הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

ניסוי זה משתמש במודולציה סלקטיבית של איזופורמים של protein kinase C כדי לקבוע את תפקודיהם המיטוכונדריאליים והתאיים בתאי צינוריות פרוקסימליות בכליות תחת תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. ראשית, יש לבודד תאי צינוריות פרוקסימליות ראשוניים מהקליפה הכלית, או RPCs, בעלי מטבוליזם חמצוני הדומה לזה של הצינוריות הפרוקסימליות בכליות.

הדביקו את תאי ה-RPC עם וקטורים אדנו-ויראליים המבטאים צורות פעילות ולא פעילות של חלבון Protein Kinase C. לאחר מכן, בצעו בדיקה של התפקודים המיטוכונדריאליים השונים וחיוניות התאים כדי לקבוע את השפעת האנזים על יכולתה של המיטוכונדריה לסנתז ATP ולמנוע מוות תאי. כמו כן, בצעו אנליזת immuno blot של Protein Kinase C epsilon ומצורתו המפוספורלית בליזאטים תאיים שנלקחו יחד.

התוצאות מראות כי הפעלת protein kinase epsilon מווסתת באופן שלילי את היכולת המיטוכונדריאלית לייצר ATP, מפחיתה את רמות ה-ATP התאיות ואת החיוניות של תאי צינוריות פרוקסימליות בכליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות שלנו, כגון שורות תאים, הוא שתרביות ראשוניות של תאי צינוריות פרוקסימליות בכליות שומרות על התפקודים המובחנים והמטבוליזם החמצוני של הצינוריות הפרוקסימליות בכליות. מכיוון שניתן להשתמש ב-protein kinases כמטרות וכסוכנים טיפוליים פוטנציאליים, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון טיפולי, למניעת פגיעה בכליות או להאצת ההחלמה של הכליות לאחר פגיעה.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני הפגיעה וההחלמה. ניתן ליישמה גם על כליות ארנב שבודדו באופן טרי, על ידי שטיפה רצופה של 50 מיליליטר של מצע D-M-E-M-F 12 סטרילי, תמיסת PBS סטרילית ב-pH 7.4 ותמיסת PBS עם תחמוצת ברזל, על מנת לאסוף את הקורטקס של כל כליה.

ראשית, הומוגניזרו את הרקמה באמצעות הומוגנייזר של 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט דרך שני נמסקי מסננת סטריליים לתוך כוס כימיאית סטרילית בנפח של ליטר אחד. שטפו את התאים שנותרו על המסננות עם באפר המכיל deferoxamine.

העבירו כל רקמה שנותרה בתחתית הנפה בגודל 85 micron אל 40 milliliters של בופר המכיל deferoxamine, שנמצא בתוך מבחנה קונית לצנטריפוגה. ערבבו בעדינות את תגסוס התאים באמצעות המגנט החזק.

אספו את הגלומרולי הממולאים בברזל ושאבו את הברזל הנצמד למגנט. התאימו את נפח תרחיף התאים ל-40 milliliters והוסיפו מיליליטר אחד של תווך עיכול המכיל collagenase. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 17 דקות.

ערבוב עדין של התרחיף. קצירת התאים על ידי סריפוגציה ב-50 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C לאחר מספר שטיפות. השהייה מחדש של משקע התאים ב-46 milliliters של מצע ללא גלוקוז.

תרביתו את תאי ה-RT PCs הראשוניים בצפיפות של מיליגרם אחד של חלבון לכל צלחת תרבית בשני מיליליטר של מצע D-M-E-M-F 12 נטול גלוקוז, על שייקר אורביטלי ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר חידוש המצע, הדביקו תאי RPT נמהקים ב-adenovirus הנושא CD NA עבור protein kinase C epsilon פעיל באופן קבוע (constitutively active) או עבור protein kinase C epsilon דומיננטי-שלילי (dominant negative); הדגרירו למשך 24 שעות, חדשו את המצע ותרביתו את תאי ה-RPCs שעברו טרנספקציה למשך 24 שעות נוספות. כדי להדגים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של שכבת התאים הראשונית, חדשו את המצע, הוסיפו MIT tracker red 580 והחזירו את הצלחות לאינקובטור למשך 30 דקות.

