בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אפיתל של נוירון ראשוני טהור ובר קיימא מסוג שני לצורך ניתוחים פונקציונליים ומולקולריים הבאים. ראשית, הריאה וקנה הנשימה של עכבר שהוקרב מוחדרים עם תמיסה של תצוגות DYS ולאחר מכן אגרוז. לאחר מכן מסירים את הריאה לאחר שנותנים לדיספה לעכל את הריאה.

הרקמה מתפוררת ידנית. המתלה המתקבל מסונן דרך סדרה של רשתות בגודל נקבוביות הולך ופוחת. לאחר מכן תאי אפיתל מכתשית מוכתמים וסוג שני מבודדים על ידי ברירה שלילית ציטומטרית זרימה.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתאי האפיתל המכתשית המבודדים מסוג 2 לביצוע בדיקות פונקציונליות ומולקולריות כדי לחקור את תפקידם בזיהום בדרכי הנשימה ובמחלות אוטואימוניות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקשר החיסוני הריאתי, במיוחד בהקשר של מחלות ריאה אוטואימוניות וזיהומים ויראליים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הכנת תרחיף האיברים והתאים.

ההצלחה הכוללת של פרוטוקול זה תלויה במספר פרטים חשובים במהלך שלבים אלה עבור כל עכבר בניסוי, יש לחמם מראש צינור של 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של מפרצי DYS במקום אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, עליות קטנות של 1% נמוך. מל ארוס במים בבלוק חימום של 95 מעלות צלזיוס עד לנוזל. לאחר מכן התקשר ל-45 מעלות צלזיוס ושמור אותם בטמפרטורה זו עד לשימוש הבא.

כדי להכין את ריאות העכבר ריססו עכבר שהוקרב על ידי חנק CO2. עם אתנול. בצע חתך ארוך לאורך קו האמצע הגחוני של הגוף.

לאחר מכן משוך את העור הרחוק הגחוני וחתוך בזהירות והסר את הצפק. לאחר הוצאת העכבר, יש לנקב בזהירות ולהסיר את הסרעפת ואז לחתוך את הצלעות. כדי לחשוף את הלב והריאות, יש להקפיד במיוחד לא לפגוע בריאה בעזרת צינורית בגודל 26 ומזרק של 10 מיליליטר מלא בקור.

PBS מנקב את החדר הימני של הלב ומחדיר את הריאה עם PBS עד שהוא נקי מדם. חותכים ומסירים את בלוטות הרוק כדי לחשוף את קנה הנשימה. כמו כן, חתכו בזהירות את השרירים המקיפים את קנה הנשימה.

לאחר מכן, הכנס צינורית שוכנת בגודל 22 לקנה הנשימה. הסר את המחט ודחף את קטטר הפלסטיק לכיוון הריאה. קבע את הקטטר למקומו על ידי קשירת פיסת חוט קטנה סביב קנה הנשימה והצנתר.

אם תרצה, הכן דגימת נוזל שטיפת סימפונות על ידי שטיפת הריאות באמצעות הצנתר המוחדר לקנה הנשימה עם PBS או מדיום. אחסן את נוזל השטיפה על קרח עד לניתוח נוסף. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא עיכול והתפוררות רקמות.

כדי להבטיח את הצלחת פרוטוקול זה, עליך לדאוג לכך שהדיספא השלם יתמלא בכל אונות הריאה ולאחר עיכול הרקמות. אתה צריך לפרק את הרקמה באמצעות מזרק של שני מיליליטר בזהירות, עדיין נפח מקסימלי של שני מיליליטר של הדיספה שהוכן קודם לכן לריאה דרך הקטטר כך שכל האונות מורחבות במלואן. החלף את המזרק במזרק מיליליטר אחד המכיל 0.5 מיליליטר של הארוס הנוזלי והחדיר את התוכן לריאות.

השאירו את המזרק על הקטטר כדי למנוע זרימה חוזרת של ה-aros וכסו מיד את הריאה ברקמת מעבדה, נייר וקרח. תן לאירו ג'ל למשך מספר דקות. הסר את נייר הטישו, מזרק הקרח והצנתר.

