Name: פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד לסנתז פפטידים מחזוריים באמצעות קרינת מיקרוגל לפיתוח תרופות נגד טפילים. שיטה זו מאפשרת יצירת ספריית פפטידים מגוונת לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ופיתוח טיפולים ממוקדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לורן ואן Wassenhove, Sunhee הוואנג, ודריה מושלי-רוזן לדיונים מועילים. העבודה נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות NIH מענק RC4 TW008781-01 C-רעיון (ניצוץ) לNQ היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

יש המחברים אין לחשוף.

הסינתזה של ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה נגזרים מחלבון חוסר הטפיל שושנת יריחו באמצעות סינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי לחלוטין מתוארת. ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים פותחה עם pharmacophores שימור וlinkers השונים. תוספת של linkers השונים כגון אנהידריד glutaric, אנהידריד succinic, חומצת adipic, חומצת pimelic, ליזין, ornithine, ואובניים בניין אחר יכולה לשמש כדי להגדיל את מגוון חלל קונפורמציה של פפטידים מחזוריים. הסינתזה של ספריית פפטידים מחזוריים ממוקדת מאפשרת לח...

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) לשחק תפקיד מרכזי ברוב התהליכים ביולוגיים, מהעברת אותות תאיות לתא המוות 1. לפיכך, מיקוד PPIs הוא בעל חשיבות עליונה למחקר בסיסי ויישומים טיפוליים. יכול להיות מוסדר על ידי PPIs נוגדנים ספציפיים ויציבים, אבל נוגדנים הם יקרים וקשים לייצר ויש זמינות ביולוגית ירודה. לחלופין, יכול להיות ממוקד PPIs על ידי מולקולות קטנות. מולקולות קטנות קלות יותר לסנתז וזולים בהשוואה לנוגדנים; עם זאת, הם יחסית פחות גמישים ולהתאים טובים יותר לחללים קטנים יותר לממשקי חלבון-חלבון גדול 2,3. מחקרים שונים הראו כי פפטידים, שהם פשוט יותר וזולים יותר מאשר נוגדנים וגמישים יותר ממולקולות קטנות, יכולים להיקשר ממשקי חלבון ולהסדיר PPIs 4,5. שוק פפטיד הטיפולי העולמי מוערך כרבע מליארד דולרים בשינה 2013, והוא גדל annua 10.5%lly 6. יתר על כן, יש יותר מ -50 פפטידים משווקים, סביב 270 פפטידים בשלבים שונים של ניסויים קליניים, ופפטידים כ -400 בשלבים פרה-קליניים מתקדמים 7. למרות פפטידים רבים נמצאים בשימוש כתרופות, פפטידים עדיין מהווים מספר אתגרים המגבילים את היישום הנרחב שלהם, כולל זמינות ביולוגית ירודה ויציבות, חוסר יעילות בקרום תא מעבר, וגמישות קונפורמציה 8,9. חלופה אחת להתגבר על החסרונות אלה היא להחיל שינויים שונים כגון (חומצת אמינו וD-N-אלקילציה) מקומיות והגלובלי (cyclization) אילוצים 8,10-12. שינויים אלה להתרחש גם באופן טבעי. לדוגמא, ציקלוספורין, פפטיד הטבעי מחזורי לדיכוי מערכת חיסון, מכיל חומצת אמינו בודדת D-ועובר שינויי N-אלקילציה 13,14. שינוי של חומצות אמינו טבעיות כדי לגרום לאילוצים מקומיים, כגון D- וN-אלקילציה, לעתים קרובות משפיע על פפטיד9; של פעילות ביולוגית. עם זאת, cyclization, שבו הרצף של עניין יכול להישאר אותו הדבר, יש יותר סיכוי לשמור על פעילות ביולוגית. Cyclization היא דרך אטרקטיבית מאוד להגביל את מרחב קונפורמציה פפטיד על ידי הפחתת שיווי המשקל בין תצורות שונות. בדרך כלל זה מגביר את הפעילות והסלקטיביות ביולוגיות על ידי הגבלת פפטיד לקונפורמציה הפעילה שמתווכת רק פונקציה אחת. Cyclization גם משפר את יציבות פפטיד על ידי שמירה על פפטיד בקונפורמציה שפחות מוכרת על ידי אנזימים משפילים. ואכן, פפטידים מחזוריים הוצגו השתפרו יציבות מטבולית, זמינות ביולוגית, וסלקטיביות בהשוואה לעמיתיהם ליניארי שלהם 15-17. עם זאת, cyclization יכולה להיות חרב פיפיות שכן במקרים מסוימים ההגבלה עלולה למנוע פפטידים מהשגת קונפורמציה ביו. כדי להתגבר על מכשול זה, ספרייה ממוקדת שבו יש את כל פפטידים אותו sequenc העיקרייכול להיות מסונתז pharmacophores דואר וכתוצאה מכך קבוע. פפטידים בספרייה שונים בפרמטרים המשפיעים על המבנה שלהם, כגון גודל טבעת ומיקום, על מנת להקרין לאחר מכן לקונפורמציה ביו ביותר 9,18. יכולים להיות מסונתזים פפטידים הן בפתרון ועל ידי גישת סינתזת פפטיד מוצק שלב (SPPS), שנמצא כעת גישת סינתזת פפטיד הנפוצה יותר ויידון נוסף. SPPS הוא תהליך שבו שינויים כימיים מבוצעים על תמיכה מוצקה באמצעות מקשר להכין מגוון רחב של תרכובות סינתטיות 19. SPPS מאפשר פפטידים הרכבה על ידי צימוד רצוף של חומצות אמינו באופן הדרגתי מC-הסופית, שמצורף לתמיכה