שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית
6 באוגוסט 2008
פרוטוקול זה מדגיש את עקרונות יישומים מעשיים של שלב והפרעה ניגודיות דיפרנציאלי (DIC) מיקרוסקופית
מיקרוסקופיה של אור היא אחד הכלים המאפשרים ביותר, ואולי אף המוביל, בתחום המחקר הביו-רפואי. בהתאם ליישום שלכם, מצבי תאורה שונים הם הרצויים לצפייה בדגימה. סרטון זה ידגים שני מצבים אופטיים של תאורה באור תC(transmitted light), מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast) ו-DIC או מיקרוסקופיית ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (differential Interference contrast).
שלום, אני ויקטוריה סן פרוליק מהמרכז למסורת דימות אופטי באוניברסיטת טקסס, המרכז למדעי הבריאות בסן אנטוניו. היום אראה לכם כיצד לצפות בדגימות בצורה נכונה באמצעות מיקרוסקופיה בניגוד מופע (phase contrast) ובניגוד הפרשתי (differential interference contrast). בואו נתחיל.
מיקרוסקופיה בשדה בהיר (Brightfield) סטנדרטית אינה מספיקה לצפייה בדגימות שקופות וחסרות צבע. מיקרוסקופיית ניגוד מופע (Phase contrast) משמשת לעיתים קרובות ליצירת ניגודיות עבור דגימות ביולוגיות שקופות שאינן סופגות אור. הטכניקה התגלתה על ידי זוריך בשנת 1942, שקיבל את פרס נובל על הישגו.
מיקרוסקופ ניגודי פאזה (phase contrast microscope) הוא מיקרוסקופ אור בבסיס שדה בהיר, בתוספת עדשות אובייקטיביות מיוחדות לניגוד פאזה המכילות פלטה או טבעת פאזה, וטבעת קונדנסור (condenser annulus) במקום דיאפרגמה. הטבעת ממוקמת בדרך כלל במגדל הקונדנסור, ויש לבחור את גודל הטבעת המתאים עבור עדשות אובייקטיביות שונות. לאחר הגדרת תאורת קולר (Kohler illumination), בחר את עדשת הפאזה המתאימה ולאחר מכן סובב את טבעת הפאזה הרלוונטית למקומה בקונדנסור.
לאחר שטבעת הפאזה של העדשה והטבעת של המעבה כוילו כראוי כך שיהיו קונצנטריות וחופפות, ניתן לצפות בדגימה ולכוון את המיקוד באופן מדויק. נדגים כעת כיצד נראה ניגוד פאזה דרך המיקרוסקופ. להלן מבט על פרוסה של כבד חולדה.
תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast). שיטה זו משפרת את מראה החומר הביולוגי על ידי שינוי הניגודיות מגוונים שונים של אפור לגוונים של שחור ולבן. עם זאת, תבחינו כי הדגימות מוקפות בהילה, המסתירה מבנים עדינים.
הילה זו היא תוצר לוואי של התאורה על ידי טבעת הפאזה (phase annulus). כעת תבחינו כי כאשר נחזור למצב של שדה בהיר (brightfield), הדגימה הזו קשה מאוד לצפייה. במעבר חזרה לניגודיות פאזה (phase contrast), אנו יכולים לראות בבירור את המבנה והצורה של התאים ברקמת כבד של חולדה, מאז שהשיטה הוצגה בסוף שנות ה-60.
מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, או DIC, הפכה לנפוצה במחקר ביו-רפואי מכיוון שהיא מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים עדינים על ידי הגברת הניגודיות בממשקים; התמונה שנוצרת היא של חתך אופטי דק מאוד. למעשה, היכולת של DIC להפיק חתכים אופטיים הפכה אותה למצב שימושי של תאורת אור חודר המשלימה מיקרוסקופיה קונפוקלית. מיקרוסקופ ה-DIC הוא מיקרוסקופ אור בשדה בהיר עם תוספת של האלמנטים הבאים: פולריזטור בין מקור האור לבין הקונדנסור.
פריזמה לפיצול קרן DIC בחלק המעבה, פריזמה לאיחוד קרן DIC ממש מאחורי העדשה, ואנלייזר במרחב האינסוף לפני שתי השילובים. כדי להשיג את הביצועים הטובים ביותר מאופטיקת DIC, חשוב תחילה לכייל את מיקרוסקופ האור לתאורה מסוג Kohler ולאחר מכן להציב את רכיבי ה-DIC בנתיב האופטי. אור מהמקור עובר דרך מקטב ולאחר מכן מפוצל על ידי הפריזמה הראשונה.
