Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של
2 במאי 2013
שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה ב Elegans Caenorhabditis מתואר. שיטה זו מבוססת על תופעת neurophysiologic של תולעים המגיבים לשדות חשמליים קלים ("electrotaxis") בתוך ערוצי microfluidic. Microfluidic electrotaxis משמש כטכניקה מהירה, רגישה, בעלות נמוכה, וניתן להרחבה למסך לגורמים המשפיעים על בריאות עצבית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חריגות באותות עצביים ונוירו-שריריים באורגניזם המודל של C Allergan בעקבות חשיפה כימית או מניפולציה גנטית. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון ותעיית תבנית של מיקרו-תעלות בתוך פרוסת סיליקון. בשלב השני, תבנית הסיליקון משמשת ליציקה של מיקרו-תעלות אחת או יותר מ-PDMS.
לאחר מכן, רכיבים נלווים מחוברים לתבנית ה-PDMS. בשלב הבא, התנהגות התולעים בעת שהן מגוררות לשחות דרך המיקרו-תעלה מוקלטת באמצעות מצלמה המורכבת על מיקרוסקופ. לבסוף, נעשה שימוש במיקרו-פלואידיקה חשמלית כדי לקבוע את השינויים בנמטודות, במערכות העצביות ובמערכות השרירים כתוצאה ממניפולציה כימית או גנטית, כאשר התנועה משמשת כמדד (readout).
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות, ובמיוחד בדיקות התנהגות מבוססות פלטה, הוא שבמסגרתה ניתן לשלוט באופן הדוק בכיוון התנועה של התולעת, מה שמאפשר כימות מדויק של התנהגויות מוטוריות כגון תדירות כיפוף הגוף, זמן סיבוב ומהירות שחייה. המשמעויות של טכניקה זו חוללות לטיפול בהפרעות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון ואלצהיימר, מכיוון שניתן להשתמש בה לסריקה של גורמים כימיים וגנטיים בעלי תכונות נוירו-פרוטקטיביות. הרעיון לטכניקה זו עלה לראשונה כאשר הבנו שחסרה שיטה לניתוח התנהגות התנועה של התולעת באופן כמותי.
התנועה היא רצונית ואקראית, וקשה לאפיין אותה. לכן, רצינו לבסס שיטה פשוטה שכל אחד יכול ללמוד. כדי להכין את תבנית המאסטר, התחילו בהשריית פרוסת סיליקון של 3 inch באצטון ולאחר מכן במתנול למשך 30 שניות כל אחת. לאחר מכן, שטפו את הפרוסה במים דה-יוניים למשך חמש דקות.
בשלב הבא, השתמש בנשיב חנקן כדי לייבש את פני השטח של הפרוסות ולאחר מכן חמם את הפרוסה על פלטה חמה בטמפרטורה של 120 °C למשך שתי דקות; בצע חמצון פלזמה לפני השטח של פרוסת הסיליקון בהספק של 50 watts למשך דקה אחת. כעת, באמצעות 3 mL של פוטורזיסט SU eight 100, בצע ציפוי ספינ (spin coat) לפני השטח של הפרוסה במהירות של 1,750 RPM למשך 40 שניות, ולאחר מכן בצע אפייה מקדימה (pre-bake) לפרוסה המצופה על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 °C. לאחר 10 דקות, הגדל את הטמפרטורה ל-95 °C במהלך שתי דקות ואפה את הפרוסה למשך שעה נוספת.
לאחר הוצאת הפרוסה מהפלטה החמה, מקמו מסכת פוטו (photo mask) בעיצוב הרצוי מעל הפרוסה. חשפו את הפוטורזיסט (photo resist) לאור UV למשך 95 שניות. לאחר מכן, בצעו אפייה לאחר חשיפה (post bake) לפרוסה על פלטה חמה, תוך שימוש באותו מדרג טמפרטורות ששימש לאפייה המוקדמת.
טבול את הפרוסה ב-SU-8. פתח את התמיסה במשך 10 עד 15 דקות. שטוף את הפרוסה באיסופרופנול כדי לוודא את השלמת פיתוח התכנון.
