מדידת תאיים Ca

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד תנודות של סידן תוך-תאי בזרע אנושי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. הדבר משיג תחילה על ידי הכנת דגימת הזרע בשיטת ה-swim up ובמידת הצורך, עידוד קפציתציה. השלב השני הוא טעינת תאי הזרע בצבע פלואורסצנטי לסידן.

בשלב הבא, באמצעות פלואורומטריית זרימה עצירה (stopped flow fluorometry) קונבנציונלית, ציטומטריית זרימה או דימוי של תא בודד, בצעו את הניסוי ורשמו את מדידות הסידן. לבסוף, התוצאות מנותחות כדי לקבוע שינויים בריכוזי הסידן התוך-תאיים שעוררו על ידי פרוגסטרון או במהלך תהליך הקפציתציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו הכוללות רדיואקטיביות, הוא שמדובר בהליך רגיש מאוד.

הביצוע בטוח וקל. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום איתוחי הסיגנלינג של הסידן ב-SPR, כגון זיהוי תרכובים המעודדים עלייה בסידן התוך-תאי ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, וזיהוי תתי-אוכלוסיות תאיות שונות בדגימת זרע. המשמעויות של שימוש, למשל, בטכניקת ציטומטריית זרימה, הן רחבות ומגיעות עד לאבחון בעיות פוריות באמצעות ניתוח המצב הפיזיולוגי של גמטות זכריות.

אף על פי ששיטה זו יכולה לספק תובנות למחקר של גיוס סידן בזרע אנושי, ניתן להחילה אותה גם על סוגים אחרים של תאים, כגון גמטות זכריות ממינים אחרים או סוגי תאים שונים, כגון נוירונים או תאי שריר. בדרך כלל, אנשים המשתמשים בשיטה זו יתקלו בקושי כיוון שטיפול בזרע אינו פשוט, וחשוב לשמור על תנאים מתאימים כדי להבטיח תאים חיוניים וניידים לאורך הניסוי. אנו יישמנו את השימוש בטכניקות אלו על ידי שילוב של אסטרטגיות מתחומים שונים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה, מאחר שהכנה וטיפול בדגימה, כמו גם הוספת התרכובות, קשים ללימוד מכיוון שתאי זרע עלולים להינזק במהלך הפרוצדורה ואסרטפקטים בתגובות עלולים להתקבל במהלך הוספת התרכובות. כדי להכין את דגימת הזרע, יש להניח בזהירות שכבה של 1 mL של מצע hams F 10 מעל כל 500 µL של זרע מנוזל. יש לגעת בדופן המבחנה עם קצה המיקרופיפט ולהזרים בעדינות את המצע מעל הדגימה.

חשוב לבצע זאת באיטיות כדי למנוע ערבוב של שכבות הדגימה והמצע. המצע מועשר ב-2 mM calcium chloride ו-5 mg/mL BSA. כדי לעודד קיבול (capacitation) in vitro, הגו את המבחנות בזהירות לזווית של כ-30 מעלות.

פעולה זו תגדיל את שטח הפנים בין שני הנוזלים, ובכך תגביר את התזוזה או השחייה למעלה של תאי הזרע מהדגימה אל המצע במהלך הדגירה. לאחר מכן, הניחו את מבחנות הבדיקה בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובתערובת של 5% carbon dioxide ו-95% air למשך שעה אחת.

השתמשו במיקרו-פיפט כדי להוציא בזהירות מכל מבחנה את 700 המיקרוליטרים העליונים של מדיום hams F 10 המכילים כעת זרעונים ניידים. רכזו את כל הדגימות שנאספו למבחנת זכוכית נקייה אחת, תוך הימנעות מיצירת בועות. הניחו 10 מיקרוליטרים מהדגימה המרוכזת על הזכוכית השטוחה האופטית של בסיס תא ספירה מקולרית והניחו את זכוכית הכיסוי.

יש לוודא שאינן נוצרות בועות בתוך התא, שכן הדבר יוביל לספירת תאים שגויה. יש לבחון תחת מיקרוסקופ אור עם עדשה אובייקטיבית של 20 x. זכוכית הכיסוי של תא ספירת מקלאריא כוללת ריבוע גדול המורכב מ-100 ריבועים קטנים יותר.

ספרו את התאים בכל רצועה של 10 ריבועים. מספר זה מייצג את ריכוז התאים במיליוני תאים למילילטר. חזרו על הספירה בשתי רצועות נוספות של 10 ריבועים וחשבו את הממוצע של שלושת הספירות כדי להטעין את התאים בצבע פלואורסצנטי.