מוצקה, לN-הסופית. הצד-השרשרות של חומצות N-α-אמינו חייבים להיות רעול פנים עם הגנה על קבוצות שהם יציבים בתנאי תגובת שימוש במהלך התארכות פפטיד כדי להבטיח את התוספת של חומצת אמינו אחת לרח &#39;EP. בשלב האחרון, פפטיד הוא שוחרר מהשרף והצד-שרשרת הגנה על קבוצות יוסרו במקביל. בעוד פפטיד הוא להיות מסונתז, ניתן להסיר את כל חומרים כימיים המסיסים ממטריצת תמיכת פפטיד המוצק על ידי סינון ונשטפו בסוף כל שלב צימוד. עם מערכת כזו, עודף גדול של חומרים כימיים בריכוז גבוה יכול לנהוג תגובות צימוד להשלמה וניתן לבצע את כל שלבי הסינתזה באותו הכלי ללא כל העברה של חומר 20. למרות שיש כמה מגבלות SPPS כגון הייצור של תגובות לא שלמות, תגובות לוואי, חומרים כימיים טמאים, כמו גם קשיי ניטור התגובה 21, את היתרונות של SPPS עשו את זה &quot;תקן הזהב&quot; לסינתזת פפטיד. יתרונות אלה כוללים את האפשרות לשלב חומצות אמינו שאינם טבעיות, אוטומציה, טיהור קלה, הפסדים פיזיים ממוזערים, ושימוש בחומרים כימיים עודפים, וכתוצאה מכךתשואות גבוהות. SPPS הוכח להיות שימושי מאוד בסינתזה של רצפים קשים 21,22, שינויי ניאון 23, וספריות פפטיד 24,25. SPPS הוא גם מאוד שימושי עבור מכלולים מרובה שרשרת אחרות כגון oligonucleotides 26,27, אוליגוסכרידים 28,29, וחומצות גרעין פפטיד 30,31. מעניין לציין, שבמקרים מסוימים, SPPS הוצג להיות יתרון עבור סינתזת מולקולות קטנות שנעשות באופן מסורתי בפתרון 32,33. SPPS משמש הוא בקנה מידה קטנה למחקר והוראה 34,35, כמו גם בקנה מידה גדולה בתעשייה 36-38. שתי אסטרטגיות סינתזה המשמשות בעיקר במתודולוגיה SPPS לסינתזה של פפטידים הן butyloxycarbonyl (בוק) ו9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC). האסטרטגיה המקורית הציגה לSPPS הייתה בוק, אשר דורש תנאי חומצה חזקים כדי להסיר צד שרשרת הגנה על קבוצות ולדבוק פפטיד מresin. סינתזת פפטיד מבוססת FMOC, לעומת זאת, מנצלת תנאי בסיס מתונים והיא אלטרנטיבה מתונה יותר לפרוטוקול בוק חומצה יציב 39. אסטרטגית FMOC מנצלת הגנת צד שרשרת המאונכות t-בוטיל (TBU) שהוסרה בשלב האחרון של הסינתזה תוך ביקוע פפטיד מהשרף בתנאי חומצה. העיקרון הכללי לסינתזת פפטיד על תמיכה מוצקה מוצג באיור 1. חומצת אמינו הראשונית, רעול פנים על ידי קבוצת הגנה זמנית על N-α-הסופית, נטענת על השרף מC-סופית. קבוצת הגנת חצי קבועה כדי להסוות את שרשרת הצד משמשת גם במידת צורך (איור 1, שלב 1). הסינתזה של פפטיד היעד מורכבת מC-הסופית לN-הסופית על ידי מחזורים חוזרים ונשנים של deprotection של קבוצת הגנת N-α-הזמנית (איור 1, שלב 2) וצימוד של חומצת אמינו המוגנת הבאה (איור 1 </str<html> אונג&gt;, שלב 3). לאחר חומצת אמינו האחרונה נטענת (איור 1, שלב 4), פפטיד הוא ביקע מתמיכת השרף וקבוצות הגנת חצי הקבועה מוסרים (איור 1, שלב 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig1.jpg" /> באיור 1. תכנית כללית של סינתזת פפטיד השלב מוצקה. חומצת אמינו המוגנת-N-α מעוגנת באמצעות קבוצת carboxyl באמצעות מקשר לשרף (שלב 1). הפפטיד הרצוי מורכב באופן ליניארי מC-הסופית לN-הסופית על ידי מחזורים חוזרים ונשנים של deprotection של הקבוצה הזמנית הגנה (TPG) מN-α (שלב 2) וצימוד חומצת אמינו (שלב 3). לאחר להשיג הסינתזה (שלב 4), קבוצות חצי קבועות הגנה (SPG) הם deprotected במהלך מחשוף פפטיד (שלב 5).תקבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. לאחר ההרכבה של שרשרת הפפטיד המלאה, cyclization יכול להיות מושגת על ידי מספר חלופות: (א) ראש אל זנב cyclization - זו דרך נוחה אבל מוגבל שכן הוא מספק רק אפשרות אחת לcyclization (איור 2 א), cyclization (ב) באמצעות חומצות אמינו מהרצף של עניין המכילות קבוצות פונקציונליות ביו - עם זאת, השימוש בחומצות אמינו אלה עשויים להשפיע על הפעילות הביולוגית (איור 2), וcyclization (C) על ידי הוספת חומצות אמינו (אבני בניין או אחר) מבלי להפריע הרצף ביו. היכרות עם מולקולות אלה היא נפוצה שכן היא מאפשרת ייצור של ספריות ממוקדות מבלי לשנות את הרצף של עניין (איור 2 ג). