Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בבדיקת DTH trans vivo כדי לנטר תגובות ספציפיות לאנטיגן, הן פרו-דלקתיות והן אנטי-דלקתיות, בנבדקים אנושיים. ראשית, יש לבודד תאי PBMC מדם פריפריאלי של הנבדק. לאחר מכן, ערבב את תכשיר ה-PBMC עם PBS.

אנטיגן זיכרון (recall antigen), אנטיגן בדיקה (test antigen), ואנטיגן בדיקה בתוספת אנטיגן זיכרון. בצע את מדידות ה-prem של כרית כף הרגל והזרק את התערובות שהוכנו לעכברי skid. חזור על המדידות בכרית כף הרגל לאחר 24 שעות. שלוש.

דפוסי תגובה מוגדרים של DTH יכולים להיות רגולטוריים, לא רגולטוריים או רגישים (sensitized). ניתן להשתמש בבדיקת רגישות מאוחרת מסוג trans vivo כדי לקבוע פרמטרים קליניים כגון תגובות allo react, כאשר מקור האנטיגן הוא תאי התורם של השתלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות in vitro קיימות הוא היכולת לזהות בקלות הן תגובות פרו-דלקתיות והן תגובות רגולטוריות לאנטיגנים של allo, אוטואנטיגנים או אנטיגנים של גידולים, באמצעות מערכת בדיקה אחת.

אגון, חוקר במעבדתי, ידגים כעת את הפרוצדורה. יש להשתמש בדם פריפריאלי אנושי טרי שנאסף למבחנות ציטראט-דקסטרוז חומצי כדי למנוע הפעלת טסיות. יש לבודד PBMC באמצעות מדיום להפרדת לימפוציטים לפי שיטות סטנדרטיות. יש לשטוף את תכשיר ה-PBMC ב-PBS כדי להסיר טסיות מזוהמות.

במקרה של זיהום מורגש של תאי דם אדומים, בצע ליזיס לתאים האדומים באמצעות תמיסת CK lysis buffer. לאחר מכן בצע שטיפה נוספת פעמיים עם PBS Resus. תלה את ה-PBMC ב-PBS בריכוז של 10 מיליון PBMC למיליליטר עבור ה-allo antigen.

התחילו עם תאי PBMC, שבודדו מדם היקפי של התורם באמצעות הפרוטוקול שהוצג קודם לכן. לאחר מכן, השעו את תאי התורם ב-PBS בריכוז של 120 מיליון תאים למילליליטר והוסיפו 1 µM של PMSF כדי למנוע פירוק חלבונים.

כעת בצעו סוניקציה לתליה התאית באמצעות שבעה פולסים של שנייה אחת בעזרת סוניקטור עם פרוב של 2 mm. ודאו כי למעלה מ-90% מהתאים עברו דיסרופציה באמצעות המוציטומטר.

בשלב הבא, סבבו את התערובת בצנטריפוגה ב-14,000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבירו בזהירות את supernatant לשפופרת safe lock וקבעו את ריכוז החלבון באמצעות שיטות סטנדרטיות עבור כל הזרקה. חלקו שבע מנות של 10⁶ pBMC לתוך 2 mL.

מבובות עם תפסים בטיחותיים (Safe lock tubes) משקיעים את התאים באמצעות סבוב צנטריפוגה. ראשית, הכין את תרחיף ביקורת השלילה של PBMC ב-35 microliters של PBS. לאחר מכן, עבור ביקורת החיוביות, הוסף 25 microliters של אנטיגן זיכרון (recall antigen), טטנוס, טוקסואיד, דיפתריה, טוקסואיד, וכוונן את נפח ההזרקה ל-35 microliters באמצעות PBS.

בהתאם למערך הניסוי להערכת תגובה ספציפית לתורם, השהו מחדש את משקע התאים ב-10 µL של אנטיגן תורם בתוספת 25 µL של PBS לנפח כולל של 35 µL. להערכת regulación ספציפית לאנטיגן תורם ניסויי, השהו מחדש את משקע התאים ב-35 µL על ידי הוספת 10 µL של אנטיגן תורם ו-25 µL של אנטיגן recall TT DT. לאחר הרדמת עכבר ה-skid באמצעות isof fluorine, מקמו קליפר עם קפיץ במרכז כרית כף הרגל, כאשר קצה אחד נוגע בכרית ההליכה האחרונה של כף הרגל כדי לספק נקודת ייחוס לשמירה על עקביות של אתר המדידה כאשר קריאת המד התייצבה.

מדדו את עובי כרית כף הרגל כבסיס עבור ההזרקה לכרית כף הרגל. מקמו את המזרק כך שהמחט פונה לכיוון הבהונות והשיפוע פונה כלפי מעלה. כעת התחילו בהזרקות תת-עוריות של כל תרחיף תאים לכרית כף הרגל האחורית של העכבר.

שלומה, הזרק לאט לכרית כף הרגל הימנית את תכשיר הביקורת השלילית. לאחר מכן, הזרק לכרית כף הרגל השמאלית את ביקורת החיוביות של PBMC פלוס TT dt. כעת החזר את העכבר לכלובו.

