מדידת תאיים Ca ^{2 +} שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד תנודות סידן תוך תאיות בזרע אנושי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. זה מושג על ידי הכנת דגימת הזרע תחילה בשיטת השחייה ובמידת הצורך, קידום קיבולת. השלב השני הוא להעמיס את הזרע בצבע פלואורסצנטי של סידן.

לאחר מכן, באמצעות פלואורומטריה קונבנציונלית של פלואורומטריית זרימה עצירה, ציטומטריית זרימה או הדמיית תא בודד, בצע את הניסוי ורשום את מדידות הסידן. בסופו של דבר, התוצאות מנותחות כדי לקבוע שינויים בריכוזי הסידן התוך תאיים המופעלים על ידי פרוגסטרון או במהלך תהליך הקיבול. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלה הכרוכות ברדיואקטיביות הוא שמדובר בהליך רגיש מאוד.

זה בטוח וקל לביצוע. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות הסידן SPR, כגון זיהוי תרכובות הגורמות לסידן תוך תאי, עלייה ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה וזיהוי תת-אוכלוסיות תאיות שונות בדגימת סימן. ההשלכות של השימוש, למשל, בטכניקת ציטומטריית הזרימה משתרעות לקראת אבחון בעיות פוריות באמצעות ניתוח המצב הפיזיולוגי של סולם הגברים

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חקר ניוד הסידן של זרע אנושי, ניתן ליישם אותה גם על סוגים אחרים של תאים כגון סולמות זכריים ממינים אחרים או סוג שונה של תאים כגון נוירונים או תאי שריר. בדרך כלל, אנשים המשתמשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיפול בזרע אינו קל וחשוב לשמור על תנאים מתאימים להשגת תאים ברי קיימא ומוטוריים באמצעות הניסוי. יישמנו את השימוש בטכניקות אלו על ידי שילוב אסטרטגיות בתחומים שונים.

הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שקשה ללמוד את ההכנה והטיפול בדגימה, כמו גם את הוספת התרכובות מכיוון שתאי זרע עלולים להינזק במהלך ההליך וניתן להשיג חפצים בתגובות במהלך מהדורת התרכובות. כדי להכין את דגימת הזרע, יש להניח בזהירות מיליליטר אחד של בשר חזיר F 10 בינוני על גבי כל 500 מיקרוליטר זרע נוזלי. Eloqua, גע בדופן הצינור עם קצה המיקרו פיפט והוציא בעדינות את המדיום מעל הדגימה.

חיוני לעשות זאת לאט כדי להימנע מערבוב הדגימה והשכבות הבינוניות. למדיום מתווספים שני מילי-מולרי סידן כלורי וחמישה מיליגרם למיליליטר BSA. כדי לקדם קיבולת במבחנה, השען בזהירות את הצינורות לזווית של כ-30 מעלות.

זה יגדיל את שטח הפנים בין שני הנוזלים, ובכך ישפר את התזוזה או השחייה של תאי זרע מהדגימה למדיום במהלך הדגירה. לאחר מכן, הניחו את המבחנות הרזות בתוך חממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. 95% אוויר למשך שעה אחרי שעה.

השתמש במיקרו פיפט כדי להסיר בזהירות מכל צינור את 700 המיקרוליטרים העליונים של מדיום החזיר F 10 המכיל כעת זרע מוטיל. אסוף את כל הדגימות שנאספו לצינור זכוכית נקי אחד, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. הנח 10 מיקרוליטר של דגימה מאוגדת על הזכוכית השטוחה האופטית של בסיס תא ספירה מקולרי והנח את זכוכית הכיסוי.

הקפד להימנע מהיווצרות בועות בתוך החדר מכיוון שהדבר יגרום לספירת תאים לא מדויקת. התבונן תחת מיקרוסקופ מורכב המצויד במטרה של פי 20. לזכוכית הכיסוי של תא הספירה המקולרי יש ריבוע גדול המורכב מ-100 ריבועים קטנים יותר.

ספור את התאים בכל רצועה של 10 ריבועים. מספר זה מייצג את ריכוז התאים במיליוני תאים למיליליטר. חזור על הספירה בשתי 10 רצועות מרובעות נוספות וחשב את הממוצע של שלוש הספירות כדי להעמיס תאים בצבע פלורסנט.