שלבו בתוך פרועת צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר את הנפח הנדרש של תרחיף תאי הזרע יחד עם כמות מספקת של תמיסת מלאי של 1 mM Fluo-3 AM כדי להגיע לריכוז סופי של 2 µM Fluo-3 AM. הדגרימו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C תוך הגנה מאור. צנטריפוגו את הפרועת ב-750 ×g למשך חמש דקות. היווצרות ענן במקום משקא מעידה על כך שהתאים נמצאים במצב טוב. שאבו והשליכו את העלייה, וסספנדו מחדש את המשקא בנפח המתאים של מצע לזרע אנושי (HSM). כדי להתחיל בניסוי זה, שלבו בתוך מבחנה מזכוכית בעלת תחתית שטוחה 570 µL של HSM ו-30 µL של תרחיף תאי זרע שהוטענו מראש ב-Fluo-3 AM וסספנדו מחדש ב-HSM, כדי להגיע לריכוז של 1 × 10⁸ תאים למיליליטר.

הניחו מגנט Stir bar בתוך המבחנה מזכוכית והכניסו את המבחנה לתא הקריאה של הספקטרומטר, שחומם מראש ל-37 °C. יש לערבב את הדגימה לאורך כל זמן הרכישה. התחילו את הניסוי באמצעות תוכנת ה-oli והמשיכו לרכוש ערכי פלואורסצנציה בתדירות של 0.5 hertz למשך 300 שניות.

לאחר רכישת פלואורסצנציית בסיס למשך 30 שניות, השתמש במזריק מיקרו של Hamilton כדי להזריק את הנפח המתאים של תרכובת הבדיקה, ובמקרה זה פרוגסטרון בריכוז מיקרומולרי בשנייה ה-100. השתמש ב-ionomycin בריכוז 20 מיקרומולרי כביקורת חיובית כדי לקבל את ערך הפלואורסצנצייה המקסימלי. בניסוי זה, שינויים ברמות הסידן התוך-תאי נמדדים ברזולוציה זמנית גבוהה.

באמצעות מערבל זרימה עצורה מסוג SFM 20 המחובר למערכת אופטית לקינטיקה מהירה, מלאו את אחת מזרקי המכשיר במיליליטר אחד של תאי זרע טעונים ב-flu. 3:00 AM ואת המזרק השני במיליליטר אחד של התרכובת לבדיקה: 20 µM פרוגסטרון המומס ב-HSM.

בדוגמה זו, חיוני למנוע היווצרות בועות בעת שאיבת הנוזלים למזרקים. הרם את שני בוכנות המכשיר עד שייגעו בקצות הבוכנות של המזרקים. הגדר את זמן הדגימה הכולל במקרה זה ל-50 seconds ואת התדירות ל-10 milliseconds כדי למזער את הנזק לתאים, והגדר את קצב הזרימה לערך המינימלי שיספק טריגר לתגובה מדידה.

בעת ערבוב הריאגנטים, עקבה של פלואורסצנציה גולמית לעומת זמן תוצג על מסך המחשב. חזור על הליך זה תוך החלפת הפרוגסטרון ב-HSM כביקורת שלילית וב-10 micromolar ion mycin כביקורת חיובית לפני ביצוע ציטומטריה זרימתית. הכן את הדגימות הניסיוניות על ידי העברה של 500 microliters של תרחיף תאים לכל מבחנת ציטומטר תחת כל תנאי שייבדק.

הגדירו ניסוי באמצעות תוכנת הציוד. ראשית, צרו תיקייה חדשה, דגימת ניסוי ומספר מבחנות. לאחר מכן, בחרו הגדרות ציטומטר מתאימות עבור flu O 3:00 AM. השתמשו במסנני fluorescein isothiocyanate ו-propidium iodide.

העבירו את מבחנות הבקרה ללא צבע, אחת ושתיים, דרך הציטומטר. אספו נתוני פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צד (side scatter) כדי לוודא שהגדרות הסף מתאימות, וכדי ליצור את השער (gate) המתאים להפרדה בין פסולת לתאים. העבירו את מבחנות הניסוי ואספו נתוני פלואורסצנציה מ-10,000 אירועים לכל דגימה.

בסיום, ייצאו את כל הנתונים לתוכנה הזמינה לניתוח. הכינו לוחות כיסוי עגולים הדרושים להליך זה על ידי הנחת טיפה של 5 µL של תמיסת poly L lysine במרכזו של כל לוח כיסוי.

