Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של Elegans Caenorhabditis 'נידות
May 2nd, 2013
שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה ב Elegans Caenorhabditis מתואר. שיטה זו מבוססת על תופעת neurophysiologic של תולעים המגיבים לשדות חשמליים קלים ("electrotaxis") בתוך ערוצי microfluidic. Microfluidic electrotaxis משמש כטכניקה מהירה, רגישה, בעלות נמוכה, וניתן להרחבה למסך לגורמים המשפיעים על בריאות עצבית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חריגות באיתות עצבי ועצבי-שרירי באורגניזם המודל של C Allergan בעקבות חשיפה כימית או מניפולציה גנטית. זה מושג על ידי תכנון וחריטה של תבנית מיקרו-ערוצים לתוך פרוסת סיליקון. במהלך השלב השני, תבנית הסיליקון משמשת ליציקת ערוץ מיקרו אחד או יותר מ-PDMS.
לאחר מכן רכיבי אביזרים מחוברים לתבנית ה-PDMS. לאחר מכן, התנהגות התולעים בזמן שהן מגרות לשחות דרך המיקרו-ערוץ מתועדת באמצעות מצלמה המותקנת במיקרוסקופ. בסופו של דבר, מיקרופלואידיקה אלקטרו משמשת לקביעת השינויים בנמטודות, במערכות העצביות והשרירים עקב מניפולציה כימית או גנטית עם תנועה כקריאה.
אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות, במיוחד מבחני ההתנהגות המבוססים על לוחות, הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן לשלוט היטב בכיוון התנועה של התולעת, מה שמאפשר כימות מדויק של התנהגויות הקטר כגון תדירות כיפוף הגוף, זמן סיבוב ומהירות שחייה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות ניווניות כמו פרקינסון ואלצהיימר מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לסנן גורמים כימיים וגנטיים בעלי תכונות נוירו-פרוטקטיביות. הרעיון לטכניקה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבנו שחסרה שיטה לניתוח התנהגות התנועה של השיטה בצורה כמותית.
התנועה היא רצונית ואקראית, וקשה לאפיין אותה. אז רצינו לבסס שיטה קלה שכולם יכולים ללמוד כדי לגרום לתבנית המאסטר להתחיל בשטיפה של פרוסת סיליקון בגודל 3 אינץ' באצטון ולאחר מכן מתנול למשך 30 שניות כל אחד. לאחר מכן שטפו את הוופל במים נטולי יונים למשך חמש דקות.
לאחר מכן, השתמש באקדח ניפוח חנקן כדי לייבש את משטח הוופלים ולאחר מכן לחמם את הוופל על פלטה חמה ב-120 מעלות צלזיוס לאחר שתי דקות, פלזמה מחמצנת את פני השטח של פרוסת הסיליקון ב-50 וואט למשך דקה אחת. כעת באמצעות שלושה מיליליטר של SU 8 100 התנגדות לצילום מצפים את משטח הוופל ב-1,750 סל"ד למשך 40 שניות, ולאחר מכן אופים מראש את הוופל המצופה על פלטה חמה ב-65 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות מעלים את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ואופים את הוופל במשך שעה נוספת.
לאחר הוצאת הוופל מהפלטה החמה, סדרו מסכת צילום בעיצוב הרצוי מעל הוופל. חשוף את עמידות הצילום לאור UV למשך 95 שניות. לאחר מכן אופים את הוופל על צלחת חמה תוך שימוש באותו שיפוע טמפרטורה המשמש לאפייה מראש לאחר האפייה.
טבלו את הוופל ב-SU שמונה. פתח פתרון למשך 10 עד 15 דקות. שוטפים את הוופל באיזופרופנול כדי לאשר את השלמת פיתוח העיצוב.
לאחר מכן יש לשטוף במים נטולי יונים למשך 30 שניות. לבסוף, מייבשים את הוופל בעזרת אקדח חנקן ואופים קצרות בחום של 120 מעלות צלזיוס. כעת, הניחו את תבנית המאסטר המפוברקת כמו גם פרוסת סיליקון ריקה בשתי צלחות פטרי נפרדות מרופדות בנייר אלומיניום.
יוצקים 20 מיליליטר של פולימר PDMS לתבנית ולצלחת המאסטר, ו -15 מיליליטר לתוך צלחת הוופל הריקה. לאחר מכן, לחץ בעדינות על הוופלים בעזרת מוליך עץ חד פעמי כדי לחסל כיסי אוויר מתחת לווופלים, ולאחר מכן כסה את שני הכלים והניח אותם בצד למשך יום לריפוי. לאחר שהפרוסות נרפאו, הסר את נייר הכסף וקילף את ה-PDMS.
