הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

ניסוי זה משתמש במודולציה סלקטיבית של איזופורמי Protein Kinase C כדי לקבוע את תפקודיהם המיטוכונדריאליים והתאיים בתאי צינוריות פרוקסימליות כלייתיות תחת תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. ראשית, יש לבודד תאי צינוריות פרוקסימליות כלייתיות ראשוניים מהקליפה הכלייתית, או RPCs בעלי מטבוליזם חמצוני הדומה לזה של צינוריות פרוקסימליות כלייתיות.

הדביקו ב-vivo את תאי ה-RPCs באמצעות וקטורים אדנו-ויראליים המבטאים צורות פעילות ובלתי פעילות של חלבון Protein Kinase C. לאחר מכן, בצעו בדיקה של התפקודי המיטוכונדריים השונים וחיוניות התאים כדי לקבוע את השפעת האינזים על יכולתה של המיטוכונדריה לסנתז ATP ולמנוע מוות תאי. כמו כן, בצעו אנליזת אימונו-בלוט של Protein Kinase C epsilon ומצורתו זופספורילה בליסאטים תאיים שנלקחו יחד.

התוצאות מראות כי הפעלת protein kinase epsilon מווסתת באופן שלילי את היכולת המיטוכונדריאלית לייצר ATP, מפחיתה את רמות ה-ATP התאיות ואת חיוניותן של תאי הפרוקסימלי של הרשת השופנית (renal proximal tubular cells). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות שלנו, כגון קווי תאים, הוא שתרביות ראשוניות של תאי הפרוקסימלי של הרשת השופנית שומרות על התפקודים המובחנים והמטבוליזם החמצוני של הרשת השופנית הפרוקסימלית. מכיוון שניתן להשתמש ב-protein kinases כמטרות וכסוכנים טיפוליים פוטנציאליים, ההשלכות של טכניקה זו חולות על טיפול למניעת פגיעה בכליות או לה으로는 האצת ההחלמה של הכליות לאחר פגיעה.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני הפגיעה וההחלמה. ניתן ליישמה גם עבור כליות ארנב שבודדו טרי, ששטפו באופן רצופים ב-50 מיליליטר של כל אחד מהבאים: מצע sterile D-M-E-M-F 12 סטרילי, תמיסת phosphate buffered saline סטרילית ב-pH 7.4, ותמיסת PBS עם תחמוצת ברזל, כדי לקצור את קליפת כל כליה.

ראשית, הומוגניזרו את הרקמה באמצעות הומוגניזטור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט דרך שני נפה רשת סטריליים לתוך כלי בקר סטרילי של ליטר אחד. שטפו את התאים שנותרו על הנפות עם בופר המכיל deferoxamine.

העבירו את כל הרקמה שנותרה בתחתית נפה של 85 מיקרון ל-40 מיליליטר של בופר המכיל deferoxamine, הממוקם בתוך מבחנה קונית לצנטריפוגה. ערבבו בעדינות את תרחיף התאים באמצעות מגנט חזק.

אספו את הגלומרולים הממולאים בברזל ושאבו את הברזל הנצמד למגנט. התאימו את נפח תרחיף התאים ל-40 milliliters והוסיפו מיליליטר אחד של מצע עיכול המכיל collagenase. הדגירה תתבצע בטמפרטורת החדר למשך 17 דקות.

ערבוב עדין של התמיה. קצירת התאים על ידי סנטריפוגציה ב-50 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C לאחר מספר שטיפות. השעיה מחדש של משקע התאים ב-46 מיליליטר של מצע ללא גלוקוז.

את ה-RT PCs הראשוניים תרבית בצפיפות של מיליגרם אחד של חלבון לכל צלחת תרבית ב-2 ml של מצע D-M-E-M-F 12 ללא גלוקוז, על ניעור אורביטלי ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר חידוש המצע, יש להדביק תאי RPT שהגיעו למצב קונפלואנציה באמצעות אדנווירוס הנושא CD NA עבור protein kinase C epsilon פעיל באופן קונסטיטוטיבי, או עבור protein kinase C epsilon דומיננטי-שלילי; יש להדגיר למשך 24 שעות, לחדש את המצע ולתרבת את ה-RPCs הראשוניים שעברו טרנספקציה למשך 24 שעות נוספות. כדי להדגים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של השכבה החד-שכבתית של התאים הראשוניים, יש לחדש את המצע, להוסיף MIT tracker red five 80 ולהחזיר את הצלחות לאינקובטור למשך 30 דקות.