לאחר מכן חתכו את קנה הנשימה והוציאו את הריאה, הלב והתימוס מהחזה. שוטפים את האיברים המוכנים בכלי עם PBS. לאחר מכן חותכים את הלב, התימוס ואת קנה הנשימה הנותר מהריאה ומשליכים אותם.

הכניסו את הריאה לצינור המכיל את שני מיליליטר התצוגות הנותרים ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. שנה את הדגירה כדי להבטיח חסימה יעילה של קולטני ה-FC של תאים פגוציטים לפני הליך הצביעה. העבירו את הריאה מהתצוגות לצלחת המכילה שבעה מיליליטר של מיקרוגרם אחד למיליליטר, נוגדן נגד CD 1632 ו-100 מיקרוליטר DNA ב-DMEM, באמצעות שני זוגות מלקחיים מפרקים לחלוטין את רקמת הריאה על ידי פירוקה.

לאחר מכן דגרו אותו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה המוגדרת ל -200 סל"ד אם תרצה. לאחר מכן ניתן לאחסן את תרחיף התאים בארבע מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. פיפטה את מתלה התא דרך סדרה של רשתות ניילון.

ראשית, שפכו את המתלה דרך פילטר 100 מיקרון המונח על גבי צינור של 50 מיליליטר. אם מאגדים דגימות, העבירו את תרחיפי התאים מעכברים מאותה קבוצה דרך אותו מסנן. אם המסנן נסתם, החלף אותו בחדש.

חזור על תהליך זה עם מסנן רשת של 70 מיקרון. הקפד לשטוף כל רשת כמו גם את הצינורות והכלים ביסודיות עם DMEM כדי למזער את אובדן התאים ולמקסם את התפוקה. לאחר מכן, משוך את המתלה דרך טווח מסנן רשת של 48 מיקרון על טבעת פלסטיק או זכוכית כפי שמוצג כאן.

אוספים את הזרימה בצלחת פטרי. לאחר מכן חזור על תהליך זה עם רשת של 30 מיקרון. בהתאם לנפח, העבירו את המסנן לאחד או יותר של 50 מיליליטר, צינורות וצנטריפוגה למשך 15 דקות של 160 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסיבוב, הסר את הסופינט והשהה מחדש את כדור התא בשני מיליליטר של מאגר ליזיס אריתרוציטים. לאחר מכן סיים במהירות את הליזיס על ידי תוספת של 13 מיליליטר של מדיום DMEM. העבירו את התמיסה לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך 12 דקות בטמפרטורה של 160 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

ריס היה התאים בשלושה מיליליטר של קוקטייל נוגדנים ראשוני המכיל נוגדנים נגד CD 11 C, CD 11 BF ארבעה 80 CD 19, CD 1632 ו-CD 45. דגרו על התאים במשך 10 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס או על קרח לאחר הדגירה. שטפו את התאים על ידי מילוי הצינור ב- DMEM וצנטריפוגה למשך 12 דקות, 160 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של DMEM וסננו מראש דרך מסנן 50 מיקרון לתוך צינור למיון תאים. ספור את התאים כדי לקבל את מספר התאים הכולל בתרחיף הריאות. השתמש בזרבובית של 100 מיקרו למיקור תאים של EC2 מיד לפני המקור.

מערבבים את מתלה התאים על ידי נדן מערבולת. לחץ נוזלים והפוגה בלייזר ואורכי גל זיהוי תלויים במכשיר המשמש למיון תאים ציטומטריים בזרימה וכן בפלואורוכרומים המשמשים בהליך צביעת הנוגדנים. ראשית, צור אזור פיזור הצידה לעומת עלילת פלואורסצנטיות ושער בכל אזור הפיזור הצידה תאים גבוהים שליליים לפלואורוכרומים המשמשים לצביעה.