לאחר מכן השתמש בחד-קרן האריס בגודל 2.5 מילימטר כדי לנקב יציאות גישה לנוזלים בשני קצוות התעלה ב-PDMS מתבנית המאסטר. חותכים את שני דיסקי ה-PDMS לרצועות בגודל דומה. ואז בחדר נקי, טען את התעלה, את רצועת ה- PDMS הריקה ושקופית זכוכית לתוך מחמצן פלזמה.
חשוף את החומרים לפלזמת חמצן בעוצמה של 40 וואט למשך 40 שניות. לאחר מכן הדביקו את חתיכת התעלה ואת מגלשת הזכוכית לצדדים מנוגדים של הרצועה הריקה והניחו את החומרים בצד להשלמת ההדבקה. לאחר שעתיים, השתמש בפולימר PDMS כדי לחבר שתי חתיכות של צינורות פלסטיק באורך של לפחות שישה סנטימטרים למאגרים המנוקבים על פלטה חמה ב-120 מעלות צלזיוס.
אפשר ל-PDMS להתרפא לפני שתמשיך. לאחר מכן הצמד מחבר פלסטיק נוזלי לאחד הצינורות כדי לאפשר חיבור מזרק. כעת, הכנס אורכי שלושה אינץ' של חוט נחושת מבודד בגודל 22 לכל מאגר בין צינור הכניסה לתעלה המאבטחת את החוטים עם יותר פולימר PDMS מראש.
התחל שלב זה על ידי הצבת המיקרו-ערוץ שהורכב זה עתה על שלב מטלטלין XY של מיקרוסקופ עם מצלמה מותקנת המחוברת לצג, חבר את ספק הכוח לאלקטרודות המיקרו-ערוצים. לאחר אישור שההתנגדות של המיקרו-ערוץ היא בסביבות 0.6 מגה אוהם, חבר את צינור הפלט של המיקרו-ערוץ למזרק חד פעמי. לאחר מכן טבלו את הפה של צינור הכניסה לתמיסה של נמטודות התלויות במאגר הפיזיולוגי M nine.
הפעל לחץ שלילי בתוך המזרק כדי לשאוב נוזל לתעלה. כאשר צינורות הכניסה והיציאה מלאים, נתק את המזרק וההידרוסטטי. תפעל את הזרימה על ידי התאמת הגובה היחסי של הצינורות כדי למקם תולעת במרכז התעלה.
לאחר מכן הנח את שני הצינורות שטוחים באותו גובה כדי לשמור על זרימה אפסית בתוך המיקרו-ערוץ. בעת החלפת דגימות תולעת במהלך ניסוי מוניות אלקטרו, לאחר פילוס שני צינורות הכניסה לאותו גובה, אם עדיין יש זרימה, בצע התאמות קטנות לגובה הצינור ביחס זה לזה. אם אי פעם איננו בטוחים אם הזרימה היא באמת אפס, אנו יכולים לגרום להיפוך בתנועת התולעת על ידי שינוי הקוטביות של השדה החשמלי ולאחר מכן הערכת המהירות הליניארית של התולעת כשהיא מסתובבת.
כעת הגדר את ספק הכוח למתח המתאים. הפעל את האות החשמלי ואפשר דקה אחת של חשיפה מוקדמת לתולעת להתאקלם בשדה שבמהלכו התולעת אמורה להתחיל לנוע לעבר הקתודה בחלוף הדקה. התחל להקליט.
בסיום הניסוי, הסר את כל הנוזלים והתולעים מהתעלה. שוטפים את החדר במים נטולי יונים ומשאירים את המכשיר על פלטה חמה בטמפרטורה של 125 מעלות צלזיוס לייבוש. בסרטון מייצג זה, מוצג ציר אלקטרו של נמטודות צעירות מסוג בר ומיקומו ומהירותו מתוכנת מעקב התולעים.
הסרטון מתחיל עם הקתודה מימין. המראה של פיפטת הזכוכית מעיד על ההיפוך המתקרב, ההסרה הבאה של אותות הפיפטה. רגע ההיפוך כאן, הנתונים עבור מיקום מול זמן ומהירות מיידית לעומת תפוקות זמן של תוכנית מעקב התולעת המותאמת אישית עבור התולעת בסרטון מוצגים התוכנית חישבה את עקומת המהירות מעקומת זמן המיקום.
