הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

ניסוי זה משתמש באפנון סלקטיבי של החלבון קינאז C ISO xms כדי לקבוע את תפקודיהם המיטוכונדריאלים והתאים בתאים צינוריים פרוקסימליים כלייתיים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. ראשית, בודד את התאים הצינוריים הפרוקסימליים הכלייתיים הראשוניים מקליפת הכליה או RPCs בעלי חילוף חומרים חמצוני. דומה לזה של צינורות פרוקסימליים כלייתיים.

Vivo מדביק את ה-RPCs בווקטורים אדנו-ויראליים המבטאים צורות פעילות ולא פעילות של איזיס של חלבון. לאחר מכן קינאז C בודק את התפקודים המיטוכונדריאלים השונים ואת כדאיות התא כדי לקבוע את השפעת ה-is zyme על היכולת המיטוכונדריאלית לסנתז A TP ולמנוע מוות תאי. בצע גם ניתוח כתמים חיסוניים של אפסילון זרחני וחלבון קינאז C בליזטים תאיים שנלקחו יחד.

התוצאות מראות כי הפעלת חלבון קינאז אפסילון מווסתת באופן שלילי את היכולת המיטוכונדריאלית לייצר TP מפחיתה את הרמות התאיות של TP ואת הכדאיות של תאים צינוריים פרוקסימליים כלייתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו של הטכניקות הקיימות שלנו, כגון קווי תאים, הוא שתרביות ראשוניות של תאים צינוריים פרוקסימליים כלייתיים שומרות על תפקודי ההתמיינות וחמצנו אותי של פרוקסימלי כלייתי. מכיוון שחלבון קינאז יכול לשמש כמטרות וכסוכנים טיפוליים פוטנציאליים, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול, מניעת פגיעה בכליות או האצת התאוששות הכליות לאחר פציעה.

שיטה זו יכולה להבין את המנגנון, הפציעה וההתאוששות. ניתן ליישם אותו גם על כליות ארנב מבודדות טריות ברצף עם 50 מיליליטר. כל אחד מ-D-M-E-M-F 12 סטרילי בינוני פוספט חוצץ מלח, pH 7.4 ותמיסת תחמוצת ברזל PBS לקצירת קליפת המוח של כל כליה.

ראשית הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגנייזר של 15 מיליליטר. ואז העבירו את ההומוגנט דרך שתי מסננות רשת סטריליות לכוס סטרילית של ליטר אחד. שוטפים את התאים שנותרו על המסננות עם מאגר המכיל דפרוקסמין.

העבירו את כל הרקמה שנותרה בתחתית. מסננים 85 מיקרון ל-40 מיליליטר של דפרוקסאמין המכיל חיץ המונח בצינור צנטריפוגה חרוטי. מערבבים בעדינות את מתלה התא עם המגנט החזק.

לכוד את הגלומרולי המלא בברזל ושאף את הברזל המחובר למגנט. התאם את נפח תרחיף התאים ל -40 מיליליטר והוסף מיליליטר אחד של מדיום עיכול המכיל קולגנאז. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 17 דקות.

ערבוב עדין של המתלים. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב 50 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר מספר כביסות. Resus משהה את כדור התא ב-46 מיליליטר של מדיום שאינו מכיל זרעי גלוקוז.

מחשבי ה-RT העיקריים בצפיפות של מיליגרם אחד חלבון לתרבית צלחת בשני מיליליטר של מדיום D-M-E-M-F 12 ללא גלוקוז על שייקר אורביטלי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר חידוש המדיה המשיכו להדביק תאי RPT קונפלואנטים עם אדנו-וירוס הנושא CD NA עבור חלבון קינאז פעיל מבחינה מכוננת, C אפסילון או חלבון שלילי דומיננטי קינאז C אפסילון לדגור למשך 24 שעות, לחדש את המדיה ולתרבית את ה-RPCs הראשוניים שהועברו למשך 24 שעות נוספות. כדי לדמיין את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של התא החד-שכבתי הראשוני לחדש את המדיה, הוסף גשש MIT אדום חמש 80 והחזיר את הכלים לחממה למשך 30 דקות.