שלב בצינור פוגה של 1.5 מיליליטר, את הנפח הנדרש של תרחיף זרע עם מספיק תמיסת מלאי שפעת מילי-מולרית אחת ב-3:00 לפנות בוקר כדי לקבל ריכוז סופי של שתי שפעת מיקרו-מולרית הו 3:00 לפנות בוקר לדגור למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ולהגן מפני צנטריפוגה קלה את הצינור ב-750 גרם למשך חמש דקות. היווצרות ענן ולא כדור מעידה על כך שהתאים במצב טוב, שואבים ומשליכים את הסופרנטנט ומשהים את הגלולה בנפח המתאים של מדיום זרע אנושי או HSM. כדי להתחיל בניסוי זה, שלבו בצינור זכוכית תחתון שטוח, 570 מיקרוליטר של HSM ו-30 מיקרוליטר של תרחיף תאי זרע שהועמסו בעבר בשפעת הו ב-3:00 לפנות בוקר והושעו מחדש ב-HSM כדי לקבל אחד כפול 10 עד שמינית התאים למיליליטר.

הנח מוט ערבוב מגנטי בתוך צינור הזכוכית והכנס את הצינור לתא הקריאה של הספקטומטר שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. יש לערבב את הדגימה לאורך כל זמן הרכישה. התחל את הניסוי באמצעות תוכנת oli והמשך לרכוש ערכי פלואורסצנטיות בתדר של 0.5 הרץ במשך 300 שניות.

לאחר רכישת פלואורסצנטיות בזאלית למשך 30 שניות, השתמש במזרק המילטון מיקרו כדי להזריק את הנפח המתאים של תרכובת הבדיקה במקרה זה לפרוגסטרון מיקרומולרי תוך 100 שניות. ב -20 מיקרו-מולרי יון מיצין כבקרה חיובית להשגת ערך הקרינה המקסימלי. בניסוי זה, שינויים בסידן תוך תאיים נמדדים ברזולוציה זמנית גבוהה.

באמצעות מערבל זרימה עצור SFM 20 בשילוב עם מערכת אופטית קינטית כלבת, מלאו את אחד ממזרקי המכשיר במיליליטר אחד של שפעת. 3:00 לפנות בוקר טענו תאי זרע ואת המזרק השני במיליליטר אחד מהתרכובת לבדיקה. 20 פרוגסטרון מיקרו-מולרי מומס ב-HSM.

בדוגמה זו, חיוני להימנע מהיווצרות בועות תוך כדי שאיבת הנוזלים למזרקים. הרם את שתי בוכנות המכשירים עד שהן נוגעות בקצה בוכנות המזרק. הגדר את זמן הדגימה הכולל במקרה זה ל-50 שניות ואת התדר ל-10 אלפיות השנייה על מנת למזער נזק לתאים, הגדר את קצב הזרימה לערך המינימלי שיספק טריגר תגובה מדיד.

ערבוב הריאגנטים, עקבות הקרינה הגולמית לעומת הטימין יוצגו על מסך המחשב. חזור על הליך זה והחלף את הפרוגסטרון ב-HSM כבקרה שלילית ו-10 מיקרו-מולרי יון מיצין כבקרה חיובית לפני ציטומטריית זרימה. הכן את דגימות הניסוי על ידי הנחת 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל צינור ציטומטר בכל תנאי שייבדק.

הגדר ניסוי באמצעות תוכנת הציוד. ראשית, צור תיקיה חדשה, דגימת ניסוי ומספר צינורות. לאחר מכן בחר הגדרות ציטומטר מתאימות לשפעת O 3:00 לפנות בוקר. השתמש במסנני פלואורסצאין איזותיוציאנט ופרופידיום יודיד.

הפעל צינורות בקרה לא מוכתמים 1 ו-2 בציטומטר. אסוף נתוני פיזור קדימה וצדדית כדי לוודא שהגדרות הסף מתאימות וכדי ליצור את השער המתאים על מנת להבחין בין פסולת לתאים. הפעל את צינורות הניסוי ואסוף נתוני פלואורסצנטיות מ-10,000 אירועים לדגימה.

בסוף. ייצא את כל הנתונים לתוכנה הזמינה לניתוח. הכן פתקי כיסוי עגולים הדרושים להליך זה על ידי מריחת טיפה של חמישה מיקרוליטר של תמיסת פולי L ליזין על מרכז כל החלקת כיסוי.