אלומות זוגיות אלו נעות קרוב אחת לשנייה. אם שנייה האלומות עברו דרך אותו חומר בדגימה, הרי שבזמן שהן מאוחדות שוב על ידי המנסרה השנייה, הן אינן מפריעות זו לזו ולכן הן נראות בצבע אפור. עם זאת, בקצה של מבנה, אחת האלומות מהזוג עוברת דרך חומר השונה מזה של בן זוגה ועוברת שינוי.
כאשר קרניים אלו משולבות מחדש על ידי המנסרה השנייה, הן יחוללו התאבכות בונה שתביא להיווצרות נקודה בהירה, או התאבכות הורסת שתביא להיווצרות נקודה כהה. להלן מבט על דיאטומים תחת ניגודיות DIC. ניתן להבחין כי פרטים עדינים של מבנה הדיאטום נראים בבירור.
עם זאת, אם האופטיקה של ה-DIC מוסרת, פרטים אלו נעלמים. הניגודיות לאורך הדגימה בהירה בצד אחד וכהה יותר בצד השני. דבר זה יוצר רושם של טופוגרפיה, אך למעשה, מדובר באשליה.
ניתן להפוך את כיוון אפקט הצללית על ידי סיבוב המקטב דרך נקודת הצטלביות (crossover point) לניגודיות ההפוכה. סקרנו כעת את המצבים האופטיים של ניגודיות פאזה ו-DIC. לצורך תזכורת, ביטול ניגודיות הפאזה מדגיש את הדגימות בניגודיות שבין שחור ללבן, והוא שימושי לצפייה בדגימות שהן חסרות צבע ושקופות כאחד.
DIC יוצרת גם ניגודיות בדגימה. היא עושה זאת על ידי יצירת תמונה ברזולוציה גבוהה של חתך אופטי דק. וזהו זה.
תודה שצפיתם ובהצלחה במיקרוסקופיה שלכם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגיש את העקרונות והיישומים המעשיים של מיקרוסקופיית פאזה (Phase Contrast) ומיקרוסקופיית ניגודיות הפרשה דיפרנציאלית (DIC). טכניקות אלו משפרות את הוויזואליזציה של דגימות ביולוגיות שקופות וחסרות צבע, מה שהופך אותן לכלים חיוניים במחקר ביו-רפואי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר ביו-רפואי
- טכניקות מיקרוסקופיה
- דימיון אופטי
רקע
- מיקרוסקופיה של אור היא חיונית לצפייה בדגימות ביולוגיות.
- מיקרוסקופיית ניגודיות מופע (Phase contrast) משפרת את הניגודיות עבור דגימות שקופות.
- מיקרוסקופיית DIC מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים עדינים.
- שתי הטכניקות חיוניות לניתוח יעיל של דגימות.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש במיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (Phase Contrast) ו-DIC.
- להסביר את ההגדרה והכיול של טכניקות מיקרוסקופיה.
- להדגיש את היתרונות של שיטות אלו בתצפית על חומרים ביולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגדרת תאור קולר (Kohler illumination) להשגת פיזור אור אופטימלי.
- שימוש בעדשות אובייקטיב וטבעות פאזה (annuli) למיקרוסקופיית ניגודיות פאזה.
- יישום אופטיקת DIC, הכוללת מקטבים ופריזמות לפיצול קרן.
- השוואת נראות הדגימות תחת טכניקות מיקרוסקופיה שונות.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (Phase contrast microscopy) חושפת מבנים תאיים בדגימות שקופות.
- מיקרוסקופיית DIC משפרת פרטים עדינים ומספקת אפקט טופוגרפי.
- שתי הטכניקות משפרות באופן משמעותי את הבהירות של דגימות ביולוגיות.
- ארטיפקטים כגון הילות בניגודיות פאזה מצוינים ומוסברים.
מסקנות
- ניגודיות פאזה (Phase contrast) יעילה לצפייה בדגימות חסרות צבע ושקופות.
- מיקרוסקופיית DIC מציעה דימיוג ברזולוציה גבוהה של מבנים עדינים.
