Name: בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: למדו לבודד מיטוכונדריות מתאים בתרבית ומכבד עכבר באמצעות הומוגניזציה וסחיפה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת הערכת פוטנציאל ממברנה באמצעות צבע TMRE לחקר תפקוד מיטוכונדרי ובריאות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק NSF CHE-1229562 (VDGM), המשרד למחקר לתואר ראשון באוניברסיטת אילון, המחלקה לכימיה ע"ש אילון, ופרס אילון לומן (TL ו-TAD), תוכנית העמיתים של מכללת אילון (JAC) ותוכנית המצטיינים של מכללת אילון (TAD).

<ol><li>Madeira, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of mitochondrial bioenergetics.</a> Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).</li>
<li>Sakamuru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+homogenous+membrane+potential+assay+to+assess+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function.</a> Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).</li>
<li>Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial genome.</a> Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).</li>
<li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+import+system+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein import system of mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).</li>
<li>Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import%3A+reversible+binding+of+the+presequence+at+the+trans+side+of+the+outer+membrane+drives+partial+translocation+and+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding.</a> Cell. 80, 127-137 (1995).</li>
<li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+mitochondrial+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of mitochondrial cell death.</a> Science. 305, 626-629 (2004).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+In+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).</li>
<li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404(2009).</li>
<li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).</li>
<li>Wu, C. C., Bratton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+intrinsic+apoptosis+pathway+by+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).</li>
<li>Kuwana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Joshi, D. C., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+in+live+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons.</a> Journal Of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+I%2C+background+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods.</a> Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+II%2C+results+and+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion.</a> Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).</li>
<li>Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intact+mitochondria+from+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain.</a> Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).</li>
<li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy%3A+targeting+the+mitochondrial+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway.</a> Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+requires+BCL2+to+sequester+prodeath+BIM%2C+explaining+sensitivity+to+BCL2+antagonist+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li>
<li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences+%3A+An+Official+Journal+Of+The+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li>
<li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+optical+oxygen+sensing%3A+protocols+and+critical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+An+International+Journal+On+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li>
<li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death & Disease. 4, e493(2013).</li>
<li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity%3A+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li>
<li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture%3A+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li>
<li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li>
<li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טיפול בתאי HEK-293T עם ציטוקינים רקומביננטי גורם כמויות מתונות של מוות של תאים מעל 48 שעות (איור 1). כמות המוות של תאים הנגרם על ידי טיפול TNF-alpha דומה למחקרים שדווחו בעבר 30 וכדאיויות תא פוחתות לאחר שיתוף ממשל של ציטוקינים מרובים כי הם יותר מ כמויות מסכמות עם כל ציטוקינים לבד היא גם עולה בקנה אחד עם הספרות 31,32. היכולת להתאים את הכמויות וסוגים של טיפולי ציטוקינים כמו גם השוואה של קוקטיילים לציטוקינים פרט הופכת את מודל תרבית תאים זה אטרקטי...