לאחר מכן, בחנו את השכבות התאיות החיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות עדשת טבילה במים. שני. כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריאלי, העריכו את נשימת מצב 3 של תרחיף ה-RPTC בתא מדידת צריכת חמצן המצויד באלקטרודה מסוג Clark.

ראשית, מדוד נשימה במצב 2 (state two respiration) בהיעדרו של פוספט דאורגני (DP). לאחר מכן, הוסף DP לריכוז סופי של 0.4 millimolar. כדי להתחיל נשימה במצב 3 (state three respiration) עבור נשימה במצב 4 (state four respiration), הוסף oligomycin לריכוז סופי של 0.5 µg/mL.

כלול גם מדידה של נשימה לא מצומדת על ידי הוספת 0.5 micromolar FCCP לתאים הנשמים במצב שלושה. הוסף לאט 20 microliters של תמיסת JC one בריכוז 0.5 millimolar לכל צלחת תרבית של RPTC וסובב כדי לערבב את הצבע ביסודיות. החזר את הצלחות לאינקובטור למשך 30 דקות.

בשלב הבא, הניחו את התרביות על קרח ובצעו שתי שטיפות ב-PBS קר מאוד. לאחר מכן, קצרו את התאים. העבירו את תאי ה-RPT לשפופרת אפנדורף ופרקו את השכבות החד-שכבתיות (monolayers) לתליה של תאים בודדים באמצעות פיפוט.

נתחו את הפלואורסצנציה באמצעות ציטומטריית זרימה תוך שימוש בעירור על ידי לייזר ארגון יונים של 488 nanometer. לאחר מכן, חשבו את הפוטנציאל של ממברנת המיטוכונדריה במיטוכונדריה מבודדות. הדבר יסייע בהערכת התקינות של שרשרת הנשימה.

לאחר שני שטיפות של מונושכבות RPTC עם באפר PBS קר מאוד, קצרו את התאים והשקיעו אותם באמצעות סנטריפוגה. שטפו את המשק 한 פעם ב-1 mL של באפר A, ולאחר מכן הומוגניזרו את התאים בהומוגנייזר Down עד שמרבית התאים בתמיסת ההומוגנאט יהיו מפוצצים בבדיקה תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, הסירו את השאריות התאיות באמצעות סנטריפוגה במהירות נמוכה.

שקע את המיטוכונדריה הגולמית מהנוזל העליון ב-15,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C ובצע שלושה שטיפות של המיטוכונדריה השקועה בבופר c. השהה מחדש את משקע המיטוכונדריה ב-50 עד 100 µL של בופר הבדיקה והקפא בחנקן נוזלי כדי לבדוק את פעילות ה-NADH ubiquinone oxidoreductase. הוסף 500 µL של בופר הבדיקה עם התוספות והמיטוכונדריה; כלול גם דגימת ביקורת (blank) המכילה את כל התוספות אך ללא מיטוכונדריה. ה सकते את הפלטה ב-30°C תוך ערבוב למשך חמש דקות.

בשלב הבא, הכניסו את הפלטה לספקטרופוטומטר והוסיפו 10 µL של ubiquinone בריכוז 3.25 mM כדי להתחיל את התגובה בכל באר. רשמו את הבליעה ב-340 nm במשך שלוש דקות במרווחי זמן של 22 שניות. בבדיקה דומה, מדדו את הפעילות של cytochrome C oxidase תוך שימוש ב-cytochrome C רדוקציוני כמצע עבור תגובת ה-ATP synthase.

הכינו תערובות לבדיקת הפעילות הכוללת של APAs ופעילות APAs שאינה רגישה ל-oligo mycin עבור כל קבוצת טיפול. דגרו את הדגימות בתערובת התגובה בטמפרטורה של 31 °C למשך 10 דקות. התחילו את התגובה על ידי הוספת מצע TP ודגרו בטמפרטורה של 31 °C למשך חמש דקות.

העבירו 200 µL מתערובת האינקובציה למבחנה המכילה 50 µL של TCA בריכוז 3 M, והשקיעו את החלבונים על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, השקיעו את המשקע באמצעות סרכזה. בשלב הבא, טענו לתוך פלטה של 96 בארות 50 µL מכל סטנדרט פוספט ו-50 µL מכל עליית נוזל (supernatant) של הדגימות, בשכפולים.

לאחר מכן, הוסף 250 µL של ריאגנט Sumner לכל באער והדגר בטמפרטורה של 30 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, רשום את הבליעה באורך גל של 595 nm. שטוף את שכבות המונו-לייר של RPTC פעמיים בבופר PBS קר מאוד.

