בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים
26 בדצמבר 2012
אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי אפיתל אלבולאריים ראשוניים מסוג שני, טהורים וחיוניים, לצורך אנליזות פונקציונליות ומולקולריות בהמשך. ראשית, מזריקים לריאות ולקנה הנשימה של עכבר שהוקרב תמיסה של DYS displays ולאחר מכן אגרוז. לאחר מכן, מוציאים את הריאה לאחר שניתן ל-dispa לעכל אותה.
הרקמה עוברת פירוק ידני. התו suspension המתקבל מסונן דרך סדרה של רשתות בעלות גודל נקבים הולך וקטן. לאחר מכן, תאי אפיתל אלבולריים מסוג שני ותאים צבועים מבודלים באמצעות ברירה שלילית בציטומטריית זרימה.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתאי אפיתל אלבולריים מסוג 2 המבודדים לביצוע בדיקות פונקציונליות ומולקולריות כדי לחקור את תפקידם בזיהומים נשימתיים ובמחלות אוטואימוניות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקשר החסוני הריאתי, במיוחד בהקשר של מחלות ריאה ממקור אוטואימוני וזיהומים נגיפיים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת האיבר ות suspension התאים הן תהליכים שקשה ללמוד.
ההצלחה הכוללת של פרוטוקול זה תלויה במספר פרטים חשובים במהלך שלבים אלו. עבור כל עכבר בניסוי, חממו מראש מבחנה של 15 milliliter המכילה ארבעה milliliters של DYS bays באמבט מים של 37 degrees Celsius. מקמו מנות קטנות של 1%low. Mel Aros במים בבלוק חימום של 95 degrees Celsius עד להמיסה. לאחר מכן קררו ל-45 degrees Celsius ושמרו אותן בטמפרטורה זו עד לשימושן הבא.
כדי להכין את ריאת העכבר, יש להקריב עכבר באמצעות חנק ב-CO2. עם אתנול. בצעו חתך ארוך לאורך קו האמצע הוונטרלי של הגוף.
לאחר מכן, משכו את העור הבטני הרחוק וגזרו בזהירות את הפריטונאום (peritoneum) והסירו אותו. לאחר ריקון העכבר מדם, נקבו בזהירות את הסרעפת והסירו אותה, ולאחר מכן חתכו והסירו את הצלעות. כדי לחשוף את הלב והריאה, גלו זהירות מיוחדת כדי לא לפגוע בריאה באמצעות קנולה בנפח 26 gauge ומזרק של 10 milliliter מלא בנוזל קר.
בצעו דקירה של החדר הימני של הלב באמצעות PBS והזרים PBS לריאה עד שתהיה נקייה מדם. גזרו והסירו את בלוטות הרוק כדי לחשוף את הקנה. כמו כן, גזרו בזהירות את השרירים המקיפים את הקנה.
בשלב הבא, הכניסו קנולה תוך-ורידית (indwelling cannula) במידה 22 לקנה הנשימה. הוציאו את המחט ודחפו את הקטטר הפלסטי לכיוון הריאה. קבעו את הקטטר במקומו על ידי קשירת חוט צמר קטן סביב קנה הנשימה והקטטר.
אם חפץ, הכין דגימה של נוזל שטיפה ברונכואלוולארית (bronchoalveolar lavage fluid) על ידי שטיפת הריאות באמצעות הקטטר שהוכנס לקנה הנשימה עם PBS או מצע גידול. אחסן את נוזל השטיפה על קרח עד לניתוח נוסף. ההיבט המאתגר ביותר בהליך זה הוא העיכול ופירוק הרקמה.
כדי להבטיח את הצלחת הפרוטוקול, יש לוודא שכל ה-dispa ממלא את כל אונואי הריאה וכן לאחר עיכול הרקמה. יש לפרק את הרקמה באמצעות מזרק של שני מיליליטר בזהירות, על ידי הזרקת נפח מקסימלי של שני מיליליטר של ה-dispa שהוכן קודם לכן אל הריאה דרך הקטטר, כך שכל האונואי יתרחבו באופן מלא. החלף את המזרק במזרק של מיליליטר אחד המכיל 0.5 מיליליטר של aros מנוזל, והזרק את התוכן אל הריאה.
השאירו את המזרק על הקטטר כדי למנוע נזילה לאחור של ה-aros וכסו מיד את הריאה בנייר סופג למעבדה ובקרח. המתינו מספר דקות לייצוב ה-aero gel. הסירו את נייר הספיגה, את הקרח, את המזרק ואת הקטטר.