לאחר מכן, שטפו במים דה-יוניים למשך 30 שניות. לבסוף, ייבשו את הפרוסה באמצעות אקדח חנקן ובקלו למשך זמן קצר בטמפרטורה של 120 °C. כעת, הניחו את תבנית המאסטר שהוכנה ואת פרוסת סיליקון ריקה בשתי צלחות פטרי נפרדות המרופפות בנייר אלומיניום.
שפוך 20 milliliters של PDMS pre polymer אל תוך התבנית הראשית (master mold) והצלחת, ו-15 milliliters אל תוך צלחת ה-blank wafer. לאחר מכן, לחץ בעדינות על ה-wafers בעזרת אפליקטור עץ חד-פעמי כדי לסלק בועות אוויר שנותרו מתחת ל-wafers, ולאחר מכן כסה את שתי הצלחות והשאר אותן בצד למשך יום לצורך פילמור (cure). לאחר שה-wafers עברו פילמור, הסר את הרדיד וקלף את ה-PDMS.
לאחר מכן, השתמשו ב-Harris unicorn בקוטר 2.5 millimeter כדי להכין פתחי גישה לנוזלים בשני קצות התעלה ב-PDMS מהתבנית המקורית. חתכו את שני דיסקי ה-PDMS לרצועות בגודל דומה. לאחר מכן, בחדר נקי, הכניסו את התעלה, את רצועת ה-PDMS הריקה ואת תגית הזכוכית למכשיר חמצון בפלזמה.
חשפו את החומרים לפלזמה של חמצן בהספק של 40 watts למשך 40 שניות. לאחר מכן, הדביקו את חלק התעלה ואת פלטת הזכוכית לצדדים מנוגדים של רצועת הבסיס והניחו לחומרים בצד להשלמת ההדבקה. לאחר שעתיים, השתמשו ב-PDMS pre polymer כדי לחבר שני קטעי צינור פלסטיק באורך של לפחות שש אינצ'ים למאגרי המכסה על גבי פלטה מחממת בטמפרטורה של 120 °C.
המתינו להתבשרות ה-PDMS לפני ההמשך. לאחר מכן, חברו מחבר פלסטיקי לנוזלים לאחד הצינורות כדי לאפשר חיבור של מזרקים. כעת, הכניסו חוטים של נחושת מבודדת בכישול 22 באורך שלושה אינצ'ים לכל מאגר, בין צינור הכניסה לתעלה, וקבעו את החוטים באמצעות פולימר מקדים נוסף של PDMS.
התחילו שלב זה על ידי הנחת המיקרו-ערוץ שהורכב זה עתה על במה ניידת מסוג XY של מיקרוסקופ עם מצלמה מותקנת המחוברת למסך, וחברו את ספק הכוח לאלקטרודות של המיקרו-ערוץ. לאחר וידוא שההתנגדות של המיקרו-ערוץ היא כ-0.6 mega ohms, חברו את צינור המוצא של המיקרו-ערוץ למזרק חד-פעמי. לאחר מכן, טבלו את פיית צינור הכניסה לתוך תמיסה של נמטודות התלויות בבופר פיזיולוגי M nine.
יש להפעיל לחץ שלילי בתוך המזרק כדי לשאוב נוזל אל תוך התעלה. כאשר צינורות הכניסה והיציאה מלאים, יש לנתק את המזרק ואת מערכת ההידרוסטטיקה. ניתן לשלוט בזרימה על ידי כיוון הגובה היחסי של הצינורות כדי למקם תולעת במרכז התעלה.
לאחר מכן, הנח את שני הצינורות במצב אופקי ובגובה זהה כדי לשמור על זרימה אפסית בתוך המיקרו-עתב. בעת החלפת דגימות תולעים במהלך ניסוי של אלקטרוטקסיס, לאחר השוואת הגובה של שני צינורות הכניסה, אם עדיין קיימת זרימה, בצע התאמות קטנות לגובה הצינורות ביחס זה לזה. אם איננו בטוחים אם הזרימה היא אכן אפסית, ניתן להשרות היפוך בתנועת התולעת על ידי שינוי קוטביות השדה החשמלי ולאחר מכן להעריך את המהירות הליניארית של התולעת בעוד היא פונה.
כעת הגדירו את ספק הכוח למתח המתאים. הפעילו את האות החשמלי והמתינו דקה אחת של חשיפה מוקדמת כדי שהתולעת תסתגל לשדה; במהלך זמן זה, על התולעת להתחיל לנוע לכיוון הקתודה. לאחר שתעבור הדקה, התחילו בהקלטה.