קצרו את התאים ב-1 mL של PBS והעבירו את תרחיף התאים לשפופרת אפנדור. השקיעו את דגימות ה-RPTC באמצעות צנטריפוגה וקבעו את תוכן ה-ATP באמצעות שיטת הלוסיפראז של ערכה לבדיקת ביולומינצנציית ATP. לצורך ניתוח חיוניות תאים בצלחות של 35 mm, השתמשו בחמש שכבות מונולייר של RPTC עבור שלוש קבוצות טיפול ביקורת של תאים חיוביים לאונוסיס, תאים חיוביים לאפופטוזיס, ובקרת ללא צביעה עבור שתי צלחות.

הוסיפו שני µL של cisplatin בריכוז 50 mM לסדרה השנייה. הוסיפו שני µL של tert butyl hydroperoxide בריכוז 500 mM. לאחר צביעת התאים באמצעות propidium iodide כפי שפורט בטקסט הנלווה, שטפו את השכבות החד-שכבתיות (monolayers) באמצעות תמיסת הקישור (binding buffer).

לאחר מכן, צבע את התאים באמצעות ANNEXIN 5 המשורשב ל-ZI כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, קצור בעדינות את התאים והשעה אותם ב-500 µL של חוצץ קישור (binding buffer), באמצעות rubber policeman.

השתמש בפפיטה כדי לפזר את התאים לתמיסות של תאים בודדים והעבר את תמיסת התאים למבחנות ציטומטריה עם זרימה. פזר את התאים לתמיסות של תאים בודדים. המשך מיד לכימות הפלואורסצנציה עבור PI ו-FE באמצעות ציטומטריה עם זרימה. העברה אדנו-ויראלית של CD NA המצפה את המוטנטים הפעילים באופן קבוע (CONSTITUENTLY active) והבלתי פעילים של protein kinase C epsilon מובילה לעלייה משמעותית ברמות החלבון של protein kinase C epsilon ב-RPTC ובמיטוכונדריה.

כפי שצפוי, הצורה הפעילה באופן קונסטיטוטיבי של האנזים היא מפוספורת ב-RP tcs, והאנזים הדומיננטי-שלילי אינו מפוספור. נוכחותו של protein kinase C epsilon פעיל מפחיתה את הנשמה המיטוכונדריאלית ב-RPTC ללא קשר לסובסטרט המשמש להאנרגיה של המיטוכונדריה. עם זאת, ל-protein kinase C epsilon לא פעיל אין השפעה על הנשמה מיטוכונדריאלית.

באופן מעניין, הפעלת protein kinase C epsilon ב-RP TCS מפחיתה את הפעילות של קומפלקס 1 ב-4. ירידה זו בנשימת RPTC קשורה לעלייה בפוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה. למוטנט הדומיננטי-שלילי אין השפעה כזו.

שינויים אלה מלווים גם בירידה בפעילות של TP synthase במיטוכונדריה שבודדו מ-RPTC המבטאים ביתר על Protein kinase C epsilon פעיל. כתוצאה מכך, תכולת ה-ATP של RPTC המבטאים ביתר על Protein kinase C epsilon פעיל פוחתת. הפעלה ממושכת של Protein kinase C epsilon גורמת להשפעות עמוקות על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית, כפי שבא לידי ביטוי בפרגמנטציה מיטוכונדריאלית.

הפעלה של Protein kinase C, אך לא עיכוב שלו, גורמת גם לשינויים במורפולוגיה של RPTC, המובילים להתכווצות תאים ולהארכה של תאים ששרדו. השפעות מיטוכונדריאליות אלו של ביטוי יתר של Protein kinase C epsilon הפעיל ב-RPCs נמצאו במתאם גם עם מוות תאי על ידי oncosis ואפופטוזיס.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע ביטוי יתר של חלבונים בתרביות ראשוניות באמצעות טכניקה אדנו-ויראלית, וכיצד להעריך את הקיבולת המיטוכונדריאלית עבור סינתזת TP. ברגע שהטכניקה תישלט, ניתן לבצעה בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. ובצורה יעילה, אל תשכחו שעבודה עם אדנו-וירוס דורשת זהירות, לכן נקטו באמצעי זהירות מתאימים.