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig2.jpg" /> Figure 2. אסטרטגיות cyclization פפטיד האלטרנטיבי ראש () לcyclization זנב, דרך קשר פפטידי בין C-הסופית וN-הסופית.; cyclization (ב &#39;) בין קבוצות הפונקציונליות כגון אג&quot;ח דיסולפיד בין שאריות ציסטאין (1), או קשר בין אמיד הרשתות בצד של ליזין לאספרטית / חומצה גלוטמית (2), או רשת צד לn- או C-סופית (3 -4); cyclization (C) על ידי הוספת חומצות אמינו נוספות או נגזרי חומצת אמינו או מולקולות קטנות, לדוגמא לפני (R0) ואחרי (R7) הרצף ביו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53589/53589fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> סינתזה משתמשת קרינת מיקרוגל לחמם תגובות, ובכך מאיץ כימי אורגנית בסיוע מיקרוגל תמורות 40,41. כימיה מיקרוגל מבוססת על היכולת של המגיב / הממס לספוגמיקרוגל אנרגיה ולהמיר אותו לחום 42. לפני הטכנולוגיה הפכה נפוצה, חסרונות עיקריים היו הצורך להתגבר, כוללים יכולת השליטה והשחזור של פרוטוקולי סינתזה וחוסר מערכות זמינות עבור פקדי טמפרטורה ולחץ נאותים 43,44. הדו&quot;ח הראשון של סינתזת פפטיד בסיוע מיקרוגל נעשה שימוש במיקרוגל מטבח לסנתז כמה פפטידים קצרים (7-10 חומצות אמינו) עם שיפור משמעותי של יעילות הצימוד וטוהר 45. יתר על כן, אנרגיית מיקרוגל הוצגה כדי להקטין הצטברות שרשרת, להפחית תגובות צד, להגביל racemization, ולשפר את שיעורי צימוד, שהם קריטיים לכל רצפים קשים וארוכים 46-53. כיום השימוש בקרינת מיקרוגל לסינתזה של פפטידים או תרכובות הקשורות בתמיכה מוצקה הוא נרחבת, כולל סינתזה () במים במקום ממס אורגני 54; (ב) סינתזה של פפטידים עםשינויים נפוצים לאחר translational, כגון glycopeptides 55-58 או phosphopeptides 59-61, סינתזה שקשה בדרך כלל עקב יעילות הצימוד הנמוכה של נגזרי חומצת אמינו הפריעו sterically; (ג) סינתזה של פפטידים עם שינוי בעמוד השדרה, כגון azapeptides, אשר יכול להיווצר על ידי ההחלפה של C (α) של שאריות חומצת אמינו עם אטום חנקן 62, או peptoids, הצד שמחובר לשרשרת חנקן אמיד ולא אטום Cα 63,64; סינתזה של פפטידים מחזוריים 65-71 (ד); סינתזה ו( ה) של ספריות קומבינטורית 51,72. במקרים רבים, החוקרים דיווחו יעילות גבוהה יותר וצמצום זמן סינתזה באמצעות קרינת מיקרוגל בהשוואה לפרוטוקול המקובל. באמצעות עיצוב רציונאלי 73-75, שפיתחנו פפטידים אנטי-טפילים שנגזרו מהקולט של eishmania L הפיגום FOr מופעל C-קינאז (חוסר). חוסר ממלא תפקיד חשוב בשלב המוקדם של זיהום שושנת יריחו 76. טפילים להביע רמות נמוכות יותר של חוסר להיכשל טפילים אפילו עכברים שנפרץ חיסון 77 כמו חוסר מעורב בתהליכי טפיל איתות חיוניים וסינתזת חלבון 78. לכן, חוסר הוא חלבון מפתח פיגום 79 ויעד תרופה יקר. התמקדות ברצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אך לא במעמד homolog היונקים המארח, זיהינו פפטיד חומצת אמינו 8 (RNGQCQRK) שירד שושנת יריחו sp. כדאיות בתרבות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של פפטידים עמוד השדרה מחזורית הנגזרים מרצף חלבון חוסר שתואר לעיל. פפטידים היו מסונתזים על תמיכה מוצקה באמצעות חימום במיקרוגל על ​​ידי המתודולוגיה SPPS עם פרוטוקול FMOC / TBU. פפטידים היו מצומדת לפפטיד 47-57 מוביל (YGRKKRRQRRR) TAT באמצעות אג&quot;ח אמיד כחלק מSPPS. תחבורה של מגוון רחב של מטענים לתאים מבוססות TAT הייתה בשימוש כבר למעלה מ -15 שנים ומסירת המטען לאברונים subcellular אושרה 80. ארבעה linkers שונה, succinic ואנהידריד glutaric כמו גם adipic והחומצה pimelic, שימש לביצוע cyclization ליצור linkers חומצה קרבוקסילית של שניים עד חמישה פחמנים. Cyclization נעשה שימוש באנרגית מיקרוגל, והצעדים deprotection מחשוף וצד-שרשרת הסופיים נעשו באופן ידני ללא אנרגיית מיקרוגל. השימוש בסינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי שיפר את טוהר המוצר, הגדיל את תשואת המוצר, וצמצם את משך הזמן של הסינתזה. פרוטוקול כללי זה יכול להיות מיושם למחקרים אחרים שעושים שימוש בפפטידים להבין מנגנון מולקולרי חשוב במבחנת in vivo ולפתח תרופות פוטנציאליות למחלות בבני אדם.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיכה מוצקה, זירת החלקה אמיד AM שרף ML</td><td>CBL</td><td>BR-1330</td><td>טעינה: 0.49 מילימול/גרם</td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FA2100</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg (Pbf)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FR2136</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asn(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FN2152</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-ASP (OBut) -OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FD2192</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys (Trt) -OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FC2214</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln (Trt) -OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FQ2251</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu (OtBu) -OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FE2237</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FG2275</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FH2316</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FI2326</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Leu-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FL2350</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FK2390</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FM2400</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Phe-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FF2425</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FP2450</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser-(tBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FS2476</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FT2518</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FW2527</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(But)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FY2563</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FV2575</td><td></td></tr><tr><td>1-מתיל-2-פירולידינון (NMP)</td><td>סיגמא</td><td>328634</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל/דליק מאוד/מגרה.</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide (DMF)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43465</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל. 
השתמש ב-DMF באיכות גבוהה כדי למנוע תגובות לוואי כגון הסרת Fmoc כתוצאה מעקבות הדימתילאמין מפירוק DMF.</td></tr><tr><td>דיכלורומתאן (DCM)</td><td>סיגמא</td><td>D65100</td><td><חזק>זהירות</חזק></td></tr><tr><td>דיברומומתאן מזיק (DBM)</td><td>סיגמא</td><td>D41868</td><td><חזק>זהירות</חזק></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית מזיקה (TFA)</td><td>Sigma</td><td>T62200</td><td><חזק>זהירות</חזק></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית קורוזיבית/רעילה, בדרגת HPLC (TFA)</td><td>Sigma</td><td>91707</td><td><חזק>זהירות</חזק> דיאתיאתר קורוזיבי/רעיל</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>31690</td> <td><חזק>זהירות</חזק></td></tr><tr><td>טריאיזופרופילסילן (TIS)</td> <td>סיגמא</td> דליק/מזיק <td>מאוד 233781</td><td><חזק>זהירות</חזק> מים מגרים/דליקים</td></tr><tr>, <td>סיגמא</td><td>270733</td><td></td>אצטוניטרויל<td>בדרגת HPLC</td></tr>, <tr>פישר<td>בדרגת HPLC (ACN)</td><td> Scientific</td><td>A998-4</td><td><חזק>זהירות</חזק> דליק/מגרה/מזיק</td></tr><tr><td>N,N-דיסופרופילאתילאמין (DIEA)</td><td>Sigma</td><td>3440</td><td><חזק>זהירות</חזק> פיפרידין סיגמא קורוזיבי/דליק מאוד</td></tr><tr><td></td><td></td><td>W290807</td><td><חזק>זהירות</חזק> סיגמא פירידין רעיל/דליק מאוד</td></tr><tr><td></td><td></td><td>270970</td><td><חזק>אזהרה</חזק> אתנול דליק/מזיק</td></tr><tr><td>מאוד (EtOH)</td><td>סיגמא</td><td>459844</td><td><חזק>אזהרה</חזק> 1-הידרוקסיבנזוטריאזול</td></tr><tr><td>הידראט (HOBt)</td><td>סיגמא</td><td>157260</td><td><חזק>זהירות</חזק> דליק מאוד/מגרה/מזיק</td></tr><tr><td>O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N&prime;,N&prime; - tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Sigma</td><td>12804</td><td><חזק>זהירות</חזק> מגרה/מזיק</td></tr><tr><td>בנזוטריאזול-1-לי-אוקסי-טריס-פירולידינופוספוניום הקספלואורופוספט (PyBOP)</td><td>Advanced Chemtech</td><td>RC8602</td><td><חזק>זהירות</חזק></td></tr><tr><td>נינהידרין</td><td>סיגמא</td> מגרה <td>454044</td><td><חזק>זהירות</חזק> מזיק</td></tr><tr><td>פנול</td><td>סיגמא</td><td>P3653</td><td><חזק>אזהרה</חזק> אשלגן ציאניד קורוזיבי/רעיל</td></tr><tr><td>(KCN)</td><td>סיגמא</td><td>11813</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל מאוד</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>סיגמא</td><td>221473</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל</td></tr><tr><td>N,N' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)</td><td>Sigma</td><td>38370</td><td><חזק>אזהרה</חזק> דליק/רעיל</td></tr><tr><td>4-דימתיל-אמינופירידין (DMAP)</td><td>Sigma</td><td>522805</td><td><חזק>אזהרה</חזק> אנהידריד גלוטארי רעיל/מגרה</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G3806</td><td><חזק>אזהרה</חזק> סיגמא אנהידריד סוקסיני דליק/מגרה/מזיק</td></tr><tr><td></td><td></td><td>239690</td><td><חזק>אזהרה</חזק></td></tr> סיגמא מגרה / <tr><td>מזיק חומצה אדיפית</td><td></td><td>A26357</td> <td><חזק>אזהרה< חזק> חומצה פימלית רעילה/מגרה</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>P45001</td><td><חזק>זהירות< חזק> סיגמא כלורניל רעיל/מגרה</td></tr><tr><td></td><td></td><td>23290</td><td><חזק>אזהרה<> רעיל/מגרה</td></tr><tr><td>אצטאלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>402788</td><td><חזק>זהירות</חזק> דליק/רעיל</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אלגרה 6R צנטריפוגה</td><td></td></tr><tr><td>ליופילייזר</td><td>Labconco</td><td>freezone 4.5</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>פרנקלין אלקטריק</td><td>דגם 1101101416 עם 3/4 כ"ס</td><td>אלקטל משאבה עם פרנקלין מוטור&nbsp;</td></tr><tr><td>מחסנית פוליפרופילן 12 מ"ל</td><td>הפרדה מיושמת</td><td>2419</td><td></td></tr><tr><td>תקע מכסה למחסנית פוליפרופילן 12 מ"ל</td><td>הפרדה מיושמת</td><td>8157</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית פוליפרופילן 3 מ"ל</td><td>הפרדה מיושמת</td><td>2413</td><td></td></tr><tr><td>תקע מכסה למחסנית פוליפרופילן 3 מ"ל</td><td>הפרדה מיושמת</td><td>8054</td><td></td></tr><tr><td>עצור PTFE</td><td>הפרדה מיושמת</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>צינורות שטוחים, 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>21008-240</td><td></td></tr><tr><td>סעפת מיצוי, 20 חיבורים, צינורות 16 x 100 מ"מ</td><td>מים</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>שייקר, מערבל נואטור BD אדמס</td><td>פישר מדעי</td><td>22363152</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene HDPE בקבוקי IP2 עם פה צר, 125&nbsp; מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-312-8</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ארלנמאייר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB-501, 500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td>תרמולין</td><td>1760 אמבט</td><td></td>דרי</tr><tr><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים עם קצה רגיל</td><td>פישר סיינטיפיקט</td><td>14-961-25</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטות וטיפים Finnpipette</td><td>Thermo</td><td>20&ndash; 200 ו-100&ndash; 1,000 &mu; l</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני HPLC - מיקרו vl עמ' 400 ומיקרו; l PK100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>69400-124</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון HPLC- כחול Snap-It Cap</td><td>VWR</td><td>66030-600</td><td></td></tr><tr><td>אנליטי HPLC טור</td><td>Peeke Scientific</td><td>U1-5C18Q-JJ</td><td>ultro 120 5 &micro; m C18Q, קוטר פנימי 4.6 מ"מ 150 מ"מ</td></tr><tr><td>עמוד HPLC הכנה, XBridge&nbsp;</td><td>ווטרס</td><td>OBD C18 5 ומיקרו; עמודה m</td><td>19 מ"מ ופעמים; ספקטרומטר מסה 150 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>Voyager DE-RP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר</td><td></td><td></td><td></td>חנקן</tr><tr><td>מייבש</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת RP-HPLC אנליטית Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>מצוידת ב: בקר מערכת CBM-20A, גלאי SPD-20A, תנור עמודים CTO-20A, 2 x יחידת אספקת ממס LC-20AD, דגימה אוטומטית SIL-20AC, מסיר גז DGU-20A5 (Shimadzu, MD, ארה"ב).</td></tr><tr><td>מערכת RP-HPLC הכנה Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>מצוידת ב: בקר מערכת CBM-20A, גלאי SPD-20A, תנור עמודים CTO-20A, 2 x יחידת אספקת ממס LC-6AD ואספן שברים FRC-10A (Shimadzu, MD, ארה"ב).</td></tr></tbody></table>