תאי חיים אנרגית בנק חילוף חומרים בצורה של שומנים ופחמימות ולהשתמש באנרגיה זו לביוסינתזה, תחבורת קרום ותנועה. אנרגיה מסוימת מתקבלת בcytosol באמצעות ההמרה של סוכרים תזונתיים ישירות לתוך ATP בגליקוליזה. עם זאת, המקור העיקרי לייצור ATP בתא הוא רתם בתוך המיטוכונדריה באמצעות שרשרת הנשימה במיטוכונדריה 1. הארכיטקטורה של המיטוכונדריה מספקת התמצאות במרחב הדרושה לייצור ATP אפקטיבי ויעיל. המיטוכונדריה יש קרום כפול מופרד על ידי שטח intermembrane ויחד עם המטריצה, תא המיטוכונדריה הפנימי ביותר, בית הרכיבים ולתאם את התגובות כימיות מעורבות בדור ATP. הקרום הפנימי מכיל סדרה של קומפלקסי חלבוני קרום נכנסים המרכיבים את שרשרת הנשימה, כמו גם את synthase ATP, החלבון מורכב שמביא ADP וPi יחד ליצירת ATP. הפונדקקרום אה מקופל לתוך cristae ואלקטרונים מועברים לאורך מתחמי שרשרת הנשימה דרך ציטוכרום C, מוביל אלקטרון מסיס הנע בין מתחמים במרחב intermembrane. כאלקטרונים לנוע, חמצון שווה הפחתה מתרחש ויוני המימן נשאבים מהמטריצה ​​למרחב intermembrane. כתוצאה מריכוז היון הגבוה בתוך החלל intermembrane, שיפוע אלקטרוכימיים בונה וכתוצאה מכך פוטנציאל קרום על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה (Δψ) 2. החמצן הוא מקבל אלקטרונים הסופיים של שרשרת הובלת אלקטרונים, ויונים מימן לזרום דרך synthases ATP ממרחב intermembrane חזרה למטריצה, ובכך לגרום להיווצרות ATP ישירות. תהליך זה כפי שתואר בשלמותו ידוע כזרחון חמצוני. קפלי cristae להגדיל את שטח הפנים של הקרום הפנימי, המאפשרים לתחבורה מקסימלי אלקטרון וייצור ATP בכל mitochondrion. החלבונים, האנזימים ומולקולות אחרות שהיו מעורבות בזרחון חמצוני נגזרים משני הגנים גרעיניים והמיטוכונדריה. המיטוכונדריה מכילה DNA המעגלי, הקידוד שלהם במשך 13 חלבונים כמו גם tRNAs וmRNAs ההכרחי לייצור ATP 3. עם זאת, רבים יותר חלבונים נדרשים ולכן הם מקודדים גרעיניים. רוב החלבונים המקודדים גרעיניים אלה ממוקדים למטריצת המיטוכונדריה על ידי השימוש בpresequences בN-הסופי של החלבון המבשר, והיבוא שלהם הוא מונע בחלקו על ידי Δψ 4,5. מעבר לתרומה ליו-האנרגיה של תא, מיטוכונדריה גם להשפיע על תהליכי חילוף חומרים גדולים כמו TCA ובטא-חמצון, איתות תאית באמצעות סידן ויסות, כמו גם תפקיד מרכזי באפופטוזיס 6. באופן ספציפי, בזמנים של לחץ סלולארי, חלבוני Bcl-2 משפחה שמתגוררים באו אינטראקציה בקרום החיצוני של המיטוכונדריה יכול לגרום המיטוכונדריה7,8 חדירות קרום חיצוניות (MOMP). במהלך MOMP, ג ציטוכרום וחלבונים אחרים משתחררים לcytosol, ויחד עם כמה חלבוני cytosolic צורה מורכבת הנקרא apoptosome 9,10. Apoptosome מפעיל caspases שילך על לדבוק חלבונים ו- DNA של תאים בשלב הביצוע של אפופטוזיס. ברגע שMOMP מתרחש, ΔΨ הוא התמוטט וייצור ATP נעצר. פונקציה של המיטוכונדריה כך, כאפופטוזיס הוא יזם נפגעת ושינויים בΔΨ יכולים להיות מתואמים להמיטוכונדריה ותא בריאות 12. בעוד אפופטוזיס הוא נקודת סיום במודלים של מחלות רבות, מיטוכונדריה והשינויים ΔΨ גם יכול להניב מידע רב ערך על מקור מחלה ו / או התקדמות. לדוגמא, שינויים מבניים ותפקודיים של המיטוכונדריה תועדו במהלך מחלות ניווניות 13,14. בחלקו הראשון של הפרוטוקול, isolation של המיטוכונדריה שלמה ששומרת ΔΨ מתואר. תאי HEK-293T נחשפו לריכוזים ושילובים של TNF-α רקומביננטי, IL1-β וIFN-γ שונים כדי לגרום לאפופטוזיס. ציטוקינים אלה נבחרו כי הם דיווחו להיות גבוהים בדגימות אנושיות עיקריות ספיגה 15 ומסלול החיצוני של אפופטוזיס יכול להיות מופעל על ידי אינטראקציה של TNF-α מחייב לקולטן שלו 6 בתדירות גבוהה. מאחר שיש וריאציות עדינות צורך לבודד המיטוכונדריה תפקודית מרקמות עיקריות בהשוואה לתאים בתרבית, וכי מחקרים רבים מנצל בעלי חיים, הפרוטוקול גם מתאר כיצד לבודד המיטוכונדריה מכבד וחוט שדרה של קדמי טרשת לרוחב מודל עכבר (ALS). החלק השני של הפרוטוקול פותח כדי לפקח הפרעות לפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה באמצעות צבע ניאון פוטנציאל רגיש עם קורא צלחת ניאון. הבדלים בין מעמד הסלולרי (כלומר, בריא לעומת בריא) נבדל בquantitating הכוח של ΔΨ של מיטוכונדריה המבודדת בשיתוף עם סוכני תרה, מעכבי שרשרת נשימה, מעכבים ויונופורים מורכבים, אשר כולם לגרום לפיזור של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. המיטוכונדריה בריאה, גדול יותר את השינוי בΔΨ על טיפול במעכבי המיטוכונדריה, ולכן התגובה של המיטוכונדריה יכולה לשמש כמדד לתפקוד המיטוכונדריה (פרע). שימוש במיטוכונדריה המבודדת ולא בהערכה באתרו של פונקציה מציעה ראיות מוחלטות שפתולוגיה או טיפול ישירות מודולציה שינויים אברון 16-18. אמנם יש שיטות בספרות לבודד את המיטוכונדריה מהתאים בתרבית, הם מעורפלים 17 ו / או להשתמש בציוד מיוחד 16. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את שיטת הבידוד ובקלות להתאמה לשורות תאים אחרות, כוללים ברקמה ותרבויות 13,14,19,20 עיקריות. מחקרי מיטוכונדריה מבודדים רבים לנצל את אותו uncouplers המיטוכונדריה ומעכבי שימוש בפרוטוקול זה, אבל עם אלקטרודה קלארק (21 היא דוגמא מייצגת של מאמרים רבים בספרות), ששוב היא פיסת הציוד מאוד ספציפית ומיוחדת. יתר על כן, לשיטה מסורתית זו יש מגבלות כגון תפוקה נמוכה וגבוהות מורכבות 22,23 ודורשת כמות משמעותית של המיטוכונדריה (~ 500 מיקרוגרם / תגובה). בפרוטוקול זה, TMRE הבדיקה ניאון חישת הקרום הפוטנציאלי להשתמש בשילוב עם קורא צלחת ניאון, שהוא מכונה סטנדרטי במעבדות רבות. TMRE נחשב מאז שהוא נכנס במהירות תאים ומיטוכונדריה מבודדת וניתן להשתמש בם בריכוזים נמוכים 24. יכולות להיות מוגדרות במהירות תגובות מרובות במקביל ויצוו נותחו באמצעות פרוטוקול זה. יתר על כן, התגובהs דורשת הרבה כמות קטנה של מיטוכונדריה המבודדת (~ 10 מיקרוגרם / תגובה). על ידי הדורשים פחות חומר, יכולות להיות מנוצלת דגימות רקמה או תרבית תאים קטנות יותר כנקודה מוצא לבידוד המיטוכונדריה, ניתן להגדיר יותר חזרות או תגובות למעלה, ובאופן פוטנציאלי מספיק חומר לניסויי מיטוכונדריה מבודדים אחרים, כגון ייצור ATP, צריכת חמצן, או יבוא מבחני אפשריים.