לאחר מכן, חתוך את הקנה והוצא את הריאה, הלב והטימוס מחלל החזה. שטוף את האיברים שהוצאו בתוך צלחת עם PBS. לאחר מכן, חתוך את הלב, הטימוס ואת שארית הקנה מהריאה והשלך אותם.
הנח את הריאה לתוך המבחנה המכילה את שני המיליליטרים הנותרים של ה-displays והדגר אותה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. בצע את ההדגרה כדי להבטיח חסימה יעילה של רספטורי FC של תאים פגוציטיים לפני הליך הצביעה. העבר את הריאה מה-displays אל צלחת המכילה שבעה מיליליטרים של נוגדן anti CD 1632 בריכוז 1 µg/mL ו-100 µL של DNAs ב-DMEM, והפר את רקמת הריאה לחלוטין על ידי משיכתה באמצעות שני זוגות פינצטות.
לאחר מכן, דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על רוקר (rocker) המכוון ל-200 RPM במידת הצורך. ניתן לאחסן את תגלי התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. העבירו את תגלי התאים בעזרת פיפט דרך סדרה של רשתות ניילון.
ראשית, יש למסנן את התו suspension דרך מסנן של 100 micron המוצב על מבחנה של 50 milliliter. במקרה של איחוד דגימות, העבירו את תרחיפי התאים מעכברים מאותה קבוצה דרך אותו המסנן. אם המסנן נסתם, החליפו אותו במסנן חדש.
חזור על תהליך זה עם מסנן רשת של 70 micron. הקפד לשטוף היטב כל רשת, כמו גם את המבחנות והצלחונות, ב-DMEM כדי למזער את אובדן התאים ולמקסם את התנובה. לאחר מכן, העבר את התו suspension דרך מסנן רשת של 48 micron המתוח על טבעת פלסטיק או זכוכית, כפי שמוצג כאן.
אספו את הנוזל שעבר סינון (flow through) לצלוחית פטרי. לאחר מכן, חזרו על תהליך זה עם רשת של 30 מיקרון. בהתאם לנפח, העבירו את התסנין לאחד או יותר ממבחנות של 50 milliliters וסבבו בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-160 times G בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.
לאחר הסבוב, הסר את הנוזל העליון ותלה את משקע התאים בשני מיליליטר של בופר לליזיס של אריתרוציטים. לאחר מכן, הפסק במהירות את הלליזיס על ידי הוספה של 13 מיליליטר של מצע DMEM. העבר את התמיסה למבחנה של 15 מיליליטר וסבב בצנטריפוגה למשך 12 דקות ב-160 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
דגמו את התאים בשלושה מיליליטרים של תערובת נוגדנים ראשוניים המכילה נוגדנים נגד CD 11 C, CD 11 BF four 80 CD 19, CD 1632, ו-CD 45. דגרו את התאים למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורה של 4°C או על קרח. לאחר הדגירה, שטפו את התאים על ידי מילוי המבחנה ב-DMEM וסובבו בצנטריפוגה למשך 12 דקות, ב-160 ×g וב-4°C.
יש להשעות מחדש את התאים ב-1 mL של DMEM ולסנן סינון מקדים דרך מסנן של 50 micron אל תוך מבחנה לצורך מיון תאים. יש לספור את התאים כדי לקבל את מספר התאים הכולל בתליה של הריאה. השתמשו בנחיר (nozzle) של 100 micro לצורך מיון תאי EC2 מיד לפני תהליך המיון.
ערבבו את תרחיף התאים באמצעות שייקר וורטקס. לחץ הנוזל, אורך הגל של פליטת הלייזר ואורך גל הגילוי תלויים במכשיר המשמש למיון תאים בשיטת ציטומטריית זרימה, וכן בפלואורו-כרומים ששימשו בהליך הצביעה בנוגדנים. ראשית, צרו תרשים של פיזור צדי (sideward scatter area) מול פלואורסצנציה, והגדירו שער (gate) עבור כל התאים בעלי פיזור צדי גבוה השליליים לפלואורו-כרומים ששימשו לצביעה.
בשלב הבא, צור גרפים של שטח פיזור צדי לעומת שטח פיזור קדמי, גובה פיזור קדמי לעומת שטח פיזור קדמי, וגובה פיזור צדי לעומת שטח פיזור צדי, ובצע סינון (gate) כדי להוציא דובלטים או אגרגטים של תאים המופנים למבחנה המכילה DMEM. כאשר מבודדים תרחיפי תאי ריאה מעכברים בריאים, שער ה-EC2 יהווה בדרך כלל כ-42 ± 10% מכלל האירועים. כדי לאסוף את התאים הממוינים, סבב בצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-280 ×g וב-4 °C.
