חמש פעמים עם חרוזי שרף כתומים או אדומים DCM מצביעים על נוכחות של קבוצות הידרוקסיל חופשיות.

ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להעריך את הטעינה של שלבי מכסת חומצת האמינו והשרף הראשונים. כדי לזהות אמצעים משניים, בצע את בדיקת הכלורל על ידי העברת כמיליגרם אחד של שרף יבש לבקבוקון קטן באמצעות פיפטה חד פעמית. הוסף שלוש טיפות של כלורל 0.8 מילי-מולרי בתמיסת DMF ו-2% אלדהיד חומצה בתמיסת DMF.

ובואו נשב בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות. במקרה זה, חרוזי שרף כחולים או סגולים הם אינדיקציה לכך שקיימים אמצעים משניים חופשיים על התרכובת הקשורה לשרף. כדי לאשר את יעילות ההפעלה, בצע את בדיקת מלכודת ההפעלה, ניתן להעריך את התרכובת המופעלת במהלך הסינתזה על ידי העברת חמישה עד 10 מיקרוליטר מהתמיסה המופעלת לבקבוקון ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית המכילה 50 מיקרוליטר אולאין מעורבב ביד.

למשך מספר שניות, התמיסה צריכה להיות צהובה, ואז לדלל עם 450 מיקרוליטר של טטרה הידרו אוראן ולהגיש לניתוח lc MS. ניתן להעריך את המוצר הסופי ואת חומרי הביניים המופעלים באמצעות מערכת LCM S המצוידת בעמודת פאזה הפוכה C 18 ומערכת ממס של אצטיל ניטריל מים עם 0.1% חומצה פורמית. עקבות L-C-M-S-U-V אלה מספקות דוגמה לטוהר הטוב של המוצר הגולמי.

השיא העיקרי בספקטרום שנמצא ב-21.3 דקות נמצא עם מסכה התואמת את מסת המוצר הצפויה. ניתן לדמיין זאת בספקטרום המסה של המוצר הגולמי, שיא החושף פסגות עיקריות המתאימות למסה, בתוספת המסה של יון הנתרן, כמו גם המסה פחות המסה של קבוצת ההגנה IV DDE. מוצג כאן עקבות ה-LCMS UV של הספקטרום המטוהר החושף תוצר טהור מאוד ב-21.3 דקות וספקטרום המסה המאשר את זהותו של שיא הטרייר המטוהר הזה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקות פנים מוצקות כדי לסנתז פפטידים מתפקדים לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום פפטידי ביז לחקור יישומים באינטראקציות חלבון-חלבון וקטליזה לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להוביל לסינתזה של טרימר פפטיד ביז פונקציונלי תוך ארבעה עד חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לשמור על החרוזים שקועים בתמיסות התגובה והכביסה בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו סינתזה מקבילה או ספרייה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו השפעת סטריאוכימיה או פונקציות חלופיות על קשירת חלבון או פעילות קטליטית. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים אורגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד בטיחות אישי מתאים ומכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.