השאירו למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש, ולאחר מכן שטפו את האזור המטופל במים. פעולה זו תסיר את עודפי הפוליליזין ותאפשר לתאי זרע להיקשר לזכוכית הכיסוי דרך ראשם, בעוד ששוטים עדיין יכולים לנוע. הרכיבו את זכוכית הכיסוי בתוך תא ההקלטה.

העבירו 10 µL של תאים טעונים ב-flu oh 3:00 AM בריכוז של 1×10⁷ תאים ל-mL למרכז הזכוכית המכסה (cover slip). כסו את התאים ב-200 µL של HSM שחומם מראש.

הנח את התא על במת המיקרוסקופ, שחוממה מראש ל-37 °C, ובחן את התאים באמצעות ניגודיות פאזה (phase contrast). בחר אזור שבו צפיפות התאים מתאימה לדימוי. ריכוז גבוה מדי של תאים מקשה על האנליזה בשל חפיפה של אותות.

התאים צריכים להיות מודבקים בחוזקה לכיסוי הזכוכית (cover slip) באמצעות ראשם, אך להפגין תנועת שוטים, המעידה על חיוניות. התחילו את הניסוי על ידי הפעלת התוכנה לרכישת סדרת תמונות בזמן (time series image acquisition).

רכשו תמונות פלואורסצנציה במצב חי (live mode). כדי לכוון את המיקוד והבהירות, השתמשו במיקרופיפט כדי להוסיף בזהירות ובטפטוף את התרכובת הנבדקת, במקרה זה פרוגסטרון, והמשיכו ברכישת התמונות לפי הצורך.

בצע שתי הוספות בקרה רצופות לאותה תא. 20 µM ion mycin להשגת פלואורסצנציה מקסימלית ו-5 mM manganese chloride להשגת פלואורסצנציה מינימלית. בצע ניתוח תמונות באופן לא מקוון (offline) באמצעות תוכנת IQ.

שרטטו את אזורי העניין (ROIs) סביב כל תא או חלק מתא. בנוסף, בחרו אזור נטול תאים לצורך הפחתה אוטומטית של הרקע על ידי התוכנה. לאחר מכן תתקבל סדרת עוצמת פלואורסצנציה לאורך זמן עבור כל ROI, וניתן לייצא נתונים אלו ל-Microsoft Excel לצורך ניתוח נוסף.

פרוגסטרון הוא אחד ממשרשיי תגובת האקרוזום המוכרים, וכצפוי הוא מעורר עלייה חולפת בריכוז הסידן התו-תאי בזרע אנושי, כפי שנמדד באמצעות פלואורומטריה קונבנציונלית. עקומת הפלואורסצנציה האדומה לעומת זמן מראה שינויים בריכוז הסידן התו-תאי שנגרמו מהוספת 4 µM פרוגסטרון; כשליטה שלילית הוסף HSM, אשר לא גרם לכל שינוי ברמות ריכוז הסידן התו-תאי, כפי שמופיע בעקומת הפלואורסצנציה הכחולה. כשליטה חיובית, מוצג בכל עקומה השינוי שנגרם על ידי 10 µM ionomycin.

הוספה של יונופור סידן זה גורמת לעלייה מקסימלית בריכוז הסידן התאי ב-RA, שאינה חוזרת לרמות הבסיס. גרף עמודות זה מציג את השינוי הממוצע בפלואורסצנציה delta F מכל תנאי, פלוס או מינוס שגיאה סטנדרטית כאשר N שווה לשלושה, והכוכבית מציינת ערך P של פחות מ-0.001 בהשוואה לקבוצת הביקורת. העלייה בריכוז הסידן התאי המושרה על ידי פרוגסטרון נמדדה ברזולוציה זמנית גבוהה יותר באמצעות פלואורומטריה של זרימה עצורה (stopped flow fluorometry), ותוצאות מייצגות מוצגות כאן.

העקומות הגולמיות מוצגות בפאנל A; הן פרוגסטרון, המיוצג על ידי הקו האדום, והן ion mycin, המיוצג על ידי הקו הכחול, גרמו לעלייה מהירה בריכוז הסידן התוך-תאי. העקומה הירוקה היא בקרת השלילה שבה התאים ערבבו עם HSM. פאנל B מציג עקומות מתוקנות עבור האותים שהושרגו על ידי פרוגסטרון או ion mycin, שהתקבלו על ידי חיסור אות הבקרה מהאותים הגולמיים המתאימים להם.