לאחר מכן, צור שטח פיזור הצידה לעומת אזור פיזור קדימה וגובה פיזור קדימה לעומת אזור פיזור קדימה וגובה פיזור הצידה לעומת חלקות שטח פיזור הצידה ושער כדי לא לכלול כל מקור כפול או אגרגטים של תאים לתוך צינור המכיל DMEM. בעת רכישת תרחיפי תאי ריאה מבודדים מעכברים בריאים, שער EC2 יהווה בדרך כלל כ-42 פלוס מינוס 10% מכלל האירועים. על מנת לאסוף את התאים הממוינים צנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 280 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

השהה מחדש את תאי האפיתל המכתשית מסוג שני או EC2 בתרבית, מדיה או מאגר כנדרש לניתוח שלאחר מכן. תאי אפיתל מכתשית ראשוניים מסוג שני עכברים בודדו על ידי ברירה שלילית ציטומטרית זרימה כמתואר בסרטון זה, ניתוח התאים הממוינים מתואר כאן. כפי שצוין.

טוהר התאים המבודדים הוא בערך 92 פלוס מינוס 5% ספינים של Ciis ממוינים: EC2 נצבע עבור החלבון פעילי השטח CA, תמונת ניגודיות פאזה מוצגת משמאל ואימונופלואורסצנציה מוצגת מימין. כמעט 100% מהתאים נמצאו חיוביים לחלבון פעילי שטח C, ובכך אישרו בידוד מוצלח של אוכלוסייה טהורה. כדי להעריך את ההשפעות של זיהום בנגיף שפעת A in vivo, A EC2 בודדו משישה עכברים C 57 BL שקיבלו תמיסת מלח עם פוספט או נגיף שפעת A PR שמונה A 34 תוך האף אחד, יומיים או שלושה קודם לכן.

תרשימים אלה מציגים תרחיפי תאי ריאה מאדם לא נגוע כמו גם שלושה ימים נגועים C 57 שחורים שישה זכרים שנצבעו למיון עקב גיוס תאים חיסוניים לריאה הנגועה. שיעור הצד הקרינה השלילי עם תאים גבוהים באזור פיזור יורד באופן משמעותי בתוך תרחיף התאים שהוכן משלושת הימים הנגועים בהשוואה לעכברים הלא נגועים. שפעת, ביטוי חלבון גרעיני של נגיף ממוין C 2 נותח באמצעות צביעה תוך תאית עם נוגדן ספציפי לחלבון גרעיני.

ההיסטוגרמה מראה כי C 2 שבודד מעכברים נגועים in vivo מניב אות פלואורסצנטי ספציפי לאחר צביעה תוך-תאית לנגיף השפעת A, חלבון נוקלאו. הטבלה מציגה את עוצמת הקרינה הממוצעת של החלבון הגרעיני המכתים את עוצמת האות המופק על ידי צביעת החלבון הגרעיני התוך-תאי של EC2 שבודד משפעת. עכברים נגועים בנגיף גדלים עם משך ההדבקה הנגיפית כדי להדגים את הכדאיות של EC2 שבודד מעכברים בריאים וכדי לבדוק את רגישותם לזיהום בנגיף שפעת A.

שפעת, ביטוי חלבון גרעיני של נגיף נותח גם בתאים מבודדים הנגועים ב-X vivo כפי שמוצג כאן. חלק ניכר מ-EC2 מבטא את החלבון הגרעיני הנגיפי שש שעות לאחר ההדבקה. נתונים אלה מסוכמים כאן.

אחוז ה-EC2 החיובי לצביעה התוך תאית של החלבון הגרעיני הנגיפי תלוי במינון הנגיפי המשמש לניסוי הזיהום ex vivo. תוצאות אלה מראות כי הנוירון הראשוני המבודד, EC2, בר-קיימא ורגיש לזיהום ויראלי ושכפול המוערך כביטוי של חלבון נגיפי שנראה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור לבצע בזהירות את כל שלבי העיכול וההתפוררות של הרקמות.

כמו כן, חשוב מאוד לזכור ללכת בקפדנות על התאים הגבוהים של הקרינה שלילית ואזור הגטר הצדדי. בעת מיון בעקבות הליך זה, ניתן ליצור שיטות אחרות כמו מחקרים מולקולריים ופונקציונליים כדי לשלול את תפקידו של סוג 2 השליש של הריאה בהקשר של זיהומים נגיפיים ומחלות ריאה אוטואימוניות.