תרשים קופסה זה מציג נתוני מהירות חשמלית מקבוצה של בעלי חיים פראיים ובעלי חיים טרנצ'גניים. בעלי החיים הטרנסגניים T מבטאים את הגן אלפא-סינוקלאין האנושי בשרירי דופן הגוף תחת שליטת מקדם הגנים הכבדים של מיוזין UNC 54, הגורם לצבירת חלבונים ומתבטא בתגובה אלקטרו טקטית איטית יותר מזו של חיות בר. לאחר השליטה, ניתן לבחון יותר מ-20 תולעים בכל שעה אם ניסוי המוניות החשמליות מבוצע כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שרק מוטציות וכימיקלים המשפיעים על תנועה או תחושת אלקטרו ייצרו פנוטיפים הניתנים לזיהוי על ידי מבחן המסים החשמליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב סיליקון. הרכבנו תעלה מיקרופלואידית וכיצד לנתח תנועה של שיטת N באמצעות בדיקת axxis.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה מיקרו-אלקטרו-פלואידית חצי אוטומטית לגרימת תנועה לפי דרישה ב-Caenorhabditis elegans. הטכניקה מנצלת את תופעת האלקטרוטקסיס, ומאפשרת סינון מהיר של גורמים המשפיעים על בריאות עצבית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי העצב
- מיקרו-פלואידיקה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודלי לחקר איתות עצבי ועצבי-שריר.
- אלקטרוטקסיס היא תגובה נוירופיזיולוגית לשדות חשמליים.
- ערוצים מיקרו-פלואידיים מאפשרים ניסויים מבוקרים על אורגניזמים קטנים.
- הבנת תנועה יכולה לחשוף תובנות לגבי בריאות עצבית.
מטרת המחקר
- לזהות חריגות באיתות עצבי ועצבי-שריר.
- להעריך את ההשפעות של חשיפה כימית או מניפולציה גנטית.
- להשתמש בתנועה כתוצאה לשינויים עצביים ושרירייים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תכנון וחריטה של דפוסי ערוצים מיקרו בלוחות סיליקון.
- יציקת ערוצים מיקרו מ-PDMS באמצעות תבניות סיליקון.
- חיבור רכיבי עזר לתבנית ה-PDMS.
- הקלטת התנהגות התולעים באמצעות מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- גרימה מוצלחת של תנועה ב-C. elegans באמצעות אלקטרוטקסיס.
- זיהוי שינויים במערכות עצביות ושריריות.
- הוכחה של אלקטרוטקסיס מיקרו-פלואידי כשיטת סינון ניתנת להרחבה.
- תובנות לגבי ההשפעות של מניפולציות גנטיות וכימיות.
מסקנות
- אלקטרוטקסיס מיקרו-פלואידי הוא כלי חשוב למחקר מדעי העצב.
- שיטה זו מספקת גישה רגישה וחסכונית לחקר בריאות עצבית.
- יישומים נוספים יכולים לשפר את ההבנה של הפרעות עצבי-שריריות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative locomotion analysis in C. elegans enables high-throughput screening for neuroprotective compounds and genetic modifiers in neurodegenerative disease models. By converting neuronal signaling defects into measurable electrotactic responses, this method supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The microfluidic format provides scalable, reproducible phenotypic readouts that improve predictive confidence in lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking dopaminergic neuron function to quantifiable locomotion phenotypes.
- Operational Value: Enables rapid assessment of genetic and chemical manipulations affecting neuronal signaling with on-demand electrotaxis stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue movement defects in PD models before costly mammalian studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs such as swimming speed and body bend frequency for assay readiness.
- Operational Value: Facilitates automation potential with microfluidic control of worm positioning and field polarity reversal for reversal time measurements.
- Scalability: Permits screening of over 20 worms per hour, enabling efficient primary screens for neuroprotective factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses locomotion as a disease-relevant functional readout that correlates with dopaminergic neurodegeneration in C. elegans PD models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes neurotoxic effects from general toxicity by isolating neuronal signaling defects via electrotactic response alterations.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying age-dependent electrotactic variability in young adults versus larvae.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic electrotaxis assay integrates into discovery workflows as a phenotypic screening platform between target hit confirmation and lead optimization, providing mechanistic insights on neuronal viability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective genes and compounds by quantifying locomotor recovery in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative locomotion metrics that enable Z'-factor assessment and assay robustness evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved position and velocity outputs for kinetic analysis of electrotactic response dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent response variations relevant to late-onset neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of neuronal modulators across diverse genetic backgrounds and strain backgrounds like C. briggsae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal screening by isolating locomotion as a specific readout for neuromuscular function.
- Operational Value: Standardizes worm handling and stimulus delivery, minimizing variability from manual assays and enabling cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating go/no-go decisions through early phenotypic profiling of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-responsive electrotactic recovery in transgenic models expressing human disease proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including photolithography and PDMS bonding techniques.
- Depends on access to microscope-mounted camera systems and programmable power supplies for precise electric field control.
- Necessitates standardization of worm preparation protocols, including age synchronization and M9 buffer conditioning.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other nematode species or varying channel geometries.
- Limited to detecting phenotypes that affect locomotion or electro-sensation, as confirmed by source material noting that only such mutations or chemicals yield detectable responses.
