תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

מטרת הליך זה היא לחשוף תאים שגודלו בתלת מימד לזרימת נוזל אינטרסטיציאלית, ולכמת את ההשפעות המתווכות על פלישת התאים. זה מושג על ידי הכנת תמיסת ג'ל המורכבת מקולגן ומטריגל מסוג 1. השלב השני הוא הוספת ריכוז מוגדר של תאים לתמיסת הג'ל.

לאחר מכן, תרחיף התא מתווסף לקוטר 12 מילימטר, גודל נקבוביות של שמונה מיקרון, ומודגר ב-37 מעלות צלזיוס עד שהמטריצה מג'ל. השלב האחרון במערך הבדיקה הוא הוספת כמויות ספציפיות של מדיה למעברים כדי ליצור תנאים סטטיים וזרימה. 24 שעות לאחר מכן, ממברנות הטרנסוול מקובעות, מוכתמות ומומחשות לכימות מספר התאים שפלשו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי זרימה מיקרופלואידיים, אינטרסטיציאליים, הוא שהיא אינה דורשת משאבות או ציוד מיוחד, והיא מאפשרת לחוקרים לבדוק מצבים או טיפולים מרובים בקלות ובמהירות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נדידה ופלישה תאית, ניתן להשתמש בה או ליישם אותה גם כדי לחקור את ההשפעה של זרימת נוזל אינטרסטיציאלי על התנהגות תאית רלוונטית אחרת, כגון ביטוי חלבונים, התפשטות תאים ושינויים באיתות התאים. הדגמה של הליך זה תהיה LIMA two chaa.

סטודנט לתואר שני במעבדה שלי התחל את ההליך הזה על ידי זריקת כמות קטנה של ג'ל מאטרי על קרח בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את מתכון הג'ל עם מים סטריליים PBS, נתרן הידרוקסיד, מטריג'ל וקולגן זנב עכברוש מסוג אחד. לאחר מכן מערבבים את מרכיבי הג'ל על קרח באותו רצף ומדגרים את התמיסה הסופית למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.

כעת הניחו שמונה תרביות מיקרו-פו בקוטר 12 מילימטר לתוך צלחת של 12 בארות באמצעות זוג מלקחיים מעוקרים. לאחר מכן ספרו את התאים והשעו אותם מחדש במדיה נטולת סרום בחמש פעמים 10 לששת התאים למיליליטר, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל-900 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל. לאחר מכן, ערבבו אותם היטב על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה.

לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר מהתערובת הסופית לכל תוספת. לאחר מכן העבירו את התוספות לחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך 30 דקות עד שהג'ל מתפלמר. למצב הסטטי, הוסף 100 מיקרוליטר של המדיה נטולת הסרום על גבי הג'ל ו-1,200 מיקרוליטר מיקרוליטר מתחת לתוספת.

רמות הנוזל בתוך ומחוץ לתוספת בבאר צריכות להיות שוות בערך, וכתוצאה מכך הפרש לחץ מינימלי על פני הג'ל וללא זרימת ביניים. למצב הזרימה, הוסף 100 מיקרוליטר של המדיה נטולת הסרום מתחת לתוספת ו-650 מיקרוליטר מעל הג'ל. יחד עם זאת, נסו להימנע מיצירת בועות אוויר מתחת לתוספת מכיוון שהן ימנעו מהתאים לנדוד דרך הממברנה במקומות אלה.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך 24 שעות. בשלב זה, הוסף 500 מיקרוליטר של PBS פעם אחת לבאר לצלחת חדשה של 24 בארות לשטיפת התוספות. לאחר מכן הסר את המדיום שנותר בחלק העליון של בארות מגמות הזרימה.

לאחר מכן, השתמש בצמר גפן כדי להסיר את הג'ל מהתוספות. נגב את החלק העליון של פני הממברנה על מנת להסיר תאים שאינם VA. לאחר מכן שטפו את התוספות על ידי הנחתם בצלחת 24 בארות המכילה פעם אחת PBS למשך 15 שניות.

לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 500 מיקרוליטר של 4%para פורמלדהיד מתחת לכל תוספת. דגרו אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לקיבוע התאים הנודדים הטרנס. לאחר מכן הסר את ה-PFA ושטוף אותם פעם אחת עם 500 מיקרוליטר פעם אחת PBS כדי להסיר את הקיבוע הנותר.

לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת 0.5% Triton X 100 מתחת לתוספות ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחלחל את התאים, חותכים את הממברנות החוצה מהתוספת באמצעות סכין גילוח. לאחר מכן הניחו אותם ב -100 מיקרוליטר של שני מיקרוגרם למיליליטר DPI בתמיסת PBS חד פעמית.

הקפד למקם את הצד התחתון של הממברנה כלפי מטה. יש להכין את תמיסת ה- DPI מספר דקות לפני השימוש ולשמור בחושך. כעת עטפו את הצלחת בנייר אלומיניום.

הניחו אותו על שייקר ב-150 סל"ד למשך 30 דקות של טמפרטורת החדר. לאחר מכן שוטפים את הממברנות ב -500 מיקרוליטר פעם אחת PBS ומניחים אותם בחזרה על השייקר למשך 10 דקות. כדי להסיר ג'יי חופשי, חזור על הכביסה פעמיים נוספות.

השלב הבא הוא להניח את הממברנות על שקופיות זכוכית עם תאים נודדים טרנס כלפי מעלה. הוסף תמיסת הרכבה לממברנות. ואז מכסים אותם בתלושי כיסוי.

לאחר מכן, ספרו את הכתם המטופש לגרעינים וחשבו את מספר התאים שפלשו לפי כתב היד המצורף. איור זה מציג את תאי MDA MB 4 35 s שהועברו על הממברנה. התאים שפלשו תוקנו לאחר בדיקת פלישת זרימת הנוזל הבין-רקמתי ונצבעו ב-DPI ו-Alexa Fluor 4 88 הצמיד את ה-foid פנימה כדי להקל על ספירת התאים שפלשו.

זהו הממברנה מתחת לשדה בהיר, והנה גרעיני הכתם המטופש. ה-Alexa Fluor 4 88 foid מוכתם ב-F actin מוצגים כאן. גרף זה מראה כי הפלישה של תאי מלנומה גרורתית של MDA MB 4 35 s הוגברה באופן משמעותי על ידי זרימה אינטרסטיציאלית.

לאחר 24 שעות, התוצאות מנורמלות לממוצע של מצב הפלישה הסטטית ומוצג הממוצע משש תוספות תרבית תאים. ההבדל בין התנאים מובהק סטטיסטית עם ערך P של 0.003. לאחר השליטה, ניתן להגדיר את בדיקת זרימת הנוזל הבין-רקמתי תוך שעתיים, ולאחר מכן דגירה של 24 שעות, ולאחר מכן שעתיים לקיבוע וצביעה של ממברנות הטרנספורמציה.

בעקבות הליך זה, ניתן לחלץ בקלות תאים, חלבונים או חומצות גרעין על מנת לענות על שאלות נוספות כגון כיצד ביטוי גנים וחלבונים משתנה בתגובה לזרימת נוזל אינטרסטיציאלי. מאז פיתוחו, זה הפך לבדיקה חיונית עבור חוקרים החוקרים את ההשפעות של זרימת אינטרסטיציאלית על תאים סרטניים.