Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

אנו מתארים assay אבחון יקר שעלולים לשמש כדי להחליט הנסיגה של דיכוי חיסוני לאחר השתלה ללא סיכון מוגבר לדחיית שתל. Assay משתמש בעקרונות של רגישות יתר מושהה סוג ומספק הערכה מדויקת של שתי התגובות רכובים על ידי מקבלי חיסון מפעיל ורגולציה הספציפיות תורמות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במבחן ה-DTH trans vivo כדי לנטר תגובות ספציפיות של אנטיגן פרו ואנטי דלקתי בנבדקים אנושיים. ראשית, בודדו תאים חד-גרעיניים מדם היקפי מהדם ההיקפי של הנבדק האנושי. לאחר מכן מערבבים הכנת PBMC עם PBS.

אחזור אנטיגן בדיקת אנטיגן ואנטיגן בדיקה בתוספת אנטיגן ריקול. המשך במדידות כרית כף הרגל והזריק תערובות מוכנות לעכברי החלקה. כריות רגליים חוזרות על המדידות 24 שעות לאחר מכן. שלוש.

דפוסים סופיים של תגובות DTH אפשריים רגולטוריים, לא רגולטוריים ורגישים. ניתן ליישם את בדיקת רגישות היתר מסוג trans vivo כדי לקבוע פרמטרים קליניים כמו תגובות allo react כאשר מקור האנטיגן הוא התאים של תורם ההשתלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מבחנה קיימות הוא שניתן לזהות בקלות תגובות פרו-דלקתיות ורגולטוריות לאנטיגנים אלו, אנטיגנים אוטומטיים או אנטיגנים גידוליים באמצעות מערכת בדיקה אחת.

אגון, חוקר במעבדה שלי ידגים כעת את ההליך באמצעות דם היקפי אנושי טרי שנאסף בצינורות דקסטרוז חומציים ציטראט כדי למנוע הפעלת טסיות דם. לבודד PBMC באמצעות מדיום הפרדת לימפוציטים על פי שיטות סטנדרטיות. שטפו את תכשיר ה- PBMC עם PBS כדי להסיר טסיות דם מזהמות.

אם יש זיהום מורגש של כדוריות דם אדומות, בצע ליזה של התאים האדומים באמצעות מאגר ליזה CK. לאחר מכן בצע שתי שטיפות נוספות עם PBS Resus. השעו את ה-PBMC ב-PBS בריכוז של 10 מיליון PBMC למיליליטר עבור אנטיגן אלו.

התחל עם P BMCs, מבודד מהדם ההיקפי של התורם באמצעות ההליך שהוצג קודם לכן. ואז החייאה. השעו את תאי התורם ב-PBS בריכוז של 120 מיליון תאים למיליליטר והוסיפו מיקרו-מולרית אחת של PMSF כדי למנוע פירוק חלבון.

כעת סוניקציה של תרחיף התא באמצעות שבעה פולסים של שנייה אחת עם סוניקה בדיקה של שני מילימטרים. באמצעות ציטומטר המו. ודא את ההפרעה של יותר מ- 90% מהתאים.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב -14, 000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור נעילה כפול בטוח וקבעו את ריכוז החלבון בשיטות סטנדרטיות לכל זריקה. Aliquot שבע פעמים 10 ל-P BMC השישי לשני מיליליטר.

צינורות נעילה בטוחים מגלגלים את התאים על ידי צנטריפוגה. ראשית, הכינו את מתלה הבקרה השלילית של PBMC ב -35 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן לבקרה החיובית, הוסף 25 מיקרוליטר של אנטיגן ריקול, טטנוס, רעלן, דיפטריה, רעלן, והתאם את נפח ההזרקה ל-35 מיקרוליטר עם PBS.

בהתאם לתכנון הניסוי להערכת התגובה הספציפית של התורם, השעו מחדש את גלולת התא ב-10 מיקרוליטר של אנטיגן תורם בתוספת 25 מיקרוליטר PBS לנפח כולל של 35 מיקרוליטר. להערכת הרגולציה הספציפית לאנטיגן התורם הניסיוני, החייאה השעתה את גלולת התא ב-35 מיקרוליטר על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של אנטיגן תורם ו-25 מיקרוליטר של אנטיגן TT DT לזיכרון. לאחר ההרדמה, עכבר ההחלקה עם איזוף פלואור מניח קליפר טעון קפיץ במרכז כרית כף הרגל עם קצה אחד הנוגע בכרית ההליכה האחרונה של כף הרגל כדי לספק אמת מידה לשמירה על עקביות אתר המדידה כאשר קריאת המד התייצבה.

רשום את עובי כרית כף הרגל הבסיסי עבור הזרקת כרית כף הרגל. הנח את המזרק כשהמחט פונה לכיוון אצבעות הרגליים והשיפוע פונה כלפי מעלה. כעת התחל בהזרקות תת עוריות של כל מתלה תאים לרפידות כף הרגל האחורית לעכבר.

ראשית, יש להזריק לאט את כרית כף הרגל הימנית עם הכנה לשליטה שלילית. לאחר מכן, הזריק את כרית כף הרגל השמאלית עם השליטה החיובית של PBMC בתוספת TT dt. כעת החזר את העכבר לכלוב שלו לעכבר.