<table><tbody><tr><td>חומצה L-גלוטמית</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td>ניתן להשתמש במלח האשלגן במקום.</td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>Sigma</td><td>M8304</td><td>יכול להשתמש במלח האשלגן במקום.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>יש לדלל ל-100&nbsp; &#956; M כמלאי עבודה באתנול ואחסון ב-20&nbsp; &#176;ג.</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>מיוצר ב-DMSO ומשמש כ-5&nbsp; &#956; מלאי עבודה M. יש לאחסן ב-20&nbsp; &#176;ג.</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mallinckrodt</td><td>6379</td><td>הכינו מלאי מרוכז באתנול ולאחר מכן דללו במים&nbsp;</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא</td><td>R8875</td><td>רעיל מאוד. מיוצר באתנול.</td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>סיגמא</td><td>O4876</td><td>רעיל מאוד. מיוצר באתנול.</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25 מ"ג</td><td>מדלל 100&nbsp; &#956; מלאי M עם EB מיידי לפני השימוש.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1x רגיל (גלוקוז גבוה).</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>פישר</td><td>SH3002101</td><td>חנות ב-20&nbsp; &#176; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td>ממוצא ארה"ב, איכות פרימיום. מחממים מבטלים ומאחסנים את המינון ב-20&nbsp; &#176;ג.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Protien Assay Dye (5x)</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>כל בדיקת חלבון יכולה להחליף.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>הכינו מלאי של 2 מ"ג/מ"ל במים לבדיקת חלבון.</td></tr><tr><td>אבקת MTT</td><td>Sigma</td><td>M2128</td><td>מסנן לעקר 5 מ"ג/מ"ל מלאי תוצרת PBS. אחסן את הכמות ב -20&nbsp; &#176; C; אחסן ב-4&nbsp; &#176; C עד שבוע.</td></tr><tr><td>תמיסת טרגיטול (NP-40)</td><td>Sigma</td><td>NP40S רקומביננטי</td><td></td></tr><tr><td>אנושי IL-1B</td><td>Gibco</td><td>PCH08014</td><td>לאחר פתיחת החנות ב-20&nbsp; &#176; C</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TNF-אלפא</td><td>Gibco</td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IFN-gamma</td><td>Gibco</td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (-/-)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>ודא שהוא ללא יוני Mg2+ ו-Ca2+.</td></tr><tr><td>ציטוכרום c ערכת ELISA</td><td>R& מערכות D</td><td>DTC0</td><td>Human עבור תאי HEK-293T.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