לאחר מכן בחן את החד-שכבות החיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות טבילה במים. מטרה שנייה. כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה, הערך את הנשימה במצב שלוש של תרחיף RPTC בתא צריכת חמצן המצויד באלקטרודה מסוג קלארק.

מדד ראשון מציין נשימה שתיים בהיעדר DP. לאחר מכן הוסף DP לריכוז סופי של 0.4 מילימולר. ליזום נשימה במצב שלוש לנשימה במצב ארבע. הוסף אוליגו מיצין לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר.

כלול גם מדידה לנשימה לא מצומדת על ידי הוספת 0.5 מיקרו-מולרי FCCP לתאים הנושמים במצב שלוש. מוסיפים לאט לאט 20 מיקרוליטר של 0.5 מילי-מולרי JC תמיסה אחת לכל צלחת תרבית RPTC ומערבבים כדי לערבב היטב את הצבע. מחזירים את הכלים לחממה למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הניחו את התרביות על קרח ובצעו שתי שטיפות PBS קרות כקרח. ואז קצרו את התאים. העבירו תאי RPT לצינור איינור ופרקו את החד-שכבות לתרחיף תא בודד על ידי פיפטינג.

נתח את הקרינה על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות עירור על ידי לייזר יונים ארגון 488 ננומטר. לאחר מכן חשב את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית המבודדת מיטוכונדריה. להקל על הערכת תקינות שרשרת הנשימה.

לאחר שתי שטיפות של חד-שכבות RPTC עם מאגר PBS קר כקרח, קצרו את התאים והגלולה על ידי צנטריפוגה. שטפו את הגלולה פעם אחת במיליליטר אחד של מאגר A ואז הומוגניזציה של התאים בהומוגנייזר של פוך עד שרוב התאים בהומוגנאט נשברים כאשר נבדקים במיקרוסקופ. לאחר מכן, הסר את הפסולת הסלולרית על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה.

גלולה את המיטוכונדריה הגולמית מהסופרנטנט ב-15,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ובצע שלוש שטיפות של המיטוכונדריה הגלולה במאגר c, השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה והקפיא בחנקן נוזלי כדי לבחון את פעילות NADH ubiquinone oxid reductase. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה עם תוספות והמיטוכונדריה כוללת גם דגימה ריקה שיש בה את כל התוספות אך ללא מיטוכונדריה. מאזנים את הצלחת בחום של 30 מעלות צלזיוס בערבוב למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הניחו את הצלחת במפרט והוסיפו 10 מיקרוליטר של 3.25 מילי-מולרי יוביקינון כדי להתחיל את התגובה בכל אחד מהם. ובכן רשום את הספיגה ב-340 ננומטר למשך שלוש דקות במרווחים של 22. בבדיקה דומה, מדוד את הפעילות של ציטוכרום C אוקסידאז באמצעות ציטוכרום C מופחת כמצע לתגובת סינתאז A TP.

הכן תערובות לבדיקת פעילות ה-APA הכוללת ופעילות ה-APA הלא רגישים של אוליגו מיצין של כל קבוצת טיפול. דגרו את הדגימות בתערובת תגובה בטמפרטורה של 31 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. התחל את התגובה על ידי הוספת מצע TP ודגירה בטמפרטורה של 31 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

העבירו 200 מיקרוליטר מתערובת הדגירה לצינור המכיל 50 מיקרוליטר של שלוש TCA טוחנות, זרזו את החלבונים על קרח למשך 10 דקות. ואז גלולה על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן טען צלחת של 96 בארות עם 50 מיקרוליטר מכל תקן פוספט ו-50 מיקרוליטר מכל דגימה סופרנטנט בשכפול.

לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר של מגיב סאמנר לכל באר דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן רשום את הספיגה ב-595 ננומטר. שטפו את חד-שכבות ה-RPTC פעמיים עם מאגר PBS קר כקרח.

