Name: תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: למדו כיצד לכמת את השפעת זרימת הנוזל הביניים על פלישת תאים סרטניים בתרבית תלת-ממדית. השיטה משתמשת בקולגן מסוג אחד ומטריג'ל עם תאי MDA-MB-435S.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Assay Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot קטן (&lt;500 μl) של Matrigel על הקרח ב 4 ° C (כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מתכון ג&#39;ל (ראו כרכים לדוגמה בטבלה להלן): PBS 10x (1x בהיקף כולל), סודיום הידרוקסיד 1N (שווה ערך ל 0.023 כרכים של קולגן נוסף, או לפי המלצות היצרן של קולגן, על פי הצורך), הקלד Matrigel ו קולגן I ל הריכוזים האחרונים של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 1.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בהתאמה (ניסוחים מטריקס אחרים עשויים לשמש תלוי בסוג התא הניסוי). </li></ol> ג&#39;ל למשל המתכון <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבי </td><td> המניות ריכוז </td><td> ריכוז סופי </td><td> הוספת נפח </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10X </td><td> 1X </td><td> .090 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מים סטריליים </td><td></td><td></td><td> .346 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1N NaOH </td><td></td><td></td><td> .008 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 9.90 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> .101 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> זנב עכברוש סוג אני קולגן </td><td> 3.66 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> .355 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את מרכיבי ג&#39;ל על הקרח ברצף זהה מעל הפתרון הסופי דגירה של שעה 1 על 4 ° C. מניסיוננו, הדגירה 1 שעות לפני זריעת תוצאות תאים gelation אחיד יותר של קולגן. הקפד לשמור Matrigel ו קולגן על הקרח כל הזמן ולעבוד מהר ככל האפשר כדי למנוע gelation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 12 מ&quot;מ בקוטר 8 מיקרומטר הנקבוביות סלולריים תרבות מכניס לתוך צלחת של 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ו resuspend בסרום ללא מדיה ב 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל (הנפח הכולל צריך להיות 10% של פתרון ג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של תאים suspension ל μl 900 הפתרון ג&#39;ל (ריכוז התאים הסופי 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של התערובת הסופית כדי להוסיף כל העברה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 30 דקות עד ג&#39;ל polymerizes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסרום ללא מדיה, </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl על גבי ג&#39;ל ו 1200 μl תחת הכנס למצב הסטטי. רמות נוזל בתוך להוסיף ומחוצה היטב צריך להיות שווה בקירוב, וכתוצאה מכך ההבדל לחץ מינימלי על פני ג&#39;ל ולא זרימת ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl תחת הכנס ו 650 μl מעל ג&#39;ל למצב את הזרימה. להיזהר כדי למנוע בועות אוויר מתחת הכנס, כפי שהם ימנעו תאים נודדים דרך הממברנה במקומות אלה. ההבדל הלחץ שנוצר על ידי כרכים אלה הוא כ 1.3 ס&quot;מ H 2 O (או 1 מ&quot;מ כספית). </li></ul><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום צלחת 37מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 24. </li></ol> 2. תא מכתים והספירה נמשכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1X PBS לכל גם לתוך צלחת חדשה 24 טוב, זה ישמש כדי לשטוף את מוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני להישאר בחלק העליון של זרימת transwells ולקבוע את עוצמת הקול. חישוב נפח eluted הכולל על ידי הפחתת נפח הנותר מנפח הכולל הוסיף במקור, 650 μl (זה ישמש לחישוב שיעור הזרימה, ראה להלן). השתמש צמר גפן כדי להסיר את ג &#39;ל מ ו מוסיף את לנגב את המשטח העליון של קרום להסיר תאים שאינם שפלשו. מניחים את מכניסה לתוך צלחת 24-1X המכיל גם עבור PBS של 15 לשטוף מוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) מתחת להוסיף כל דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים transmigrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PFA ולשטוף פעם אחת עם 500 μl 1X PBS להסיר מקבע שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl Oו 0.5% טריטון X-100 הפתרון מתחת מוסיף ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור ממברנות מתוך הכנס באמצעות סכין גילוח ומקום לתוך μl של 100 מיקרוגרם 2 / מ&quot;ל ​​DAPI בפתרון PBS 1X, נזהר למקם את החלק התחתון של הפנים כלפי מטה קרום (תאים transmigrated עם הפנים כלפי מטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים על שאכר בסל&quot;ד 150 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הקרומים של 500 μl 1X PBS על שאכר (חוזר 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר DAPI חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנות מקום על שקופיות זכוכית עם תאים transmigrated פונה כלפי מעלה, להוסיף פתרון גוברת תלוש כיסוי. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת DAPI מוכתם גרעינים על 5 מקומות שנבחרו באופן אקראי של קרום זה (להתרחק הקצוות ולהשתמש 10X או 20X עדשה אובייקטיבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר הסלולרי הממוצע ולקבל את הפלישה אחוזים על ידי שימוש בנוסחה הבאה: הפלישה אחוזים = X 100% (תא הממוצע ספירת קרום x שטח הפנים) / (שטח הפנים של מספר התמונה X מיקרוסקופ של תאים seeded) הפלישה אחוזים ניתן מנורמל למצב שליטה מסוימת (בדרך כלל מצב סטטי), כדי לאפשר השוואה בין ניסויים בלתי תלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שיעור הזרימה הממוצע: לחלק את נפח eluted סך במצב זרימת עד הדגירה (למשל 24 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מהירות זרימת ממוצע: לחלק את קצב הזרימה הממוצע של שטח חתך של ג&#39;ל / קרום (במקרה זה 60 מ&quot;מ 2). </li></ol> 4. נציג תוצאות כדי למדוד את הפלישה תאים סרטניים תחת זרם ביניים, ביצענו 3-D שלנו הפלישה זרימת assay באמצעות מד&quot;א-MB-435S בתאי מלנומה גרורתית. תאים אלה בעבר הוכח לפלוש בתגובה זרימת הנוזל ביניים 13-14. התאים היו מוטבע מטריצה ​​מורכבת של 1.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עכברוש טאיקולגן אני הגיד סוג I ו 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל קרום Matrigel מטריקס במרתף בריכוז התא הסופי של 5 x 10 5 תאים למ&quot;ל. שני תנאים שונים הושוו: (1) זרימת ביניים הממוצע = 0.1 מיקרומטר של -1 ו - (2) מצב סטטי = לא הספיקה מדידה (איור 1). אחרי 24 שעות, התאים שפלשו דרך הנקבוביות של קרום הוכתמו DAPI כדי להקל על ספירת התאים. תרשים 2 מציג תמונה מייצגת של תאים שפלשו. תחת brightfield, רק את נקבוביות הממברנה גלויים. באמצעות הקרינה, גרעינים DAPI מוכתם שימשו ספירת התאים את phalloidin F-אקטין מבנים מוכתמים שימשו לדמיין גוף התא (לא חובה). באמצעות הסטודנטים של מבחן t בהנחה שונויות שוות, אנו הראו כי זרימת ביניים מגביר באופן משמעותי את מד&quot;א-MB-435S הפלישה התא על ידי 2.3 על פי התנאים סטטיים (p = 0.003) (איור 3). זה בשיתוף פעולה נרחבTES ממצאים דומים (אך עם תנאים שונים מטריקס ולכן מהירויות הזרימה) באמצעות את שורות התאים 13-14. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של 3-D זרימת נוזל interstitial assay הפלישה. ראשית להכין פתרון ג&#39;ל באמצעות ריכוזים מתאימים ואמצעי אחסון. לאחר מכן להוסיף תאים לפתרון ג&#39;ל ולהעביר מוסיף תרבית תאים. לבסוף להוסיף נפח מתאים של התקשורת למצב כל דגירה. זרימת הנוזל ביניים הוא מונע על ידי ראש לחץ נוזלים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> איור 2. Transmigrated מד&quot;א-MB-435S על קרום התאים. תאים שפלשו נקבעו לאחר assay זרימת ביניים שלנו הפלישה נוזל ומוכתמים DAPI ו-Alexa פלואוריד 488 מצומדות phalloidin כדי להקל על ספירת התאים פלשו; תמונה) של קרום מתחת לשדה בהיר, ב &#39;) DAPI STAגרעינים עומד לבחינה (בכחול); C) Alexa פלואוריד 488-phalloidin צבעונית F-אקטין (בירוק). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> איור 3. הגדלת הפלישה של מד&quot;א-MB-435S תאים תחת הזרם. הפלישה התא לאחר 24 שעות משופרת באופן משמעותי על ידי זרימת ביניים (p = 0.003). התוצאות מנורמל למצב סטטי הממוצע וערכים מייצגים ממוצע ± SEM של 6 מוסיף תרבית תאים.