- שתי השיטות בעלות ערך לקידום המחקר במדעי הביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (Phase contrast) ו-DIC מאפשרות ויזואליזציה של דגימות ביולוגיות שקופות שאינן סופגות אור, ובכך תומכות בתהליכי גילוי מוקדמים שבהם נדרשת הדמיה ללא סימון. טכניקות אלה מספקות הפחתת סיכונים מכנית על ידי חשיפת פרטים מבניים ומורפולוגיה תפקודית בתאים וברקמות חיים ללא קיבוע או צביעה. שילובן בתהליכי גילוי משפר את רמת הביטחון בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על תגובות פנוטיפיות וארכיטקטורה תאית בתנאים הקרובים לתנאים פיזיולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרות
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ללא סימון (label-free) של דגימות שקופות, כגון תאים חיים וחתכי רקמה, להערכת שינויים מורפולוגיים הקשורים ל modulates של המטרה.
- ערך תפעולי: תומך בסינון מהיר של פנוטיפים תאיים ללא צורך בתגי פלואורסצנציה או קיבוע כימי, ובכך מקצר את זמן הכנת הבדיקה.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בהשערות לגבי המטרה על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של פנוטיפים מבניים ותפקודיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספקת דימוי בניגודיות גבוהה ללא סימון (label-free), המתאים לפיתוח בדיקות פנוטיפיות שבהן שקיפות מסתירה פרטים במיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield).
- ערך תפעולי: מאפשרת סטנדרטיזציה של תנאי הדימוי באמצעות תאורת קוהלר (Koehler illumination) ויישור מדויק של לוחות פאזה או פריזמות DIC, ובכך משפרת את השחזוריות בין הרצות שונות.
- סקביליות: תואמת לפורמטים של פלטות עם מספר בארות כאשר היא משולבת במערכות מיקרוסקופיה אוטומטיות, מה שתומך במבצעי סריקה בעוצמה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לדימות עקבי של תאים ראשוניים, נגדיים (explants) ומודלים של עובריו לאורך זרימות העבודה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: חושפת פרטים מבניים עדינים בממשקי רקמות, ובכך מסייעת להבהיר מנגנוני פעולה במערכות ביולוגיות מורכבות.
- מערכות רלוונטיות למחלות: ישימה על דגימות עבות, כולל חתוכי רקמה, ביצים ועוברים, ובכך תומכת בהערכה במודלים מורכבים פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (Phase contrast) ו-DIC משמשות כטכנולוגיות מאפשרות ברצף הגילוי, ותומכות בבדיקת היפותזות בביולוגיה בסיסית, במוכנות של בדיקות (assays) לסריקה ובניתוח מורפולוגי במחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות על ידי התרה של תצפית ישירה על תגובות תאיות להפרעות בדגימות שקופות ובלתי צבועות.
- סריקה: תומכת בפיתוח בדיקות באמצעות הדמיה בעלת ניגודיות גבוהה וניתנת לשחזור של דגימות ללא סימון, ובכך מפחיתה את השונות בתוצאות הפנוטיפיות.
- אנליזה: מייצרת מדידות כמותיות של עוצמה וניגודיות בממשקים מבניים, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית של תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רציפות באמצעות אספקת ויזואליזציה עקבית של רקמות ראשוניות ושתולי רקמה (explants), משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת הדמיה הניתנת לשימוש חוזר בין מחלקות, ובכך מפחיתה כפילויות בהקצאת משאבי מיקרוסקופיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי חשיפת פרטים מבניים עדינים ומאפיינים טופולוגיים בדגימות חיות שאינן צבועות.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה באמצעות הליכי יישור מוגדרים עבור טבעות הפאזה ואופטיקת DIC, ובכך משפר את ההדירות היומיומית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הגברת הביטחון בתצפיות פנוטיפיות, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב מורכבות ביולוגית בלתי צפויה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם-סיכון, המבוסס על ראיות פנוטיפיות ישירות וללא סימון ממערכות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכיול אופטי, כולל תאורת קולר (Koehler illumination) ומרכוז מדויק של לוחות פאזה או פריזמות DIC.
- תלוי בחומרה ייעודית: עדשות אובייקטיב לניגודיות פאזה עם טבעות פאזה, טבעות קונדנסור (condenser annuli), מקטבים, פריזמות לפיצול ואחד של קרן, ואנליזטורים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי תאורה וכיול כדי להבטיח תוצאות עקביות בין משתמשים ואתרים שונים.
- שיקולי התאמה כוללים התאמת מקדם שבירה ועובי הדגימה, המשפיעים על איכות החיתוך ב-DIC ועל ארטיפקטים של הילה (halo) בניגודיות פאזה.
- מגבלות מעשיות כוללות ארטיפקטים של הילה בניגודיות פאזה שעלולים להסתיר מבנה עדין, ואת אפקט הצל הכיווני ב-DIC, שהוא אשליה אופטית שאינה מייצגת טופוגרפיה אמיתית.