יש לחדש את התליה של תאי אפיתל אלבאולריים מסוג 2 או EC2 במצע גידול או בתמיסת בופר, בהתאם לדרישות הניתוח הבא. תאי אפיתל אלבאולריים ראשוניים של עכבר בודדו באמצעות סלקציה שלילית בציטומטריה של זרימה כפי שמתואר בסרטון זה; ניתוח התאים הממוינים מוצג כאן, כפי שצוין.
טוהרת התאים המבודדים היא בערך 92 ± 5%. תאי A EC2 ממוינים נצבעו עבור חלבון הסורפקטנט C; תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) מוצגת משמאל ואימונופלואורסצנציה מוצגת מימין. נמצא כי כמעט 100% מהתאים היו חיוביים לחלבון הסורפקטנט C, ובכך אוששה בידוד מוצלח של אוכלוסייה טהורה. כדי להעריך את ההשפעות של זיהום בנגיף שפעת A in vivo, תאי A EC2 בודדו מעכברי C 57 BL six שקיבלו באופן אינטראנזאלי או PBS (מלח פוספט רב-ערכי) או נגיף שפעת A PR eight A 34, יום, יומיים או שלושה ימים קודם לכן.
תרשימים אלו מציגים תרחיפי תאי ריאה מעכברים זכרים מסוג C 57 black six שאינם מזוהמים וכאלו שזוהמו לפני שלושה ימים, אשר נצבעו לצורך מיון עקב גיוס תאי חיסון לריאה המזוהמת. שיעור התאים בעלי פלואורסצנציה שלילית ופיזור צדי (side scatter) גבוה פחת משמעותית בתרחיף התאים שהוכן מהעכברים שהיו מזוהמים במשך שלושה ימים בהשוואה לעכברים שאינם מזוהמים. ביטוי של חלבון גרעיני של Influenza A virus שמוין ל-A2 נותח באמצעות צביעה תוך-תאית עם נוגדן ספציפי לחלבון הגרעיני.
ההיסטוגרמה מראה כי תאי C two שבודדו מעכברים שהודבקו in vivo מניבים אות פלואורסצנציה ספציפי לאחר צביעה תוך-תאית של ה-nucleo protein של נגיף השפעת A. הטבלה מראה את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של צביעת החלבון הגרעיני; עוצמת האות המופקת מצביעה תוך-תאית של החלבון הגרעיני בתאי EC2 שבודדו מעכברים שהודבקו בנגיף השפעת A עולה עם משך ההדבקה הנגיפית, זאת כדי להדגים את חיוניותם של תאי EC2 שבודדו מעכברים בריאים ולבדוק את רגישותם להדבקה בנגיף השפעת A.
ניתוח של ביטוי חלבון גרעיני של נגיף השפעת (Influenza) בוצע גם בתאים מבודדים שהודבקו X vivo, כפי שמוצג כאן. חלק ניכר מ-EC2 מבטא את החלבון הגרעיני של הנגיף שש שעות לאחר ההדבקה. נתונים אלו מסוכמים כאן.
אחוז תאי ה-EC2 החיוביים לצביעה תוך-תאית של החלבון הגרעיני הווירוסלי תלוי במינון הווירוס ששימש בניסוי ההדבקה ex vivo. תוצאות אלו מראות כי הנוירונים הראשוניים המבודדים, תאי EC2, הם חיוניים ורגישים להדבקה ושכפול של הווירוס, כפי שהוערך על סמך ביטוי החלבון הווירוסלי שנצפה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור לבצע את כל שלבי עיכול ופירוק הרקמה בזהירות.
כמו כן, חשוב מאוד לזכור לבצע gait קפדני על השלילה הפלואורסצנטית ובאזור של תאי getter גבוהים. לאחר מיון לפי הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מחקרים מולקולריים ופונקציונליים, כדי לשלול את תפקידם של תאי ריאה מסוג שני ושלישי בהקשר של זיהומים נגיפיים ומחלות ריאה ממקור אוטואימוני.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מהיר של תאי אפיתל סוג II אלוולאריים ראשוניים (AECII) מעכבר באמצעות בחירה שלילית ציטופלומטית. ה-AECII המבודדים מציגים רמת חיות וטוהר גבוהה, מה שהופך אותם למתאימים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים שונים הקשורים למצבים נשימתיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- פיזיולוגיה נשימתית
- אימונולוגיה
רקע
- תאי אפיתל אלוולאריים מסוג II ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד ובהומאוסטזיס של הריאות.