עם סיום הניסוי, הסירו את כל הנוזל והתולעים מהתעלה. שטפו את התא במים דה-יוניים והשאירו את המכשיר על פלטה מחממת בטמפרטורה של 125 °C לייבוש. בסרטון מייצג זה, מוצגים נמטודות בוגרות צעירות מסוג wild type בתוך ציר חשמלי, וכן פלטי המיקום והמהירות שלהן מתוכנת מעקב התולעים.
הסרטון מתחיל כאשר הקתודה נמצאת מימין. הופעת הפיפטה מזכוכית מעידה על ההיפוך הקרב, והסרת הפיפטה לאחר מכן מסמנת את רגע ההיפוך. כאן מוצגים הנתונים של מיקום לעומת זמן ומהירות רגעית לעומת זמן שנוצרו על ידי תוכנת מעקב התולעים המותאמת אישית עבור התולעת שבסרטון; התוכנה חישבה את עקומת המהירות מעקומת המיקום-זמן.
תרשים קופסה זה מציג נתוני מהירות אלקטרוטקסיס מקבוצה של בעלי חיים מסוג פרא (wild type) ובעלי חיים טרנסגניים. בעלי החיים הטרנסגניים מבטאים את הגן האנושי alpha-synuclein בשרירי דופן הגוף תחת שליטתו של פרומוטור הגן UNC 54 myosin heavy chain, דבר הגורם לצבירה של חלבונים ומתבטא בתגובה אלקטרוטקטית איטית יותר מזו של בעלי חיים מסוג פרא. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבחון למעלה מ-20 תולעים בכל שעה, בתנאי שניסוי האלקטרוטקסיס בוצע כהלכה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי רק מוטציות וחומרים כימיים המשפיעים על תנועה או על תחושה חשמלית יייצרו פנוטיפים שניתן לזהות באמצעות בדיקת האלקטוטקסיס. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מעצבים סיליקון, מרכיבים תעלה מיקרופלואידית ומנתחים תנועה של N. methurat באמצעות בדיקת אלקטוטקסיס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה מיקרו-אלקטרו-פלואידית חצי-אוטומטית להשראת תנועה לפי דרישה ב-Caenorhabditis elegans. הטכניקה מנצלת את תופעת האלקטרוטקסיס, ובכך מאפשרת סריקה מהירה של גורמים המשפיעים על בריאות נוירונלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מיקרופלואידיקה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל לחקר סיגנלינג עצבי ונוירו-שרירי.
- אלקטורוטקסיס היא תגובה נוירופיזיולוגית לשדות חשמליים.
- תעלות מיקרופלואידיות מאפשרות ניסויים מבוקרים באורגניזמים קטנים.
- הבנת הלוקומוציה יכולה לחשוף תובנות לגבי בריאות נוירונלית.
מטרת המחקר
- לזיהוי הפרעות באותות עצביים ונוירו-שריריים.
- להערכת השפעות של חשיפה כימית או מניפולציה גנטית.
- לניצול התנועתיות כמדד לשינויים עצביים ושריריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וחריטה של תבניות מיקרו-ערוצים בתוך פרוסות סיליקון.
- יציקת מיקרו-ערוצים מ-PDMS באמצעות תבניות סיליקון.
- חיבור רכיבי עזר לתבנית ה-PDMS.
- הקלטת התנהגות תולעים באמצעות מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של תנועה ב-C. elegans באמצעות אלקטרוטקסיס.
- זיהוי שינויים במערכות העצבים והשרירים.
- הדגמה של אלקטרוטקסיס במיקרופלואידקה כשיטה ניתנת להרחבה לסריקה.
- תובנות לגבי השפעות של מניפולציות גנטיות וכימיות.
מסקנות
- אלקטרוטקסיס במיקרופלואידקה הוא כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- שיטה זו מספקת גישה רגישה ובעלות נמוכה לבדיקת בריאות נוירונלית.
