ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים
December 1st, 2020
מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.
זיהוי אינטראקציות חלבון מולקולות קטנות חיוני למחקר ופיתוח של תרופות, כמו גם לטיפוח הבנתנו את המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס DTCs של הנגיף. שיטה זו מאפשרת ביו-פאנינג בתפוקה גבוהה של פפטידים לזיהוי תרופות ואימות גלובלי של אתרי קשירת תרופות על חלבונים עבור תרופות מולקולות קטנות מעניינות. כדי להכין שבב חיישן QCM, חבר שבב חיישן קרמי למתנד של מכשיר QCM של 27 מגה-הרץ ורשום את התדר הפנימי בשלב האוויר לפני קיבוע מולקולות קטנות.
לאחר ההקלטה, נתק את השבב והוסף בזהירות טיפה של 20 מיקרוליטר של תמיסה נגזרת של מולקולה קטנה של מילי-מולרית אחת באתנול של 70% כדי ליצור שכבת מונו בהרכבה עצמית על אלקטרודת הזהב של שבב החיישן. מניחים את הצ'יפס בצלחת פטרי מרופדת ברקמה לחה, מגנים עליו מפני אור למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני ששוטפים בעדינות את משטח האלקטרודה במים טהורים במיוחד. יבש את השבב במריחה עדינה של אוויר וטען את השבב על מנגנון ה-QCM.
לאחר שעה רשום את הירידה בתדירות בשלב האוויר כדי למדוד את כמות המולקולה הקטנה שהשתתקה. עבור ספריית פאג'ים T7 Biopanning, הנח קובטה עם מערבל מגנטי ייעודי על החיישן הביולוגי QCM המוגדר ל-1000 סיבובים לדקה והוסף שמונה מיליליטר של מאגר תגובה לקובט בזמן ערבוב המאגר חבר את שבב חיישן ה-QCM למתנד החזק את זרוע המתנד לחוץ כדי לטבול את השבב במאגר ולהתחיל לנטר את תדר ה-QCM. כאשר גרם החיישן מתאזן לסביבות שלושה הרץ לדקה של סחיפת תדרים, הזרקו שמונה מיקרוליטר של ספריית פאג'ים T7 לתוך הקובט וסמנו את נקודת ההזרקה על החיישן.
עקוב אחר הפחתת התדר הנגרמת על ידי פאג'ים T7 הנקשרים למולקולה הקטנה המשותקת על פני אלקטרודת הזהב. לאחר 10 דקות, עצור את צג התדרים QCM והרם במהירות את המתנד כדי להסיר את שבב החיישן מהאצווה, נתק את שבב החיישן מהמתנד והסר את המאגר מהשבב. הנח את שבב החיישן המיובש בצלחת פטרי לחה והוסף טיפה של 20 מיקרוליטר של תאי מארח E-coli בשלב לוג על אלקטרודת הזהב.
דגרו את המנה על מערבל מיקרופלייט של 96 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-1000 עד 1500 סיבובים לדקה למשך 30 דקות, מוגן מפני אור כדי לשפר את ההתאוששות של שבעת הפאג'ים הקשורים T7. בתום הדגירה העבירו את 20 המיקרוליטרים של תרחיף E-coli ל-200 מיקרוליטר של מדיום LB. על פי הנוהל הכללי, בצע את בידוד פלאק הפאג'ים בתווך וריצוף DNA המקודד את התרופה, מזהה רצפי פפטידים המוצגים על כל קפסיד פאג'.
לאחר תחזוקה של שבב החיישן, השתמש בתמיסת נתרן דודציל סולפט ספוגית צמר גפן כדי לנקות את משטח האלקטרודה, שטפו את משטח הזהב במים טהורים במיוחד וייבשו את האלקטרודה באוויר. לאחר מכן טפלו במשטח האלקטרודה בחמישה מיקרוליטרים של תמיסת פרנה טרייה שהוכנה למשך חמש דקות ולאחר מכן שטיפה במים טהורים במיוחד וייבוש באוויר פעמיים. כדי לבצע ניתוח ביואינפורמטי באמצעות RELIC פתח את תוכנית RELIC העצמאית במחשב עם מערכת הפעלה Windows והשתמש ברצפי חומצות האמינו של תרופות שנבחרו 15 פפטידים או חלבונים בודדים או מרובים בכל קובץ טקסט בפורמט A מהיר.