קצרו את התאים במיליליטר PBS אחד והעבירו את תרחיף התאים לצינור איינור. גלולה את דגימות ה-RPTC על ידי צנטריפוגה וקבעו תכולת TP בשיטת הלוציפראז של ערכת בדיקת ביולומינסנציה A TP. לניתוח כדאיות התאים בכלים של 35 מילימטר, השתמש בחמש שכבות RPTC חד-שכבתיות לשלוש קבוצות טיפול בקרה של תאים חיוביים לתאי ON OSIS חיוביים לאפופטוזיס ובקרת ללא כתמים לשתי כלים.

הוסף שני מיקרוליטר של ציספלטין 50 מילימולר לסט השני. הוסף שני מיקרוליטר של 500 מילי-מולארי טורט בוטיל הידרופרוקסיד. לאחר צביעת התאים באמצעות יודיד פרופידיום כמפורט בטקסט הנלווה, שטפו את החד-שכבות עם מאגר הכריכה.

לאחר מכן, צבעו את התאים באמצעות ANNEXIN חמש מצומדים עם ZI כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן קצרו בעדינות את התאים והשעו אותם ב-500 מיקרוליטר של מאגר קשירה. בעזרת שוטר גומי.

השתמש בפיפטה כדי לפזר את התאים לתרחיף תא בודד ולהעביר את תרחיף התא לצינורות ציטומטריה זורמים. פזרו את התאים לתרחיף תא בודד. המשך מיד לכמת את הקרינה עבור PI ו-FE על ידי זרימה ציטומטרית, אספקה אדנו-ויראלית של CD NA המצפה את המוטציות הפעילות והלא פעילות של חלבון קינאז C אפסילון מביאה לעלייה משמעותית ברמות החלבון של חלבון קינאז C אפסילון ב-RPTC ובמיטוכונדריה.

כצפוי, הצורה הפעילה מבחינה קונסטיטוציונלית של האנזים עוברת זרחן ב-RP tcs והאנזים השלילי הדומיננטי אינו זרחני. נוכחותו של חלבון פעיל קינאז C אפסילון מפחיתה את הנשימה המיטוכונדריאלית ב-RPTC ללא קשר למצע המשמש להפעלת המיטוכונדריה. אבל לחלבון הלא פעיל קינאז C אפסילון אין השפעה על הנשימה המיטוכונדריאלית.

מעניין שהפעלת חלבון קינאז C אפסילון ב-RP TCS מפחיתה את הפעילות של קומפלקסים אחד מכל ארבעה. ירידה זו בנשימת RPTC קשורה לעלייה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. למוטציה השלילית הדומיננטית אין השפעה כזו.

שינויים אלה מלווים גם בירידה בפעילות של TP סינתאז במיטוכונדריה המבודדת מ-RPTC על פני ביטוי החלבון הפעיל קינאז C אפסילון. כתוצאה מכך, תכולת A TP של RPTC יתר על ביטוי החלבון הפעיל קינאז C אפסילון מפחיתה את ההפעלה המתמשכת של חלבון קינאז. לאפסילון C יש השפעות עמוקות על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית כפי שמעיד פיצול המיטוכונדריאלי.

הפעלת חלבון קינאז C, אך לא עיכוב. מביא גם לשינויים במורפולוגיה של RPTC הגורמים להתכווצות התאים והתארכות התאים ששרדו. ההשפעות המיטוכונדריאליות הללו של ביטוי יתר של החלבון הפעיל קינאז C אפסילון ב-RPCs היו בקורלציה גם עם מוות תאים הן על ידי ONS והן על ידי אפופטוזיס.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא יתר על המידה חלבונים בתרביות ראשוניות באמצעות טכניקה אדנו-ויראלית וכיצד להעריך את היכולת המיטוכונדריאלית לסינתזת TP. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. ובחסר, אל תשכח שעבודה עם אדנו-וירוס גישה לזה, אז נקוט באמצעי זהירות כמו מתאים.