<ol><li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland.+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li>
<li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma%3A+tumor+agonist+or+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stroma: tumor agonist or antagonist.</a> Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment and progression.</a> J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+transfer+of+fluid+in+the+interstitial+compartment+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors.</a> Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).</li>
<li>Dafni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+drives+peritumor+interstitial+convection+and+induces+lymphatic+drain%3A+magnetic+resonance+imaging%2C+confocal+microscopy%2C+and+histological+tracking+of+triple-labeled+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin.</a> Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).</li>
<li>Chary, S. R., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interstitial+convection+and+diffusion+of+albumin+in+normal+and+neoplastic+tissues+by+fluorescence+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).</li>
<li>Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
<li>Shields, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71, 790-800 (2011).</li>
<li>Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+interstitial+flow+mechanotransduction+regulating+MMP-13+expression+and+cell+motility+via+FAK-ERK+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen.</a> PLoS One. 6, e15956(2011).</li>
<li>Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+morphogen+gradients+by+subtle+interstitial+flow+and+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions.</a> Biophys J. 91, 113-121 (2006).</li>
<li>Miteva, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ. Res. 106, 920-931 (2010).</li>
<li>Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+induces+myofibroblast+differentiation+and+collagen+alignment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro.</a> J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).</li>
<li>Kunder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+particles+deliver+peripheral+signals+to+remote+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).</li>
<li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li>
<li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li>
<li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li>
<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