מספר שתיים, הזרקו את כרית כף הרגל הימנית עם PBMC בתוספת אנטיגן allo ואת כרית כף הרגל השמאלית עם PBMC בתוספת אנטיגן allo בתוספת TT dt. ודא שאין דליפה בסביבות 18 עד 24 שעות לאחר ההזרקה. הרדמו כל עכבר עם איזוף פלואור וחזרו על מדידת הנפיחות של כרית כף הרגל.

הפחיתו את העובי של כל כרית כף רגל לפני ההזרקה מהערך שלאחר ההזרקה כדי לקבל את ערך הנפיחות של כרית כף הרגל. לאחר מכן חשב את הנפיחות נטו הספציפית לאנטיגן על ידי הפחתת ערך הנפיחות של כרית כף הרגל מערכי הנפיחות של כרית כף הרגל המתקבלים מהטיפולים. ודא את קריאת הבקרה החיובית תגובת בקרה חיובית לזכור אנטיגן TT DT של גדול או שווה ל-25 כפול 10 למינוס 4 סנטימטרים.

נדרשת תגובת רקע ל-PBS כדי שהבדיקה תיחשב תקפה. לאחר מכן, קבע את עיכוב תגובות ההיזכרות בנוכחות אנטיגנים תורמים. ניסוי זה מעריך את מושתלי הכליה עבור תגובה ספציפית לאנטיגן של התורם ולוויסות.

ישנם שלושה דפוסים עיקריים של רגישות יתר מסוג מושהה אצל מושתלים, רגולטורית, לא רגולטורית ורגישה. כל החולים הגיבו חזק לשליטה החיובית באנטיגן הזיכרון tt. חולה מספר 62 מראה את הדפוס הרגולטורי המאופיין בתגובה חלשה לאנטיגן התורם ודיכוי מקושר ניכר לזיכרון תגובת אנטיגן בנוכחות אנטיגן תורם.

זהו הדפוס שנמצא קשור לסבילות להשתלת איברים. חולה מספר 48 מציג דפוס לא רגולטורי, שיש לו מאפיין של תגובה חלשה לתורם, אך ללא דיכוי מקושר. דפוס זה נצפה לעתים קרובות בחולים הנוטלים תרופות מדכאות חיסון.

מטופל מספר שמונה מציג דפוס רגיש לתורם המאופיין בתגובה גבוהה לאנטיגן התורם וללא דיכוי מקושר. תגובה זו קשורה לדחיית השתל. במחקרי מקרה קליניים, נבדקו BMCs P מנבדקים שנרשמו לניסוי תצפיתי עבור מסלול עקיף ספציפי לתורם, אפקטור T ותגובות רגולטוריות T כדי להעריך את תפקיד הרגולציה הספציפית של התורם בסבילות קלינית.

התגובות העקיפות של טקטור לאנטיגנים של תורמים חושפות ספקטרום מובהק בין קבוצות ההרשמה. הנפיחות בכרית כף הרגל עולה ככל שהמצב הקליני של המטופל עובר מאלה שהם סובלניים לאלה שדוחים באופן כרוני. כאן, בדיקת הדיכוי המקושרת מודדת את המסלול העקיף נגד התורם של התגובה הרגולטורית של T.

נתונים אלה מראים ירידה בתגובות הרגולטוריות בטווח מרוב החולים הסובלניים ביותר ועד לחולים דחויים כרוניים בינוניים עד פחות סובלניים. ביחד. נראה כי ויסות חיסוני כפי שנמדד על ידי מבחן ה-DTH trans vivo הוא מנגנון חשוב לקבלת השתל הכלייתי.

תחום מבטיח הוא היישום של בדיקת TDTH בניטור אוטואימוניות. המחקר שלנו על תפקידו של קולגן מסוג 5 בתהליך הפתולוגי של תסמונת OBL ברונכיוליטיס גילה כי הסיכון היחסי הגבוה ביותר להתפתחות BOS נצפה בחולים עם תגובה חיובית לקולגן. חמישה pbmc ממושתלי ריאות, אך לא מביקורת בריאה או קולגן.

ארבעה תסמונת מרעה טובה תגובתית חולים לאחר השתלת כליה היו לעתים קרובות קולגן חמש תגובתי. ניתן להשתמש במבחן TDTH גם כדי לבדוק את התגובתיות של pbmc מחולי סרטן לאנטיגנים ספציפיים לגידול. לדוגמה, נוכחותם של תאי ויסות T ספציפיים ל-PAP בחולי סרטן הערמונית עשויה להגביל את התגובה לחיסון באנטיגן PAP.

בדיקת TRANSVAAL DTH היא בדיקת אבחון חדשה עם יישום קליני בהערכת תגובות חיסוניות בתיווך תאים בסרטן מושתלים וחולים אוטואימוניים. זה בעל ערך מכיוון שהוא לא רק שימושי בניטור תגובות היזכרות באפקטור t, אלא הוא יכול לשמש גם לאיתור תגובות רגולטוריות של T מכיוון שהוא אינו מסתמך על מדידת ציטוקינים מסוימת לזיהוי תאי T אפקטים או רגולציה. זה מאוד גמיש וישים באופן רחב.