השוואה בין שתי קבוצות נפרדות או יותר, כגון בריא לעומת מחלה, נחוצה כדי לקבוע את המצב התאי. המיטוכונדריה נמצאים בצומת של בריאות התא בשל תפקידם הן בחילוף החומרים של התאים והן בייצור אנרגיה, כמו גם בשליטה על אפופטוזיס. לכן, הערכה ישירה של מיטוכונדריה מבודדת והפרעה מיטוכונדריאלית מציעה את היכולת לקבוע אם מתרחש תפקוד ספציפי לאברונים. השיטות המתוארות בפרוטוקול זה כוללות בידוד של מיטוכונדריה שלמה ומתפקדת מתאים מתורבתים של HEK וכבד וחוט שדרה של עכבר, אך ניתן להתאים אותן בקלות לשימוש עם תאים מתורבתים אחרים או רקמות של בעלי חיים. תפקוד המיטוכונדריה המוערך על ידי TMRE והשימוש במפרקים ומעכבים מיטוכונדריאלים נפוצים בשילוב עם קורא לוחות פלואורסצנטיים מאפשרים לפרוטוקול זה לא רק להיות רב-תכליתי ונגיש לרוב מעבדות המחקר, אלא גם מציע תפוקה גבוהה.

טיפול בתאי HEK-293T עם 200 pg / TNF-α מיליליטר, 40 ng / ml IL1-β, ו- 75 ng / ml IFN-γ (* 3) במשך 24-48 שעות מובילים לכמויות הדרגתית של מוות של תאים (איור 1 א ). כדאיות תא הוערכו באמצעות מבחני MTT ועקביות מוכיחה כי יש ~ ירידה של 10% בכדאיויות תא עם טיפול 24 שעות וירידה של 20% ~ עם טיפול 48 שעות. תאים שטופלו בריכוזים דומים (100 pg TNF-α / מיליליטר, 40 ng / ml IL1-β, ו- 75 ng / ml IFN-γ) יניב תוצאות דומות מוות של תאים בשעה 48, וטיפול בציטוקינים פרט מגלים כי הירידה ב ...