כאן אנו מתארים מתודולוגיה לכימות ההשפעה של זרימת ביניים על הפלישה תאים סרטניים, תוך שימוש בתאי משוקע בתוך 3-D בתוך להוסיף תרבית תאים. שיטות אלה דומים שימשו כדי ללמוד את ההשפעה של זרימת ביניים על מגוון רחב של סוגי תאים 13-15, 17. הגישה שלנו מחקה באופן חלקי microenvironment מטריצה ​​של הגידול על ידי שימוש בסוג אני קולגן Matrigel אשר מכילים חלבונים המצויים בתוך קרום במרתף של רקמת אפיתל stroma סביב 21-22. מערכת זו קל יחסית ההגדרה, פשוט, ויותר חסכוני יותר התקנים m...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> קולגן (זנב עכבר) </td><td> BD </td><td> 354236 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> תרבות Millicell תא הוספה </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td> 8 נקבוביות בקוטר מיקרומטר, פוליקרבונט הממברנה </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td> 354234 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 100-8202 </td><td> 10x להכנת הפתרון ג&#39;ל, 1x לשטיפת צעדים </td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי, פתרון 1.0N </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> S2770 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10-013-CV </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> 511150 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 100 x-500 מ&quot;ל </td><td> 0.5% ב PBS </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 04042-500 </td><td> 4% ב PBS </td></tr><tr><td> Deionized מים </td><td></td><td></td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 0215757401 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות </td></tr><tr><td> הרכבה פתרון </td><td> Thermo Scientific </td><td> מדד ת&quot;א 030-FM </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25-052-CI </td><td> שמור סטרילית </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

צמיחה והתקדמות של גידולים מוצקים רוב תלויים השינוי הראשוני של תאים סרטניים ואת תגובתם stroma הקשורים איתות microenvironment הגידול 1. בעבר, מחקר על microenvironment הגידול התמקדו בעיקר גידולים סטרומה אינטראקציות 1-2. עם זאת, microenvironment הגידול כולל גם מגוון של כוחות Biophysical, אשר תופעות להישאר ממעטים להבין. כוחות אלה הם תוצאות ביומכניים של הגידול להוביל שינויים בביטוי גנים, חלוקת התא, התמיינות ופלישה 3. צפיפות מטריקס 4, נוקשות 5-6, והמבנה 6-7, לחץ נוזלים ביניים 8, ואת זרימת נוזל interstitial 8 משתנים במהלך כל התקדמות הסרטן. זרימת הנוזל ביניים בפרט הוא גבוה יותר גידולים לעומת 8-10 רקמות נורמליות. נוזל מוערך ביניים FLמהירויות ow נמדדו ונמצא כי בטווח של 0.1-3 מיקרומטר s -1, תלוי בגודל הגידול והבחנה 9, 11. זאת בשל לחץ גבוה נוזל interstitial שנגרם על ידי הגידול אנגיוגנזה המושרית וחדירות כלי הדם מוגברת 12. זרימת הנוזל ביניים הוכח להגדיל את הפלישה של תאים סרטניים 13-14, fibroblasts כלי דם ותאי שריר חלק 15. פלישה זו עשויה לנבוע הדרגתיים chemotactic עצמיים שנוצרו סביב תאים 3-D 16 או עלה metalloproteinase מטריקס (MMP) הביטוי 15, הפרשת chemokine ו הידבקות התא מולקולות ביטוי 17. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו התאים לחוש זרימת הנוזל אינה מובנת היטב. בנוסף שינוי התנהגות תאים סרטניים, זרימת נוזל interstitial מודולציה את הפעילות של תאים אחרים microenvironment הגידול. היא מזוהה עם בידול (א) נהיגה של fibroblasts לתוך הגידול, קידום myofibroblasts 18, (ב) ההובלה של אנטיגנים וגורמים מסיסים אחרים לבלוטות הלימפה 19, (ג) הלימפה ויסות תא האנדותל המורפוגנזה 20. השיטה המוצגת כאן מטיל זרימת הנוזל ביניים על תאים במבחנה מכמת את השפעותיו על הפלישה (איור 1). שיטה זו פורסמו מחקרים רבים כדי למדוד את ההשפעות של זרימת הנוזל על סטרומה ופלישה סרטן תאים 13-15, 17. על ידי שינוי הרכב מטריקס, סוג התא, וריכוז התא, שיטה זו ניתן להחיל על מחלות אחרות ומערכות פיזיולוגיות כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על תהליכים תאיים כגון התפשטות הפלישה, בידול, ועל ביטוי גנים.