- הבנת תפקודם חשובה לחקר מחלות נשימה.
- שיטות עכשוויות לבידוד התאים הללו יכולות להיות ארוכות ולא יעילות.
- מחקר זה מציג גישה משופרת לשפר את יעילות הבידוד.
מטרת המחקר
- לבודד תאי אפיתל אלוולאריים ראשוניים מסוג II טהורים וחיים.
- להקל על ניתוחים פונקציונליים ומולקולריים עוקבים.
- לשפר את ההבנה של AECII במצבים נשימתיים.
שיטות ששימשו
- החדרת תצוגות DYS ואגרוזה לריאות ולקנה הנשימה של עכברים שנטבחו.
- פירוק ידני של רקמת הריאה לאחר עיכול.
- סינון השעיה שהתקבלה דרך רשתות בעלות גודל נקבים הולך וקטן.
- בידוד של AECII באמצעות בחירה שלילית ציטופלומטית.
תוצאות עיקריות
- השיטה מניבה רמת חיות וטוהר גבוהה של AECII המבודדים.
- התאים המבודדים מתאימים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים.
- הנוהל יעיל וניתן לשחזור.
- יישומים פוטנציאליים בחקר מחלות נשימה אוטואימוניות ומדבקות.
מסקנות
- שיטת בידוד זו משפרת את המחקר של תאי אפיתל אלוולאריים מסוג II.
- AECII באיכות גבוהה יכולים להוביל לתובנות טובות יותר לגבי מצבים נשימתיים.
- הגישה עשויה להיות חלה על סוגי תאים אחרים במחקר עתידי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) enables mechanistic de-risking in respiratory disease target validation by providing a disease-relevant system that reflects in vivo complexity. This approach supports predictive confidence in early discovery by yielding highly viable, pure AECII suitable for functional and molecular assays, reducing reliance on immortalized cell lines. The method facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation of immune-mediated lung pathologies and viral infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a primary cell context that retains native lung microenvironmental influences.
- Operational Value: Provides a reproducible source of untouched AECII for pathway clarification and functional target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing assessment of compound effects on AECII-mediated immune regulation in infection and autoimmunity models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, highly pure AECII suspensions suitable for downstream functional assays including T-cell stimulation and cytokine profiling.
- Quantitative Output: Enables measurement of dependent variables such as surfactant protein C expression and intracellular viral nucleoprotein levels as biomarkers of cellular state and infection susceptibility.
- Scalability: Compatible with flow cytometry platforms allowing multiplexed sample processing and cross-group comparison in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Permits isolation of AECII from mice subjected to respiratory challenges such as influenza infection, enabling study of cell-intrinsic responses under pathophysiological conditions.
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates correlation of functional readouts with molecular signatures (e.g., viral protein expression) relevant to human respiratory disease mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing data on AECII viability and susceptibility to viral replication, informing mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary AECII for hypothesis testing in early biology, enabling assay development for screening campaigns, and generating quantitative functional and molecular readouts that inform translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in lung immunology by providing access to primary AECII from naïve and challenged mice.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions enabling reproducible compound evaluation in functional assays such as cytokine secretion and immune cell interaction assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements including sideward scatter high gating, fluorescence intensity of viral nucleoprotein, and surfactant protein C positivity for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through ex vivo and in vivo infection models that model human respiratory pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow applicable across multiple respiratory disease models, reducing redundant optimization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through use of primary cells reflecting native lung biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via flow cytometric negative selection, minimizing variability introduced by enzymatic depletion or magnetic bead methods.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of lack of efficacy in AECII-mediated pathways, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by generating data on AECII function in infection and autoimmunity, supporting indication selection and biomarker strategy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue handling, enzymatic lung digestion, and flow cytometric cell sorting instrumentation.
- Dependent on access to flow cytometer with appropriate laser and detection capabilities for sideward scatter and fluorescence discrimination.
- Necessitates standardization of antibody cocktails and gating strategies across sites to ensure reproducibility of AECII isolation.
- Involves optimization of tissue disintegration steps to maximize yield while preserving cell viability and surface marker integrity.
- Limited by the accessibility of AECII in diseased lungs, where immune cell infiltration may alter SSChigh gate frequency and require adaptive gating.