מקם את קבצי הטקסט הנדרשים בתיקייה של AA-div, מידע, מוטיב, התאמה, יישור הטרו, A con מהיר או סריקת A מהירה. לחץ על כל קובץ הפעלה בתיקייה העצמאית כדי לפתוח את הגרסה האישית של FTN 95 ולהזין את שם הקובץ והסיומת המתאימים בשורת הפקודה כדי להפעיל כל תוכנית ולקבל את קובץ פורמט הטקסט המתקבל. קבצי פורמט הטקסט המתקבלים מוצגים כאן.
לאחר מכן ייצא את קובץ הטקסט המתקבל לגיליון אלקטרוני כדי ליצור תרשים של תוכן מידע או ציוני דמיון מצטברים המחושבים באמצעות מכה כ-62. באמצעות אסטרטגיה זו, זוהו בהצלחה אתרי קשירה בודדים ומרובים של מולקולות קטנות על חלבוני המטרה עבור שש תרופות מולקולות קטנות. לדוגמה, 29 פפטידים המזהים את התרופה המאושרת קלינית Irinotecan משותקת כחד-שכבתית בהרכבה עצמית זוהו על ידי חיישן ביולוגי QCM המבוסס על ביו-פאנינג מחזור אחד יישור זוגי לאחר מכן של 29 הפפטידים ואצטילכולין אסטראז הניב ציונים מקסימליים עבור שאריות חומצות אמינו ספציפיות שהיו עקביות עם אלה המרכיבות את אתר הקישור של אירינוטקאן.
אותה תת-קבוצה של פפטידים זוהתה בהצלחה גם בקרבת השילוש הקטליטי בקרבוקסילאסטראז, מה שמצביע על כך שחומצות אמינו אלו יוצרות פיגום לזיהוי אירינוטקאן במהלך דה-אסטריפיקציה. 27 הפפטידים המזהים את התרופה נגד שפעת אוסלטמיביר המכסה את פני השטח של אלקטרודת הזהב של שבב חיישן QCM זיהו בהצלחה את אתר הקישור של אוסלטמיביר בנוראמינידאז. אתר קשירה זה מורכב מלולאות פפטיד לא מובנות שעלולות לעבור תנועה דינמית תוך כדי עגינה עם אוסלטמיביר.
תרופות, אזורים, כימיקלים, בקטריופאג'ים רקומביננטיים וחיידקים הם שמיעה ביולוגית ויש לטפל בהם בהתאם לפרוטוקול רווח התרבית. זכור תמיד ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה ליתר ביטחון. בעקבות הליך זה, ניתן לאמת באופן גלובלי חלבוני מטרה לתרופות שונות בבני אדם, וירוסים פתולוגיים ואפילו צמחים כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ואת היעילות הטיפולית הפוטנציאלית של תרופות מעניינות.
סקירה
מחקר זה מציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות בין תרופות ופפטידים באמצעות ביו-חיישן מאוזן מיקרו קוורץ (QCM). השיטה כוללת ביו-פאנינג של פפטידים המזהים תרופות וניתוח ביואינפורמטי מחשבים כדי להעריך את זיהוי התרופות ואתרי הקישור על חלבונים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיתוח תרופות
- ביוטכנולוגיה
רקע
- הבנת אינטראקציות בין מולקולות קטנות לחלבונים היא חיונית למחקר תרופות.
- יש צורך בשיטות תפוקה גבוהה לביו-פאנינג פפטידים.
- חיישני QCM מספקים פלטפורמה לחקר קישור תרופות.
- זיהוי אתרי קישור מסייע בפיתוח טיפולי.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לזיהוי פפטידים הקושרים תרופות.
- לאמת אתרי קישור תרופות על חלבונים מטרה.
- לשפר את ההבנה של אינטראקציות תרופתיות ברמה המולקולרית.
שיטות בשימוש
- הכנת חיישני QCM לאימוביליזציה של מולקולות קטנות.
- ביו-פאנינג באמצעות ספריות פאג T7 לזיהוי פפטידים קושרים.
- ניטור שינויי תדר ב-QCM כדי להעריך אינטראקציות קישור.
- ניתוח ביואינפורמטי לצורך הערכת רצפי פפטידים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של פפטידים המזהים תרופות כמו Irinotecan ו-Oseltamivir.
- אפיון אתרי קישור על חלבונים כמו אצטילכולינסטרז ונויורמינידאז.
- הוכחת יעילות השיטה באימות אינטראקציות תרופתיות.
מסקנות
- האסטרטגיה מזהה ביעילות אתרי קישור תרופות על חלבונים.
- ניתן ליישם אותה על תרופות שונות לתובנות טיפוליות.
- משפרת את ההבנה של מנגנונים מולקולריים בפעולת תרופות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
