פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח ספרייה פפטידומימטית ממוקדת של עמוד השדרה עם מגוון קונפורמציה באמצעות הקרנת מיקרוגל לטיפולים אנטי-פרזיטיים חדשים. שיטה זו יכולה לסייע בפיתוח כלים חדשים להתמקדות ספציפית באינטראקציות חלבון-חלבון. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף למחסנית פוליפרופילן 2.5 מיליליטר מחומצת האמינו הרצויה, מיליליטר אחד של מפעיל ו -0.5 מיליליטר בסיס מפעיל

הנח את המחסנית בסינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי ואפשר לתגובת הצימוד להמשיך למשך 300 שניות ב-25 וואט ו-75 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת התגובה, שטפו את השרף עם שבעה מיליליטר של N, N-dimethylformamide או DMF, למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר חזרה על השלב הקודם חמש פעמים, הוסף למחסנית הפוליפרופילן שבעה מיליליטר של 20% פיפרידין ב-DMF עם 0.1 מולארי 1-הידרוקסיבנזוטריאזול, או HOBt, ודגירה למשך 30 שניות ב-45 וואט ו-75 מעלות צלזיוס.

בסיום, מסננים את תערובת התגובה. לאחר מכן, הוסף למחסנית הפוליפרופילן שבעה מיליליטר של 20% פיפרידין ב-DMF עם 0.1 HOBt מולארי ודגירה למשך 180 שניות ב-45 וואט ו-75 מעלות צלזיוס. לאחר ניקוז תערובת התגובה, יש לשטוף את השרף בשבעה מיליליטר DMF למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את השרף עם שבעה מיליליטר דיכלורומתאן, או DCM, למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. לצימוד אנהידריד, שטפו את השרף עם שבעה מיליליטר של 1-מתיל-2-פירולידינון, או NMP, למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. בסיום, מסננים את תערובת התגובה.

לאחר חזרה על השלב הקודם שלוש פעמים, ממיסים 10 מקבילות של האנהידריד המתאים בחמישה מיליליטר NMP בצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף מקבילה אחת של 4-Dimethylaminopyridine, או DMAP, ו-10 מקבילות של N, N-diisopropylethylamine, או DIEA, לתמיסה. מוסיפים את התערובת הזו לשרף, ודוגרים במשך 300 שניות בחום של 25 וואט ו-75 מעלות צלזיוס.

לאחר שטיפת השרף עם NMP, שטפו אותו עם שבעה מיליליטר DMF למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, העבירו את השרף למחסנית פוליפרופילן המצוידת בתקע מכסה ותא עצירה. לאחר שטיפת השרף עם DCM, הוסף 15 עד 25 מיליליטר של תערובת של 1% חומצה טריפלואורואצטית, 5% טריאיזופרופילסילן ו-94% DCM למחסנית הפוליפרופילן לכל 1 גרם שרף.

הניחו את מחסנית הפוליפרופילן על שייקר, ונערו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לנקז את התמיסה ממחסנית הפוליפרופילן על ידי הפעלת ואקום. לאחר חזרה על השלבים הקודמים שלוש פעמים, יש לשטוף את השרף בשבעה מיליליטר DCM למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר.

שלבים אלה חשובים ביותר, מכיוון שקבוצות ההגנה על טריטיל במספר שרפים נמצאו מפוצלות חלקית בתמיסות חומצה DCM-trifluoroacetic. הסרת קבוצות מתילטריטיל היא תהליך איטי שדורש כביסות מרובות. בצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר, ממיסים חמישה מקבילים של Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate בחמישה מיליליטר של דיברומתאן.

לאחר מכן, הוסף 10 מקבילות של DIEA לפתרון. מוסיפים את התערובת לשרף שטוף DCM ומדגרים למשך 300 שניות ב-25 וואט ו-75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השרף עם שבעה מיליליטר DCM למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר שתי שטיפות עם DCM, העבירו את השרף למחסנית פוליפרופילן ושטפו פעמיים עם אתר דיאתיל. יבש את השרף במייבש ואקום בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות מעל אשלגן הידרוקסיד. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של קוקטייל מחשוף חומצה טריפלואורואצטית מקורר מראש לכל גרם שרף.

הניחו את מחסנית הפוליפרופילן על שייקר, ונערו במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, אסוף את תמיסת המחשוף על ידי סינון השרף לצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר. הוסף 35 מיליליטר אתר דיאתיל קר לצינור.

צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -1, 207 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו את שכבת האתר. למבחן קייזר, הכינו את תמיסה A על ידי המסת 16.5 מיליגרם אשלגן ציאניד ב -25 מיליליטר מים מזוקקים.

מדללים מיליליטר אחד מהתמיסה עם 49 מיליליטר פרידין. לאחר מכן, הכינו את תמיסה B על ידי המסת גרם אחד של נינהידרין ב-20 מיליליטר אתנול. הכן את תמיסה C על ידי המסת 40 גרם פנול ב -20 מיליליטר אתנול.

לאחר הכנת התמיסות, העבירו כמה חרוזים מהשרף למבחנה. מוסיפים שלוש טיפות מכל תמיסה לשפופרת, ומערבבים. לבסוף, מחממים את המבחנה על בלוק חימום בחום של 110 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

סינתזה של הפפטידים המחזוריים של עמוד השדרה בוצעה באמצעות סינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי על תמיכה מוצקה בעקבות פרוטוקול FMOC, t-butyl. המוצר נותח על ידי ספקטרומטריית מסה, ומידת הטוהר שלו נקבעה באמצעות HPLC. סריקה ביולוגית הראתה כי פפטיד pL1 היה פעיל נגד לישמניה, טפיל הגורם ללישמניאזיס קרביים, הלישמניאזיס החמור ביותר בבני אדם.

פפטיד pL1 הפחית את כדאיות הטפילים ב-75% בהשוואה לטיפול הביקורת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה עד חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים במגוון רחב של תחומים לחקור פפטידים כמווסתים פרמקולוגיים במחקר בסיסי וטיפולים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח ספרייה ממוקדת של פפטידומימטיקה עם מגוון קונפורמציה כדי להתמקד באופן ספציפי באינטראקציות חלבון-חלבון. אל תשכח שעבודה עם חומצה טריפלואורואצטית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת מגן עיניים, חלוק מעבדה וכפפות בזמן עבודה במכסה מנוע מאוורר היטב בעת ביצוע הליך זה.