לאחר מכן, בחנו את השכבות התאיות החיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות עדשת טבילה במים. שני. כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריאלי, בדקו את נשמיות מצב 3 (state three respiration) של תרחיף ה-RPTC בתא למדידת צריכת חמצן המצויד באלקטרודה מסוג Clark.

ראשית, מדדו נשימה במצב 2 (state two) בהיעדר DP. לאחר מכן, הוסיפו DP עד לריכוז סופי של 0.4 millimolar. כדי להתחיל נשימה במצב 3 (state three) עבור נשימה במצב 4 (state four), הוסיפו oligomycin עד לריכוז סופי של 0.5 micrograms per milliliter.

בנוסף, יש לכלול מדידה של נשימה לא מצומדת (uncoupled respiration) על ידי הוספת 0.5 µM FCCP לתאים הנשימים במצב שלושה (state three). הוסיפו באיטיות 20 µL של תמיסת JC-1 בריכוז 0.5 mM לכל צלחת תרבית של RPTC וסובבו את הצלחת כדי לערבב את הצבע ביסודיות. החזירו את הצלחות לאינקובטור למשך 30 דקות.

בשלב הבא, העבירו את התרביות לקרח ובצעו שתי שטיפות ב-PBS קר מאוד. לאחר מכן, קצרו את התאים. העבירו את תאי ה-RPT למבחנה מסוג einor והפרידו את השכבות המונידריות לתליה של תאים בודדים באמצעות פיפוט.

נתחו את הפלואורסצנציה באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) תוך שימוש בעירור על ידי לייזר ארגון יונים של 488 ננומטר. לאחר מכן, חשבו את פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה של מיטוכונדריה מבודדות. סייעו בהערכת התקינות של שרשרת הנשמה.

לאחר שני שטיפות של שכבות התאי RPTC בבופר PBS קר מאוד, קצרו את התאים ושקיעו אותם על ידי צנטריפוגציה. שטפו את המשקעת פעם אחת ב-1 mL של בופר A, ולאחר מכן הומוגניזו את התאים בהומוגניזר Dounce עד שרוב התאים בהומוגנאט יהיו שבורים בבדיקה תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, הסירו את השאריות התאיות באמצעות צנטריפוגציה במהירות נמוכה.

שקע את המיטוכונדריה הגולמיות מהמרקח ב-15,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C ובצע שלושה שטיפות של המיטוכונדריה השקועות בבופר c. השהה מחדש את משקע המיטוכונדריה ב-50 עד 100 µL של בופר הבדיקה והקפא בחנקן נוזלי כדי לבחון את פעילות ה-NADH ubiquinone oxid reductase. הוסף 500 µL של בופר הבדיקה עם התוספות והמיטוכונדריה; כלול גם דגימה ריקה (blank) המכילה את כל התוספות ללא מיטוכונדריה. השרה את הפלטה בטמפרטורה של 30 °C עם ערבוב למשך חמש דקות.

בשלב הבא, הניחו את הפלטה בספקטרופוטומטר והוסיפו 10 µL של ubiquinone בריכוז 3.25 mM כדי להתחיל את התגובה בכל באר. רשמו את הבליעה ב-340 nm למשך שלוש דקות במרווחי זמן של 22 שניות. במבחן דומה, מדדו את הפעילות של cytochrome C oxidase תוך שימוש ב-cytochrome C רדוקציוני כתסבס עבור תגובת ATP synthase.

הכינו תערובות לבדיקת הפעילות הכוללת של APAs ופעילות APAs שאינה רגישה לאוליגומייסין עבור כל קבוצת טיפול. דגרו את הדגימות בתערובת התגובה בטמפרטורה של 31 °C למשך 10 דקות. התחילו את התגובה על ידי הוספת סובסטרט TP ודגרו בטמפרטורה של 31 °C למשך חמש דקות.

העבירו 200 µL מתערובת הדגירה למבחנה המכילה 50 µL של TCA בריכוז 3 M, והשקיעו את החלבונים על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, השקיעו את המשקע באמצעות צנטריפוגה. בשלב הבא, מלאו פלטה בעלת 96 בארות ב-50 µL של כל סטנדרט פוספט וב-50 µL של על-משקע מכל דגימה, בשכפולים.

לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של רסגנט Sumner לכל באר והדרימו בטמפרטורה של 30 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, רשמו את הבליעה באורך גל של 595 nm. שטפו את שכבות המונו-לייר של ה-RPTC פעמיים בבופר PBS קר בקרח.

קצרו את התאים ב-1 milliliter של PBS והעבירו את תרחיף התאים לנבובת אפנדורף (einor tube). שקיעו את דגימות ה-RPTC באמצעות צנטריפוגה וקבעו את תכולת ה-ATP באמצעות שיטת הלוסיפראז של ערכת בדיקה בביולומינסנציה של ATP. לצורך ניתוח חיוניות תאים בצלחות של 35 millimeter, השתמשו בחמש שכבות מונו-שכבתיות של RPTC עבור שלוש קבוצות טיפול בקרה של תאים חיוביים לבצקת (on osis), תאים חיוביים לאפופטוזיס ובקרת ביקורת ללא צביעה עבור שתי צלחות.

הוסיפו שני מיקרוליטרים של cisplatin בריכוז 50 millimolar לסדרה השנייה. הוסיפו שני מיקרוליטרים של tert butyl hydroperoxide בריכוז 500 millimolar. לאחר צביעת התאים באמצעות propidium iodide כפי שפורט בטקסט הנלווה, שטפו את השכבות Ein-layer (monolayers) עם תמיסת הקישור (binding buffer).

בשלב הבא, צבעו את התאים באמצעות ANNEXIN five המשורשר ל-ZI כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, אספו בעדינות את התאים והשעו אותם ב-500 µL של תמיסת קישור (binding buffer), באמצעות שוט גומי (rubber policeman).

השתמשו בפיפט כדי לפזר את התאים לסספנסיות של תאים בודדים והעבירו את סספנסיות התאים לשפמפורות לציטומטריה זרימה. פזרו את התאים לסספנסיות של תאים בודדים. המשיכו מיד לכיות הפלואורסצנציה עבור PI ו-FE באמצעות ציטומטריה זרימה; הובלה אדנו-ויראלית של CD NA המצפה את המוטנטים הפעילים קבועית (CONSTITUENTLY active) והלא פעילים של protein kinase C epsilon גורמת לעלייה משמעותית ברמות החלבון של protein kinase C epsilon ב-RPTC ובמיטוכונדריה.

כצפוי, הצורה הפעילה באופן קבוע של האנזים עוברת פוספורילציה ב-RP tcs, והאנזים הדומיננטי-שלילי אינו עובר פוספורילציה. נוכחות של protein kinase C epsilon פעיל מפחיתה את הנשימה המיטוכונדריאלית ב-RPTC ללא קשר לסובסטרט המשמש להענקת אנרגיה למיטוכונדריה. לעומת זאת, ל-protein kinase C epsilon לא פעיל אין השפעה על הנשימה המיטוכונדריאלית.

מעניין לציין כי הפעלה של protein kinase C epsilon ב-RP TCS מפחיתה את הפעילות של קומפלקס 1 ב-4. ירידה זו בנשימה של RPTC קשורה לעלייה בפוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה. למוטנט הדומיננטי-שלילי אין השפעה כזו.

שינויים אלו מלווים גם בירידה בפעילות של TP synthase במיטוכונדריה שבודדו מ-RPTC המבטאים באופן יתר את protein kinase C epsilon הפעיל. כתוצאה מכך, תכולת ה-A TP של RPTC המבטאים באופן יתר את protein kinase C epsilon הפעיל פחותה. הפעלה ממושכת של protein kinase C epsilon בעלת השפעות עמוקות על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית, כפי שניתן לראות בפרגמנטציה מיטוכונדריאלית.

הפעלה של Protein kinase C, אך לא עיכובה. הדבר מוביל גם לשינויים במורפולוגיה של RPTC הגורמים להתכווצות תאים ולהארכה של תאים ששרדו. השפעות מיטוכונדריאליות אלו של ביטוי יתר של protein kinase C epsilon הפעיל ב-RPCs נמצאו במתאם גם עם מוות תאי על ידי ONCOS ו-apoptosis.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ביצוע ביטוי יתר של חלבונים בתרביות ראשוניות באמצעות טכניקה אדנו-ויראלית, וכיצד להעריך את קיבולת המיטוכונדריה לסינתזת TP. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כהלכה. ובנוסף, אל תשכחו שעבודה עם אדנו-וירוס כרוכה בסיכון, לכן נקטו באמצעי זהירות מתאימים.