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מעורבות באופן אינטימי כמעט בכל התהליכים הביולוגיים וצמודות למחלות רבות אנושיות. לכן, יש מאמץ גדול כדי למקד PPIs במחקר בסיסי ובתעשיית התרופות. ממשקי חלבונים הם בדרך כלל גדולים, שטוחים, ולעתים קרובות חוסר כיסים, מסבך את הגילוי של מולקולות קטנות המתמקדות באתרים כאלה. יש גישות אלטרנטיביות מיקוד באמצעות נוגדני מגבלות בשל זמינות ביולוגית ירודה אוראלית, תא-חדירות נמוכות, וחוסר יעילות ייצור. יש שימוש בפפטידים למקד ממשקי PPI מספר יתרונות. יש לי פפטידים גמישות קונפורמציה גבוהה יותר, הסלקטיביות מוגברת, והם בדרך כלל זולים. עם זאת, יש לי פפטידים מגבלות משלהם, כולל יציבות עניה וקרום תא חוסר יעילות חצייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניתן לבצע cyclization פפטיד. Cyclization הודגם לשפר סלקטיביות פפטיד, יציבות מטבולית, וזמינות ביולוגית. עם זאת, ניבוי קונפורמציה ביו של פפטיד מחזורי הוא לא טריוויאלי. כדי להתגבר על האתגר הזה, גישה אטרקטיבית אחד אותו למסך ספרייה ממוקדת למסך שבו יש את כל פפטידים מחזורי עמוד השדרה באותו רצף ראשוני, אך שונות בפרמטרים המשפיעים על קונפורמציה, כגון גודל טבעת ומיקום. אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של פפטידים ספרייה מחזוריים עמוד השדרה מיקוד PPIs טפיל הספציפי. שימוש בגישה עיצוב רציונלים, שפיתחנו פפטידים הנגזרים מקולט eishmania L חלבון הפיגום לC-קינאז מופעל (חוסר). חוקרים שערנו כי רצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אבל לא בhomolog מארח היונקים, עשויים לייצג אתרי אינטראקציה לחלבונים שהם קריטיים ליכולת הקיום של הטפילים. פפטידים מחזוריים היו מסונתזים באמצעות קרינת מיקרוגל כדי להפחית את זמני תגובה ולהגדיליְעִילוּת. פיתוח ספרייה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה בגדלים שונים טבעת מאפשר מסך שיטתי לקונפורמציה הפעילה הביולוגית ביותר. שיטה זו מספקת דרך כללית, מהירה, וקלילה לסנתז פפטידים מחזוריים.