פרוגסטרון גרם לעלייה מהירה וחולפת בריכוז הסידן התאי, כאשר ערך הפלואורסצנציה המקסימלי הופיע 2.7 שניות לאחר הוספת המשרה. לעומת זאת, CIN גרם לעלייה מהירה ומתמשכת בריכוז הסידן התאי לאורך 50 שניות. המלבן בלוח B מציג תצוגה מורחבת של 500 המילי-שניות הראשונות עבור כל תגובה.

העובדה שלא נצפתה השהיה בעלייה בריכוז הסידן התוך-תאי המושרה על ידי פרוגסטרון עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המצביעים על כך שפרוגסטרון מפעיל ישירות את תעלת הסידן cat sperm ללא סיגנלינג מתווך. ריכוז הסידן התוך-תאי נמדד גם בזרע אנושי שעבר קבסציה (capacitation) ובזרע שלא עבר קבסציה באמצעות ציטומטריית זרימה. בתרשימי פיזור אלו של פיזור קדמי וצידי מייצגים.

תאים שעברו קפצייטציה (Capacitated) מופיעים בכחול ותאים שלא עברו קפצitatציה מופיעים באדום. השער (gate) שנבחר מסומן בקו הכחול ורק התאים בתוך אזור זה שימשו להמשך הניתוח. פאנל B מציג את היסטגרמת הפלואורסצנציה בערוץ Fitzy מזרה של תאי זרע שלא נצבעו, ופאנל D מציג את היסטגרמת הפלואורסצנציה בערוץ FZ מזרה של תאי זרע שנצבעו ב-flu oh 3:00 AM כפי שנראה בפאנל D. התפלגות ערכי הפלואורסצנציה עבור תאי זרע שעברו קפצייטציה, המיוצגת על ידי העקומה הכחולה, מוסטת לערכים גבוהים יותר בהשוואה לתאי זרע שלא עברו קפצייטציה, המיוצגים על ידי העקומה האדומה.

פאנל C מציג את היסטוגרמת הפלואורסצנציה בערוץ ה-PI מתאים שאינם צבועים, ופאנל E מציג את היסטוגרמת הפלואורסצנציה בערוץ ה-PI מתאים מתים. ניתן להבחין בערכי הפלואורסצנציה של כל תא בודד בתרשימי הפיזור (dot plots) הדו-ממדיים המוצגים כאן. עבור תאים שאינם צבועים ותאים שצבעו כפולה עם flu oh 3:00 AM ו-pi, אחוז התאים שנרשמו בכל רבעיון מצוין על ידי המספר האדום.

באופן חשוב, ניתן להסיר את האות הנובע מתאים מתים. לבסוף, נמדד השינוי בריכוז הסידן התו-תאי המושרה על ידי פרוגסטרון בתאי זרע בודדים באמצעות דימוי; תמונות פסאודו-צבע מייצגות אלו מראות תאים שנצפו בתחילת הניסוי ולאחר הוספה של פרוגסטרון, CIN ומנגנז כלוריד. הוספת פרוגסטרון גורמת לעלייה בריכוז הסידן התו-תאי, הן בראש הזרע והן ב..., מנגנז כלוריד משמש להורדת הפלואו.

באיור זה מוצגים עקומים מייצגים של פלואורסנציה מנורמלת מתשתיקה עבור תשעה תאים בודדים מהניסוי. כפי שנצפה בניסויי אוכלוסייה, ניתוח תאים בודדים חשף עלייה חולפת עבור פרוגסטרון ועלייה מתמשכת עבור ionomycin, בהתאמה. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצע אותה תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא את חיוניות התאים ולבצע את הביקורות המתאימות בעקבות הפרוצדורה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה, על מנת להשיב על שאלות נוספות, כגון זיהוי תעלות יונים ספציפיות המעורבות בעליות בסידן, באמצעות תמיסות ופרוטוקולי סימולציה מתאימים לאחר פיתוחן. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הפיזיולוגיה של התא לחקור דינמיקה של סידן בתאים חיים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי בחירת הטכניקה המתאימה ביותר למדידת עליות של סידן תוך-תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי בכל סוג של תא, בהתאם לשאלה הספציפית שברצונכם לבחון. זכרו כי עבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בתורמים עם מצב בריאותיי מוכח. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, יש להקפיד תמיד על שימוש בכפפות לטקס ועל פינוי הולם של תמיסות וחומרים.