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיטוכונדריה נושמת מתאים מתורבתים או רקמת עכבר, ולאחר מכן להעריך את חוזק פוטנציאל הממברנה שלהם כמדד למצב התאי. עבור תאים מתורבתים, זה מושג על ידי ציפוי תחילה ולאחר מכן טיפול בתאים. לאחר מכן, התאים עוברים הומוגניזציה וההומוגנט מועבר דרך מחט כדי לשחרר עוד יותר את המיטוכונדריה מהתאים.עבור רקמת עכבר, הכבד נכרת מהעכבר ולאחר מכן הומוגני על קרח עם שני סוגי חומר המוצא. לאחר מכן משתמשים בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את המיטוכונדריה משאר התוכן התאי. לאחר שהמיטוכונדריה עוברת עיבוד מסוים, כולל הוספת צבע פלואורסצנטי רגיש לפוטנציאל הממברנה, מבוצעות מדידות פלואורסצנטיות TMRE כדי לחשב את חוזק פוטנציאל הממברנה.בסופו של דבר, ניתן להעריך את תפקוד המיטוכונדריה והפרעות בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש לפוטנציאל הממברנה בשילוב עם קורא צלחות פלואורסצנטי כאשר מטפלים במיטוכונדריה נפוצה על מצמדים ומעכבים, למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ותפקוד לקוי של מיטוכונדריה LS.It ניתן ליישם גם על כל מערכת אחרת שבה השוואה בין שתי דגימות שונות או יותר של מבוקש כגון בריא לעומת מחלה או שני מינים שונים של בעל חיים עם קצב חילוף חומרים שונה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון שקשה ללמוד את שלבי בידוד המיטוכונדריה.הסיבה לכך היא שיש הרבה ניואנסים בעת ביצוע הטכניקה שניתן להתעלם מהם בקטעי השיטה המסורתית. התחל הליך זה עם גידול תאי כליה עובריים אנושיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט 48 שעות לפני צלחת הטיפול בציטוקינים, 160,000 תאים לבקבוק T 1 75 כדי להניב צפיפות של כ-70% בזמן הטיפול. לאחר מכן הסרום מרעיב את התאים 24 שעות לאחר מכן על ידי שאיבת המדיה והחלפתה באותה נפח של מדיה ללא סרום.לבסוף, טפל בתאים הרעבים בסרום על ידי הוספת ציטוקינים מסיסים ישירות למצע תרבית התאים כדי לבצע בידוד של מיטוכונדריה. ראשית יש לשאוב את המדיה ולשטוף את תאי ההדבקה פעמיים עם 15 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט אחת או PBS. בכל פעם לאחר הכביסה, שאפו את המאגר וגרדו את הבקבוק כדי להסיר את התאים הדבקים מהתחתית.לאחר מכן הוסף 15 מיליליטר של XPBS אחד לכל בקבוק, סובב והעביר לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר על קרח. לאחר סיום הגירוד, צנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות ב-700 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס, באמצעות צנטריפוגה שולחנית עם רוטור דלי מתנדנד לאחר צנטריפוגה, שואבים סופרנטנטים והחייאה. השעו כל כדור במיליליטר אחד של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי.לאחר מכן, שלב את שני המתלים והעביר לכלי זכוכית קטן להומוגניזציה במיטוכונדריה המושעה ומאגר בידוד מיטוכונדריאלי לכלי הזכוכית עד שהתמיסה מגיעה לקו הראשון כשהעלי מחובר למקדחה, המשך להומוגניזציה של התאים על הקרח במהירות בינונית למשך שלושה מעברים. יש להקפיד על הסרת בועות אוויר בעת הכנסת העלי לתמיסה, לא להסיר את העלי מעל הנוזל ולהשתמש במהירות קבועה עם מעברים רציפים. העבירו את התמיסה ההומוגנית לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.לאחר מכן משוך את התמיסה למזרק של שלושה מיליליטר באמצעות מחט בגודל 18, אחת בחצי אינץ' והוציא אותה בחזרה לצינור החרוטי על הקרח בעזרת מחט בגודל 27 בגודל חצי אינץ'. הקפד להוציא את התמיסה כנגד הדופן הפנימית של הצינור כדי לנצל את הכוח הזה לשיבוש קרום התא. חזור על שלבי המזרק בסך הכל חמש פעמים, ולאחר מכן העביר את התמיסה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-600 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית באמצעות רוטור דלי מתנדנד.המיטוכונדריה נמצאים בסופרנטנט לאחר הסיבוב הראשון במהירות נמוכה, בעוד שחלק מהממברנות והתאים הבלתי שבורים מגולגלים, מסירים בזהירות את הסופרנטנט ומחלקים בין שלושה צינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את שלושת הצינורות ברוטור זווית קבועה ב -10, 000 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מיטוכונדריה מתאים מתורבתים נראים בצבע לבנבן.