כאן אנו מתארים את הפיתוח של ספרייה קטנה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה שמתמקדת PPIs החיוני של הטפיל שושנת יריחו ולפעול כסוכנים נגד פרזיטים (לסקירה על פפטידים המתמקדים ב- PPI כסוכנים נגד פרזיטים 87). באמצעות הסינתזה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה רומן, pharmacophores נשמר בפיגום של גודל להארכה. הכוח של הספרייה הממוקדת המוצעת כאן הוא היכולת להשתנות גדלי פיגום פפטיד, ובמקביל לאפשר מידה מסוימת של חופש קונפורמציה מוגבלת באמצעות cyclization. הסינתזה שלמה של פפ...

מתוארת שיטה פשוטה וכללית לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות הקרנת מיקרוגל. הליך זה מאפשר סינתזה של פפטידים מחזוריים של עמוד השדרה עם אוסף של קונפורמציות שונות תוך שמירה על שרשראות הצד והחלקים הפרמקופוריים., ולכן מאפשר לסנן את הקונפורמציה הביו-אקטיבית.

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח ספריית פפטידומימטיקה מחזורית בעלת שלד ממוקד עם גיוון קונפורמציוני באמצעות הקרנת מיקרוגל עבור תרופות אנטי-פרזיטיות חדשניות. שיטה זו יכולה לסייע בפיתוח כלים חדשים לטרגוט ספציפי של אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף 2.5 milliliters של חומצת האמינו הרצויה, milliliter אחד של מפעיל (activator), ו-0.5 milliliters של בסיס מפעיל למחסנית פוליפרופילן.הנח את המחסנית בסינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי ואפשר לתגובת הצימוד להתבצע במשך 300 שניות בהספק של 25 watts ובטמפרטורה של 75 degrees Celsius. עם השלמת התגובה, שטוף את השרף עם שבעה milliliters של N, N-dimethylformamide, או DMF, למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר חזרה על השלב הקודם חמש פעמים, הוסף למחסנית הפוליפרופילן שבעה milliliters של 20% piperidine ב-DMF עם 0.1 molar 1-hydroxybenzotriazole, או HOBt, והדגר למשך 30 שניות בהספק של 45 watts ובטמפרטורה של 75 degrees Celsius.עם סיום התהליך, רוקנו את תערובת התגובה. לאחר מכן, הוסיפו למחסנית הפוליפרופילן שבעה מיליליטרים של 20% piperidine ב-DMF עם 0.1 molar HOBt והדגירו למשך 180 שניות בהספק של 45 watts ובטמפרטורה של 75 degrees Celsius. לאחר ריקון תערובת התגובה, שטפו את הסורבנט עם שבעה מיליליטרים של DMF למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שטפו את השרף עם שבעה מיליליטרים של dichloromethane, או DCM, למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. עבור צימוד אנהידריד, שטפו את השרף עם שבעה מיליליטרים של 1-methyl-2-pyrrolidinone, או NMP, למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. בסיום, נקוזו את תערובת התגובה.לאחר חזרה על השלב הקודם שלוש פעמים, המיסו 10 מקובילים של האנהידריד המתאים בחמישה מיליליטר של NMP בתוך מבחנה מפוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו לתמיסה מקוביל אחד של 4-Dimethylaminopyridine, או DMAP, ו-10 מקובילים של N, N-diisopropylethylamine, או DIEA. הוסיפו תערובת זו לשרף, והדגירו למשך 300 שניות בהספק של 25 ווטים ובטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס.לאחר שטיפת השרף ב-NMP, שטפו אותו עם שבעה מיליליטרים של DMF למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר. בנקודה זו, העבירו את השרף למחסנית פוליפרופילן המצוידת בפקק ובברז. לאחר שטיפת השרף ב-DCM, הוסיפו למחסנית הפוליפרופילן 15 עד 25 מיליליטרים של תערובת המכילה 1% trifluoroacetic acid, 5% triisopropylsilane ו-94% DCM עבור כל 1 גרם שרף.הנח את מחסנית הפוליפרופילן על שייקר, ונער במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נקה את התמיסה ממחסנית הפוליפרופילן על ידי הפעלת ואקום. לאחר חזרה על השלבים הקודמים שלוש פעמים, שטוף את השרף עם 7 mL של DCM למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר.שלבים אלו חשובים ביותר, שכן נמצא כי קבוצות המגן טריטיל במספר שרפים התפרקו חלקית בתמיסות DCM-חומצה טריפלורואצטית. הסרת קבוצות מתילטריטיל היא תהליך איטי הדורש מספר שטיפות. בתוך מבחנה מפוליפרופילן בנפח 50 milliliter, המיסו חמישה שווה-ערכים של Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate בחמישה milliliters של דיברומומתאן.לאחר מכן, הוסף לתמיסה 10 שווקים (equivalents) של DIEA. הוסף את התערובת לשרף ששטף ב-DCM והדגר למשך 300 שניות בהספק של 25 watts ובטמפרטורה של 75 degrees Celsius. לאחר מכן, שטוף את השרף עם שבעה מיליליטרים של DCM למשך 120 שניות בטמפרטורת החדר.לאחר שתי שטיפות ב-DCM, העבירו את השרף למחסנית פוליפרופילן ושטפו פעמיים בדיאתיל אתר. ייבשו את השרף בדססיקטור ואקום בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות מעל פוטסיום הידרוקסיד. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תערובת ניתוק (cleavage cocktail) של חומצה טריפלואורואצטית שקוללה מראש לכל גרם אחד של שרף.הנח את מחסנית הפוליפרופילן על שייקר, ונער למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, אסוף את תמיסת הניתוק על ידי סינון הסורבן לתוך מבחנה מפוליפרופילן בנפח 50 milliliter. הוסף למבחנה 35 milliliters של דיאתיל אתר קר.סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1,207 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו את שכבת האתר. עבור בדיקת קייזר (Kaiser test), הכינו את תמיסה A על ידי המסה של 16.5 מיליגרם של potassium cyanide ב-25 מיליליטר של מים מזוקקים.דללו מיליליטר אחד של התמיסה ב-49 מיליליטר של peridine. לאחר מכן, הכינו את תמיסה B על ידי המסה של גרם אחד של ninhydrin ב-20 מיליליטר של ethanol. הכינו את תמיסה C על ידי המסה של 40 גרם של phenol ב-20 מיליליטר של ethanol.לאחר הכנת התמיסות, העבירו מספר חרו지를 מהשרף למבחנה. הוסיפו למבחנה שלוש טיפות מכל אחת מהתמיסות וערבבו. לבסוף, חממו את המבחנה על בלוק חימום בטמפרטורה של 110 °C למשך חמש דקות.סינתזה של הפפטידים המעגליים של השלד בוצעה באמצעות סינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי על תמיכה מוצקה, בהתאם לפרוטוקול FMOC, t-butyl. המוצר נותח באמצעות ספקטרומטריית מסות, ודרגת הניקיון שלו נקבעה באמצעות HPLC. סריקה ביולוגית הראתה כי הפפטיד pL1 היה פעיל נגד Leishmania donovani, טפיל הגורם ללישמניה ויסצרלית, הצורה החמורה ביותר של לישמניה בבני אדם.הפפטיד pL1 הפחית את חיוניות הטפיל ב-75% בהשוואה לטיפול הביקורת. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שלושה עד חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים במגוון רחב של תחומים לבחון פפטידים כווסתים פרמקולוגיים במחקר בסיסי ובטיפולים תרופתיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי הדרך לפיתוח ספרייה ממוקדת של פפטידומימטיקה (peptidomimetics) עם גיוון קונפורמציוני, במטרה להתמקד באופן ספציפי באינטראקציות בין חלבונים. זכרו כי עבודה עם חומצה טריפלואצטית (trifluoroacetic acid) עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון הרכבת הגנת עיניים, חלוק מעבדה וכפפות, תוך עבודה במנדף מאוורר היטב.