שנית, מזריקים לכרית כף הרגל הימנית PBMC בתוספת allo antigen ולכרית כף הרגל השמאלית PBMC בתוספת allo antigen ובתוספת TT dt. יש לוודא שאין דליפה כ-18 עד 24 שעות לאחר ההזרקה. מרדימים כל עכבר באמצעות isof fluorine וחוזרים על מדידת הנפיחות של כרית כף הרגל.

חסרו את עובי כל כרית כף הרגל לפני ההזרקה מהערך לאחר ההזרקה כדי לקבל את ערך הנפיחות של כרית כף הרגל. לאחר מכן, חשבו את הנפיחות נטו הספציפית לאנטיגן על ידי חיסור ערך הנפיחות של כרית כף הרגל של הביקורת מערכי הנפיחות של כרית כף הרגל שהתקבלו מהטיפולים. ודאו כי קריאת הביקורת החיובית מראה תגובה חיובית לאנטיגן זיכרון TT DT של 25 times 10⁻⁴ inches ומעלה.

דרושה תגובת רקע ל-PBS כדי שהבדיקה תיחשב לתקפה. לאחר מכן, קבע את העכבה של תגובות הזיכרון בנוכחות אנטיגנים של התורם. ניסוי זה מעריך מקבלי השתלות כליה עבור תגובה ספציפית לאנטיגנים של התורם ועבור רגולציה.

קיימים שלושה דפוסים עיקריים של רגישות מאחרת (delayed type hypersensitivity) במקבלי השתלה: רגולטורי, לא-רגולטורי ורגיש (sensitized). כל המטופלים הגיבו בעוצמה לבקרת החיוביות של אנטיגן זיכרון (recall antigen) tt. מטופל מספר 62 מראה את הדפוס הרגולטורי, המאופיין בתגובה חלשה לאנטיגן התורם ובדיכוי מקושר בולט של התגובה לאנטיגן הזיכרון בנוכחות אנטיגן התורם.

זהו התבנית שנמצאה כקשורה לסבילות לש Transplant של איברים. מטופל מספר 48 מראה תבנית שאינה רגולטורית, המאופיינת בתגובה חלשה לתורם, אך ללא דיכוי מקושר. תבנית זו נצפתה לעיתים קרובות במטופלים הנוטלים תרופות אימונוסופרסיביות.

מטופל מספר שמונה מציג תבנית של רגישות לתורם, המאופיינת בתגובה גבוהה לאנטיגן של התורם וללא דיכוי מקושר. תגובה זו קשורה לדחיית השתל. במחקרי מקרה קליניים, נבדקו תאי BMCs של מטופלים שהשתתפו בניסוי תצפיתי כדי לבחון תגובות של מסלול עקיף ספציפי לתורם, תאי T effector ותאי T regulatory, וזאת במטרה להעריך את תפקידה של הרגולציה הספציפית לתורם בטולרנציה קלינית.

תגובות ה-T עקיפות לאנטיגנים של התורם חושפות ספקטרום מובחן בין קבוצות הגיוס. הנפיחות בכרית כף הרגל עולה ככל שהמצב הקליני של המטופל עובר מאלו שסובלים מסבילות לאלו שסובלים מדחייה כרונית. כאן, בדיקת הדיכוי המקושרת מודדת את מסלול ה-T הרגולטורי העקיף נגד התורם.

נתונים אלו מראים ירידה בתגובות הרגולטוריות בטווח שבין המטופלים הסובלניים ביותר, דרך מטופלים עם סובלנות בינונית, ועד למטופלים עם דחייה כרונית הפחות סובלניים ביותר. יחד, נראה כי לוויסות החיסוני, כפי שנמדד באמצעות בדיקת DTH trans vivo, מהווה מנגנון חשוב לקבלת השתל הכליתי.

תחום מבטיח הוא יישום בדיקת ה-TDTH לניטור של אוטואימוניות. המחקר שלנו על תפקידו של קולגן מסוג 5 בתהליך הפתולוגי של תסמונת bronchiolitis OBL חשף כי הסיכון היחסי הגבוה ביותר להתפתחות BOS נצפה במטופלים עם תגובה חיובית לקולגן 5 ב-pbmc ממקבלי השתלת ריאה, אך לא בביקורות בריאות או בקולגן.

ארבעה חולי תסמונת מרעה טובה (good pasture syndrome) שהגיבו לבדיקה לאחר השתלת כליה הראו תגובה תכופה לקולגן חמישה. ניתן להשתמש בבדיקת TDTH גם כדי לבחון את התגובתיות של pbmc מחולי סרטן לאנטיגנים ספציפיים לגידול. לדוגמה, נוכחותם של תאי T רגולטוריים ספציפיים ל-PAP בחולי סרטן ערמונית עשויה להגביל את התגובה לחיסון באנטיגן PAP.

בדיקת ה-TRANSVAAL DTH היא מבחן אבחוני חדשני עם יישום קליני להערכת תגובות חיסוניות תאית בקרב חולי השתלות, סרטן ומחלות אוטואימוניות. היא בעלת ערך רב כיוון שהיא אינה שימושית רק בניטור תגובות זיכרון של תאי T effector, אלא ניתן להשתמש בה גם לזיהוי תגובות של תאי T regulatory, מאחר שהיא אינה מסתמכת על מדידה של ציטוקין ספציפי לזיהוי תאי T אפקטורים או רגולטוריים. היא גמישה מאוד וניתנת ליישום רחב.