- יישומים נוספים עשויים לשפר את ההבנה של הפרעות נוירומוסקולריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של תנועה ב-C. elegans מאפשר סריקה בthroughput גבוה של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות ומודיפיקטורים גנטיים במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. על ידי המרה של פגמים באיתות עצבי לתגובות אלקטרוטקטיות מדידות, שיטה זו תומכת בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. הפורמט המיקרופלואידי מספק תוצאי פנוטיפ שניתן לשכפל ולהרחיב, ובכך משפר את הביטחון החזוי בקמפיינים לזיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי קישור תפקוד נוירונים דופמינרגיים לפנוטיפים של תנועה הניתנים לכימות.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה מהירה של מניפולציות גנטיות וכימיות המשפיעות על סיגנל נוירונלי באמצעות גירוי אלקטרוטקסי לפי דרישה.
- ערך חזוי: תומך במיון של פורטפוליו תרופות על ידי זיהוי תרכובות המשקמות פגמי תנועה במודלים של PD לפני מחקרים יקרים ביונקים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים, כגון מהירות שחייה ותדירות כיפוף הגוף, לצורך מוכנות הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר פוטנציאל לאוטומציה באמצעות בקרה מיקרופלואידית של מיקום התולעים והיפוך קוטביות השדה למדידת זמני היפוך.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר סריקה של למעלה מ-20 תולעים בשעה, ובכך מאפשר סריקות ראשוניות יעילות של גורמים נוירו-פרוטקטיביים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- המשכיות תרגומית: משתמש בתנועה כמדד תפקודי רלוונטי למחלה, המתואם עם ניוון עצבי דופמינרגי במודלים של PD ב-C. elegans.
- הסרת סיכונים מכניסטיים: מבחין בין השפעות נוירוטוקסיות לבין רעילות כללית על ידי בידוד פגמים באותות עצביים באמצעות שינויים בתגובה אלקטרוטקטית.
- התאמה למסמני ביולוגיים: תומך בפיתוח מסמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי כימות שונות אלקטרוטקטית תלוית-גיל בצעירים מול זחלים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
בדיקת האלקטוטקסיס המיקרופלואידית משולבת בתהליכי הגילוי כפלטפורמה לסריקה פנוטיפית בין אישור המטרה (hit confirmation) לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי חיוניות נוירונלית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי גנים ותרכובות נוירופרוטקטיביות על ידי כימות ההתאוששות המוטורית במודלים של מחלות.
- סריקה: מספק מדדי תנועה כמותיים הניתנים לשחזור, המאפשרים הערכה של Z'-factor ובדיקת חסינות (robustness) של המערך.
- אנליטיקה: מספק נתוני מיקום ומהירות ברזולוציית זמן לצורך ניתוח קינטי של דינמיקת תגובה אלקטרוטקטית.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף הפרה-קליני על ידי מידול וריאציות בתגובה התלויות בגיל, הרלוונטיות לניוון עצבי המופיע בשלב מאוחר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לסריקה רב-פרויקטית של מודולטורים נוירונליים על רקעים גנטיים מגוונים ורקעי זנים כגון C. briggsae.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בסריקה נוירונלית על ידי בידוד התנועה כמדד ספציפי לתפקוד נוירו-שרירי.
- ערך תפעולי: מייעל ומכשיר את הטיפול בתולעים ואת הגשת הגירוי, ובכך מקטין את השונות הנובעת מבדיקות ידניות ומאפשר הדירות בין אתרי מחקר שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי האצת החלטות המשך (go/no-go) באמצעות פרופילינג פנוטיפי מוקדם של מועמדים לנוירופרוטקציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של פגיעות (hits) בהתבסס על התאוששות אלקטרוטקטית תלוית-מינון במודלים טרנסגניים המבטאים חלבוני מחלה אנושיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור התקנים מיקרופלואידיים, כולל פוטוליתוגרפיה וטכניקות הצמדה של PDMS.
- תלוי בגישה למערכות מצלמה המורכבות על מיקרוסקופ ולספקי כוח תכנותיים לבקרה מדויקת של השדה החשמלי.
- מצריך סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת התולעים, כולל סנכרון גילים והתניה בבופר M9.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הבדיקה למיני נמטודות אחרים או לגיאומטריות ערוצים משתנות.
- מוגבל לגילוי פנוטיפים המשפיעים על התנועה או על החישה החשמלית, כפי שאישרו חומרי המקור שרק מוטציות או כימיקלים כאלה מניבים תגובות ניתנות לגילוי.