יש להשאיר לפחות שעה לפני השימוש ולשטוף את האזור המטופל במים. זה יסיר עודפי פוליליזין ויאפשר לתאי הזרע להיצמד להחלקת הכיסוי מראשם בזמן שהדגל שלהם עדיין יכול לנוע. הרכיבו את החלקת הכיסוי בתוך תא ההקלטה.

הניחו 10 מיקרוליטר של שפעת הו 3:00 AM תאים טעונים בריכוז של אחד כפול 10 עד התאים השביעיים למיליליטר. במרכז החלקת הכיסוי. מכסים את התאים ב -200 מיקרוליטר HSM מחומם מראש.

הנח את החדר על במת המיקרוסקופ, שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס, וצפה בתאים באמצעות ניגודיות פאזה. בחר אזור שבו צפיפות התאים מתאימה להדמיה. יותר מדי תאים מקשים על הניתוח בגלל אותות חופפים.

התאים צריכים להיות מחוברים היטב להחלקת הכיסוי בראשם, אך להפגין תנועת דגלים, המאשרת את הכדאיות. התחל את הניסוי על ידי הפעלת תוכנת רכישת התמונות של סדרות הזמן. בדרך כלל נדרשות ארבע תמונות בשנייה עם תאורה של שתי אלפיות שנייה לתמונה.

רכוש תמונות פלואורסצנטיות במצב חי. כדי לכוונן את המיקוד והבהירות. השתמש במיקרו פיפטה כדי להוסיף בזהירות את תרכובת הבדיקה פרוגסטרון במקרה זה והמשך ברכישת התמונה לפי הצורך.

בצע שתי תוספות בקרה עוקבות לאותו תא. 20 מיצין יונים מיקרו-מולרי להשגת פלואורסצנטיות מקסימלית וחמישה מילי-מולרי מנגן כלוריד להשגת פלואורסצנטיות מינימלית. בצע ניתוח תמונה במצב לא מקוון באמצעות תוכנת IQ.

צייר את אזורי העניין או ההחזר על ההשקעה סביב כל תא או חלק מהתא. בנוסף, בחר אזור נטול תאים להפחתת רקע אוטומטית על ידי התוכנה. לאחר מכן מתקבלת סדרת עוצמת פלואורסצנטי זמן עבור כל החזר ROI וניתן לייצא נתונים אלה ל-Microsoft Excel לצורך ניתוח נוסף.

פרוגסטרון הוא אחד מגורמי התגובה האקרוזומיים הידועים וכצפוי מעורר, עלייה חולפת בריכוז הסידן התוך-תאי בזרע אנושי כפי שנמדד על ידי פלואורומטריה קונבנציונלית. עקבות הקרינה האדומה לעומת הזמן מראה שינויים בריכוז הסידן התוך תאי שנגרמו על ידי תוספת של ארבעה פרוגסטרון מיקרו-מולרי כביקורת שלילית נוסף HSM, שלא גרם לשינוי ברמות ריכוז הסידן התוך תאי כפי שמצוין על ידי עקבות הקרינה הכחולה כבקרה חיובית. השינוי המושרה על ידי 10 מיצין יונים מיקרו-מולרי מוצג עבור כל עקבה.

תוספת של יונופור סידן זה גורמת לעלייה המקסימלית בריכוז הסידן התאי RA המרבי, שאינו חוזר לרמות הבסיסיות. גרף עמודות זה הראה את השינוי הממוצע בדלתא הקרינה F מכל מצב, פלוס או מינוס שגיאת תקן כאשר N שווה לשלוש והכוכבית מציינת ערך P של פחות מ-0.001 בהשוואה לביקורת. עליית ריכוז הסידן התוך תאי המושרה על ידי פרוגסטרון נמדדה ברזולוציה זמנית גדולה יותר על ידי פלואורומטריית זרימה עצורה ותוצאות מייצגות מוצגות כאן.

עקבות גולמיים מוצגים בפאנל A, הן פרוגסטרון המיוצג על ידי הקו האדום והן מיאצין היונים המיוצג על ידי הקו הכחול גרמו לעלייה מהירה בריכוז הסידן התוך תאי. העקבה הירוקה היא הבקרה השלילית שבה התאים היו מעורבבים עם HSM. פאנל B מציג עקבות מתוקנים עבור האותות המושרים עם פרוגסטרון או עם מיצין יונים המתקבלים על ידי הפחתת אות הבקרה מהאותות הגולמיים המתאימים להם.

