בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיטוכונדריה נושמת מתאים מתורבתים או רקמת עכבר, ולאחר מכן להעריך את חוזק פוטנציאל הממברנה שלהם כמדד למצב התאי. עבור תאים מתורבתים, זה מושג על ידי ציפוי תחילה ולאחר מכן טיפול בתאים. לאחר מכן, התאים עוברים הומוגניזציה וההומוגנט מועבר דרך מחט כדי לשחרר עוד יותר את המיטוכונדריה מהתאים.

עבור רקמת עכבר, הכבד נכרת מהעכבר ולאחר מכן הומוגני על קרח עם שני סוגי חומר המוצא. לאחר מכן משתמשים בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את המיטוכונדריה משאר התוכן התאי. לאחר שהמיטוכונדריה עוברת עיבוד מסוים, כולל הוספת צבע פלואורסצנטי רגיש לפוטנציאל הממברנה, מבוצעות מדידות פלואורסצנטיות TMRE כדי לחשב את חוזק פוטנציאל הממברנה.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את תפקוד המיטוכונדריה והפרעות בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש לפוטנציאל הממברנה בשילוב עם קורא צלחות פלואורסצנטי כאשר מטפלים במיטוכונדריה נפוצה על מצמדים ומעכבים, למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ותפקוד לקוי של מיטוכונדריה LS.It ניתן ליישם גם על כל מערכת אחרת שבה השוואה בין שתי דגימות שונות או יותר של מבוקש כגון בריא לעומת מחלה או שני מינים שונים של בעל חיים עם קצב חילוף חומרים שונה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון שקשה ללמוד את שלבי בידוד המיטוכונדריה.

הסיבה לכך היא שיש הרבה ניואנסים בעת ביצוע הטכניקה שניתן להתעלם מהם בקטעי השיטה המסורתית. התחל הליך זה עם גידול תאי כליה עובריים אנושיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט 48 שעות לפני צלחת הטיפול בציטוקינים, 160,000 תאים לבקבוק T 1 75 כדי להניב צפיפות של כ-70% בזמן הטיפול. לאחר מכן הסרום מרעיב את התאים 24 שעות לאחר מכן על ידי שאיבת המדיה והחלפתה באותה נפח של מדיה ללא סרום.

לבסוף, טפל בתאים הרעבים בסרום על ידי הוספת ציטוקינים מסיסים ישירות למצע תרבית התאים כדי לבצע בידוד של מיטוכונדריה. ראשית יש לשאוב את המדיה ולשטוף את תאי ההדבקה פעמיים עם 15 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט אחת או PBS. בכל פעם לאחר הכביסה, שאפו את המאגר וגרדו את הבקבוק כדי להסיר את התאים הדבקים מהתחתית.

לאחר מכן הוסף 15 מיליליטר של XPBS אחד לכל בקבוק, סובב והעביר לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר על קרח. לאחר סיום הגירוד, צנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות ב-700 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס, באמצעות צנטריפוגה שולחנית עם רוטור דלי מתנדנד לאחר צנטריפוגה, שואבים סופרנטנטים והחייאה. השעו כל כדור במיליליטר אחד של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי.

לאחר מכן, שלב את שני המתלים והעביר לכלי זכוכית קטן להומוגניזציה במיטוכונדריה המושעה ומאגר בידוד מיטוכונדריאלי לכלי הזכוכית עד שהתמיסה מגיעה לקו הראשון כשהעלי מחובר למקדחה, המשך להומוגניזציה של התאים על הקרח במהירות בינונית למשך שלושה מעברים. יש להקפיד על הסרת בועות אוויר בעת הכנסת העלי לתמיסה, לא להסיר את העלי מעל הנוזל ולהשתמש במהירות קבועה עם מעברים רציפים. העבירו את התמיסה ההומוגנית לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן משוך את התמיסה למזרק של שלושה מיליליטר באמצעות מחט בגודל 18, אחת בחצי אינץ' והוציא אותה בחזרה לצינור החרוטי על הקרח בעזרת מחט בגודל 27 בגודל חצי אינץ'. הקפד להוציא את התמיסה כנגד הדופן הפנימית של הצינור כדי לנצל את הכוח הזה לשיבוש קרום התא. חזור על שלבי המזרק בסך הכל חמש פעמים, ולאחר מכן העביר את התמיסה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-600 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית באמצעות רוטור דלי מתנדנד.

המיטוכונדריה נמצאים בסופרנטנט לאחר הסיבוב הראשון במהירות נמוכה, בעוד שחלק מהממברנות והתאים הבלתי שבורים מגולגלים, מסירים בזהירות את הסופרנטנט ומחלקים בין שלושה צינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את שלושת הצינורות ברוטור זווית קבועה ב -10, 000 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מיטוכונדריה מתאים מתורבתים נראים בצבע לבנבן.