development-backbone-cyclic-peptide-library-as-potential

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

הפרוטוקול הבא מספק טכניקות לencapsulating לבלב β-תאים בידרוג PEG-פפטיד שלב צמיחה שהוקם על ידי thiol-ene תגובות תמונה בלחיצה. פלטפורמת חומר זה לא רק מציעה microenvironment cytocompatible אנקפסולציה תא, אלא גם מאפשרת התאוששות מהירה למשתמש שליטה מלאה של מבני תא נוצרה בתוך הידרוג.

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

בסרטון זה ידגים שיטה מהירה, יעילה לmethacrylate פולי (אתילן גליקול), המאפשר polymerizations שרשרת וסינתזת הידרוג'ל. זה ידגים כיצד להציג את פונקציות methacrylamide דומות לפפטידים, שיטות אנליטיות נפוצות פרטים כדי להעריך את יעילות functionalization, לספק הצעות לפתרון בעיות ושינויים מתקדמים, ולהדגים טכניקות אפיון הידרוג'ל טיפוסיות.

Functionalization בסיוע מיקרוגל של פולי (אתילן גליקול) ופפטידים על השרף לשימוש בPolymerizations שרשרת וגיבוש Hydrogel

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז ספרייה חד מתחם אחד אגל PTAs.

סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

מוצג פרוטוקול לסינתזה של פפטואידים בעלי פונקציונליות קטיונית מעורבת באותו רצף (מונומרים מסוג ליזין וארגינין). מתוארת גם בדיקה עוקבת של תרכובות אלה נגד Leishmania mexicana, הטפילים הפרוטוזואיים הגורמים ללישמניאזיס עורית.

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

פרוטוקול זה מציג את הסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה בין ציסטאין למתיונין ואת תגובת תיול-ין המופעלת על ידי מרכז פרופרגיל סולפוניום.

בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של פפטידים מחזוריים החודרים לתאים עם קישורים צולבים ארומטיים ואת הערכת החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים.

בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

מוצג מכשיר פשוט, זול וחדשני לביצוע סינתזות פפטיד פאזה מוצקה בכור מיקרוגל מסחרי.

התאמה זולה של כור מיקרוגל מסחרי לסינתזה של פפטידים בשלב מוצק

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור והערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית והציטוטוקסיות של הפפטיד הקטיוני Mel4 ושל הפפטיד המדמה RK758. על ידי שילוב סינתזה כימית, ביטוי רקומביננטי ובדיקות פונקציונליות סטנדרטיות, הוא מספק תהליך עבודה יעיל לייצור ובדיקה של פפטידים וחיקוי מולקולות קטנות.

ייצור ובדיקות של פפטידים אנטימיקרוביאליים והחיקויים שלהם

למד לסנתז פפטידים מחזוריים באמצעות קרינת מיקרוגל לפיתוח תרופות נגד טפילים. שיטה זו מאפשרת יצירת ספריית פפטידים מגוונת לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ופיתוח טיפולים ממוקדים.

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

גלה סרטונים נוספים