פרוגסטרון גרם לעלייה מהירה וחולפת מאוד בריכוז הסידן התוך-תאי כאשר ערך הקרינה המקסימלי התרחש 2.7 שניות לאחר הוספת המשרן. מצד שני, CIN גרם לעלייה מהירה ומתמשכת בריכוז הסידן התוך תאי לאורך 50 שניות. הכניסה בפאנל B מציגה תצוגה מורחבת של 500 אלפיות השנייה הראשונות עבור כל תגובה.

היעדר עיכוב בעליית ריכוז הסידן התוך תאי הנגרמת על ידי פרוגסטרון עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המצביעים על כך שפרוגסטרון מפעיל ישירות את דורבן החתול של תעלת הסידן ללא איתות ביניים. ריכוז הסידן התוך תאי נמדד גם בזרע אנושי קיבולי ולא קיבולי באמצעות ציטומטריית זרימה. בעלילות המייצגות הללו קדימה וצדדית.

תאים קיבוליים הם בכחול ותאים לא קיבוליים הם באדום. השער שנבחר מסומן בקו הכחול ורק התאים באזור זה שימשו להמשך ניתוח. פאנל B מציג את ההיסטוגרמה הקרינה בערוץ Fitzy מ-Unstained, spermatozoa, ופאנל D מציג את ההיסטוגרמה הקרינה בערוץ FZ משפעת oh 3:00 AM זרעונים מוכתמים כפי שנצפה בפאנל D.התפלגות ערכי הקרינה עבור זרע קיבולי המיוצג על ידי העקבה הכחולה מועברת לערכים גבוהים יותר בהשוואה לזרע לא קיבולי המיוצג על ידי העקבה האדומה.

פאנל C מציג את ההיסטוגרמה הקרינה בערוץ PI מתאים לא מוכתמים ופאנל E מציג את ההיסטוגרמה הקרינה בערוץ PI מתאים מתים. ניתן לראות את ערכי הקרינה עבור כל תא בודד בתרשים נקודות הקרינה הדו-ממדיות המוצגות כאן. עבור תאים לא מוכתמים ותאים שנצבעו פעמיים בשפעת הו 3:00 AM ו-pi, אחוז התאים שנרשמו בכל רביע מסומן על ידי המספר האדום.

חשוב לציין, ניתן לבטל את האות הנובע מתאים מתים. לבסוף, השינוי בריכוז הסידן התוך תאי המושרה על ידי פרוגסטרון נמדד בתאי זרע בודדים על ידי הדמיית תמונות פסאודו-צבע מייצגות אלה המציגות תאים שנראו בהתחלה ואחרי תוספות פרוגסטרון, CIN ומנגן כלוריד. תוספת פרוגסטרון גורמת לעלייה בריכוז הסידן התוך תאי, הן בראש הזרע והן בכלוריד לום מנגן משמש להפחתת השפעת.

הו 3:00 לפנות בוקר פלואורסצנטי על ידי כיבוי עקבות פלואורסצנטיים מנורמלים מייצגים של תשעה תאים בודדים מהניסוי מוצגים באיור זה. כפי שנצפה בניסויי אוכלוסייה, ניתוח תאים בודדים חשף עלייה חולפת ומתמשכת עבור פרוגסטרון ומיסין יונים בהתאמה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאמת את כדאיות התאים ולבצע את הבקרות המתאימות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי תעלות יונים ספציפיות המעורבות בעליית הסידן על ידי שימוש בתמיסות פרופ ופרוטוקולי סימולציה לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה של התא לחקור דינמיקת סידן בתאים חיים עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור את הטכניקה המתאימה ביותר למדידת עלייה בסידן תוך תאי באמצעות דיה פלואורסצנטי בכל סוג של תא, בהתאם לשאלה הספציפית עליה תרצה לענות. אל תשכח שעבודה עם דגימות סימן אנושיות עלולה להיות מסוכנת ואמצעי זהירות כמו שימוש בתורמים בעלי בריאות מוכחת. יש לנקוט תמיד בשימוש בכדורי לטקס במהלך ההליך וסילוק מתאים של תמיסה וחומרים בעת ביצוע הליך זה.