הוציאו את הכבד מכל בעל חיים והניחו קר כקרח, XPBS אחד ללא סידן או מגנזיום כדי לשטוף את כל הדם. מעבירים את רקמת הכבד לכלי מרוחק על קרח וקוצצים אותה לחתיכות דקות בעזרת סכין גילוח טרי למשך דקה. לאחר מכן, הוסיפו רקמה ואת המאגר המתאים לכלי עד שהמאגר יגיע לקו הראשון.המשך להומוגניזציה של הרקמה על הקרח עם העלי ביד למשך חמישה מעברים. יש להקפיד על הסרת בועות אוויר בעת הכנסת העלי לתמיסה, לא להסיר את העלי מעל הנוזל ולהשתמש במהירות קבועה עם מעברים רציפים. המשך לעבד את הדגימות עם צנטריפוגה והומוגניזציה כפי שמתבקש בפרוטוקול הטקסט.לאחר שילוב הסופרנטנטים החדשים עם הסופרנטנט הראשון מכל דגימה, צנטריפוגה את הצינורות ברוטור בזווית קבועה ב-10,000 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שאפו בזהירות את השכבה הרכה הלבנה העליונה בעזרת קצה פיפטה או דחפו אותה לצידי הצינור. לאחר מכן שפכו בעדינות את שאר הסופרנטנט וההחייאה.השעו את כדורי המיטוכונדריה בכבד ב-500 מיקרוליטר של בידוד מיטוכונדריאלי. מיטוכונדריה חוצץ מהכבד הם חומים. הנח במהירות את הדגימות על קרח מיד לפני הגדרת התגובות.מדללים את המיטוכונדריה ל -0.5 מיליגרם למיליליטר. ריכוז עבודה עם מאגר ניסיוני. הוסף טיפולים מתאימים כמפורט בפרוטוקול הטקסט כדי להפריד צינורות בעשירית אחת, הנפח הכולל של המיטוכונדריה המדוללת.לאחר מכן, הכניסו את המיטוכונדריה המדוללת לכל צינור תגובה וערבבו בעדינות כל שפופרת כדי להבטיח ערבוב נכון. דגרו את התגובות על הספסל למשך שבע דקות. לאחר מכן הוסף נפח שווה של שני טטרה-אתיל מיקרו-מולרי, מוט דומין, אתיל אסטר, קיצור TMRE לנפח התגובה המיטוכונדריאלית.שוב, מערבבים בעדינות כל צינור כדי להבטיח ערבוב נכון. לאחר דגירה של התגובות על הספסל למשך שבע דקות נוספות, גלול את המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה ברוטור זווית קבועה ב-10,000 פעמים G ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן טען מחצית מנפח ה-supernatant של כל דגימה על 3 84.ובכן, צלחת המשיכו לקרוא את הקרינה של הדגימות ולאחר מכן חישבו את הפרש הקיפול בקרינה בין ביקורת לכל טיפול כמתואר בפרוטוקול הטקסט: טיפול בתאי HEK 2 93 T עם TNF, אלפא, IL, בטא אחד ו-IFN גמא במשך 24 עד 48 שעות מוביל לכמויות מתקדמות של מוות תאי. כדאיות התאים הוערכה באמצעות מבחני MTT המדגימים באופן עקבי כי יש ירידה של כ-10% בכדאיות התאים עם טיפול של 24 שעות וירידה של כ-20%. עם טיפול של 48 שעות, תאים שטופלו בריכוזים דומים מניבים תוצאות דומות של מוות תאים תוך 48 שעות.וטיפול בציטוקינים בודדים מגלה כי הירידה בכדאיות נובעת מהשפעות קומבינטוריות. נתוני הכדאיות מייצגים את סטיית התקן הממוצעת של שלושה ניסויים נפרדים. כל ריצה משולשת וההידוק של פסי השגיאה מדגימים את יכולת השחזור של הנתונים.אחוז הירידה בפוטנציאל הממברנה במיטוכונדריה שבודדה מתאים שטופלו בציטוקינים מצביע על כך שבריאות המיטוכונדריה הושפעה מטיפולי ציטוקינים, מה שמאשש את נתוני הכדאיות לאחר הליך זה. ניתן ליצור שיטות אחרות כמו הערכת סך ייצור TP, TP או צריכת חמצן על מנת להעריך שאלות נוספות כמו אילו הבדלי אנרגיה ונשימה בין הדגימות השונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיטוכונדריה תפקודית שלמה ולהעריך את חוזק פוטנציאל הממברנה שלהם כהשתקפות של המצב התאי.

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ...

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לטיהור של המיטוכונדריה של...

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope הודגם פרוטוקול וידאו מוקלט זה.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

למדו לבודד מיטוכונדריות מתאים בתרבית ומכבד עכבר באמצעות הומוגניזציה וסחיפה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת הערכת פוטנציאל ממברנה באמצעות צבע TMRE לחקר תפקוד מיטוכונדרי ובריאות תאית.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

גלה סרטונים נוספים