הוציאו את הכבד מכל בעל חיים והניחו קר כקרח, XPBS אחד ללא סידן או מגנזיום כדי לשטוף את כל הדם. מעבירים את רקמת הכבד לכלי מרוחק על קרח וקוצצים אותה לחתיכות דקות בעזרת סכין גילוח טרי למשך דקה. לאחר מכן, הוסיפו רקמה ואת המאגר המתאים לכלי עד שהמאגר יגיע לקו הראשון.

המשך להומוגניזציה של הרקמה על הקרח עם העלי ביד למשך חמישה מעברים. יש להקפיד על הסרת בועות אוויר בעת הכנסת העלי לתמיסה, לא להסיר את העלי מעל הנוזל ולהשתמש במהירות קבועה עם מעברים רציפים. המשך לעבד את הדגימות עם צנטריפוגה והומוגניזציה כפי שמתבקש בפרוטוקול הטקסט.

לאחר שילוב הסופרנטנטים החדשים עם הסופרנטנט הראשון מכל דגימה, צנטריפוגה את הצינורות ברוטור בזווית קבועה ב-10,000 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שאפו בזהירות את השכבה הרכה הלבנה העליונה בעזרת קצה פיפטה או דחפו אותה לצידי הצינור. לאחר מכן שפכו בעדינות את שאר הסופרנטנט וההחייאה.

השעו את כדורי המיטוכונדריה בכבד ב-500 מיקרוליטר של בידוד מיטוכונדריאלי. מיטוכונדריה חוצץ מהכבד הם חומים. הנח במהירות את הדגימות על קרח מיד לפני הגדרת התגובות.

מדללים את המיטוכונדריה ל -0.5 מיליגרם למיליליטר. ריכוז עבודה עם מאגר ניסיוני. הוסף טיפולים מתאימים כמפורט בפרוטוקול הטקסט כדי להפריד צינורות בעשירית אחת, הנפח הכולל של המיטוכונדריה המדוללת.

לאחר מכן, הכניסו את המיטוכונדריה המדוללת לכל צינור תגובה וערבבו בעדינות כל שפופרת כדי להבטיח ערבוב נכון. דגרו את התגובות על הספסל למשך שבע דקות. לאחר מכן הוסף נפח שווה של שני טטרה-אתיל מיקרו-מולרי, מוט דומין, אתיל אסטר, קיצור TMRE לנפח התגובה המיטוכונדריאלית.

שוב, מערבבים בעדינות כל צינור כדי להבטיח ערבוב נכון. לאחר דגירה של התגובות על הספסל למשך שבע דקות נוספות, גלול את המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה ברוטור זווית קבועה ב-10,000 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן טען מחצית מנפח ה-supernatant של כל דגימה על 3 84.

ובכן, צלחת המשיכו לקרוא את הקרינה של הדגימות ולאחר מכן חישבו את הפרש הקיפול בקרינה בין ביקורת לכל טיפול כמתואר בפרוטוקול הטקסט: טיפול בתאי HEK 2 93 T עם TNF, אלפא, IL, בטא אחד ו-IFN גמא במשך 24 עד 48 שעות מוביל לכמויות מתקדמות של מוות תאי. כדאיות התאים הוערכה באמצעות מבחני MTT המדגימים באופן עקבי כי יש ירידה של כ-10% בכדאיות התאים עם טיפול של 24 שעות וירידה של כ-20%. עם טיפול של 48 שעות, תאים שטופלו בריכוזים דומים מניבים תוצאות דומות של מוות תאים תוך 48 שעות.

וטיפול בציטוקינים בודדים מגלה כי הירידה בכדאיות נובעת מהשפעות קומבינטוריות. נתוני הכדאיות מייצגים את סטיית התקן הממוצעת של שלושה ניסויים נפרדים. כל ריצה משולשת וההידוק של פסי השגיאה מדגימים את יכולת השחזור של הנתונים.

אחוז הירידה בפוטנציאל הממברנה במיטוכונדריה שבודדה מתאים שטופלו בציטוקינים מצביע על כך שבריאות המיטוכונדריה הושפעה מטיפולי ציטוקינים, מה שמאשש את נתוני הכדאיות לאחר הליך זה. ניתן ליצור שיטות אחרות כמו הערכת סך ייצור TP, TP או צריכת חמצן על מנת להעריך שאלות נוספות כמו אילו הבדלי אנרגיה ונשימה בין הדגימות השונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיטוכונדריה תפקודית שלמה ולהעריך את חוזק פוטנציאל הממברנה שלהם כהשתקפות של המצב התאי.