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

הצמיחה וההתקדמות של מרבית הגודולים המוצקים תלויות בטרנספורמציה הראשונית של תאי הסרטן ובמענם לאותות הקשורים לסטרומה...

מטרת פרוצדורה זו היא לחשוף תאים שגודלו בתלת-ממד (3D) לזרימה של נוזל בינתיים, ולכמת את ההשפעות המתווכות על ידי הזרימה על פלישת תאים. הדבר משיג תחילה על ידי הכנת תמיסת ג'ל המורכבת מקולגן מסוג 1 ומ-matrigel. השלב השני הוא הוספת ריכוז מוגדר של תאים לתמיסת הג'ל.בשלב הבא, תרחיף התאים מתווסף למערכת transwell בקוטר 12 מילימטר וגודל נקבים של שמונה מיקרון, ומודגכר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהמטריקס הופך לג'ל. השלב האחרון בהקמת הבדיקה הוא הוספת כמויות ספציפיות של מצע גידול ל-transwells כדי ליצור תנאים סטטיים ותנאי זרימה. לאחר 24 שעות, ממברנות ה-transwell מקובעות, נצבעות ונערכות לצפייה לצורך כימות מספר התאים שפלשו.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי זרימה אינטרסטיציאלית מיקרופלואידיים, הוא שאינה דורשת משאבות או ציוד ייעודי, והיא מאפשרת לחוקרים לבחון מספר תנאים או טיפולים בקלות ובמהירות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נדידה ופלישה תאית, ניתן להשתמש בה או ליישמה גם כדי לחקור את השפעת הזרימה של נוזל אינטרסטיציאלי על התנהגויות תאיות רלוונטיות אחרות, כגון ביטוי חלבונים, שגשוג תאים ושינויים באיתות תאי. הדגמת הליך זה תהיה LIMA two chaa.סטודנט לתואר שני במעבדה שלי יתחיל את הפרוצדורה על ידי הנחת מנה קטנה של matri gel על קרח בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, יש להכין את תרסיף

three-dimensional-cell-culture-model-for-measuring-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה ​​תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר...

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס ספרואיד גידול תלת ממדי ותרבית משותפת של תאי T. אגרוז יצוק עם microwells המכילים spheroids הגידול מוכן, ואחריו תוספת של תאי T. לאחר הדגירה, מערך זה מאפשר לחקור את האינטראקציה של תאי T עם ספרואידים סרטניים בסביבה תלת ממדית מבוקרת.

מודל תלת מימדי של תרבית משותפת של חדירת תאי T לספרואידים סרטניים

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתרבית משותפת בתלת מימד, שימושי לחקירת אינטראקציות רב-תאיות ואפנון תלוי מטריצה חוץ-תאית של התנהגות תאי סרטן. במודל ניסיוני זה, תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בפיברובלסטים הקשורים לסרטן אנושי.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

למדו כיצד לכמת את השפעת זרימת הנוזל הביניים על פלישת תאים סרטניים בתרבית תלת-ממדית. השיטה משתמשת בקולגן מסוג אחד ומטריג'ל עם תאי MDA-MB-435S.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

גלה סרטונים נוספים