Name: Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למד את שיטת האגרואינפילטרציה לביטוי חלבונים רקומביננטיים ברמה גבוהה בצמחי Nicotiana benthamiana. שיטה זו מאפשרת ייצור תרופתי בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לר &#39;סאן ותלמידים אחרים של המעבדה של חן על תרומתם לדור לשתול חומר. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר ד &#39;גרין לתמיכה במחקר לתואר הראשון שלו במכללה לטכנולוגיה וחדשנות (CTI). מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH U01 AI075549 ו1R21AI101329 לשאלת חן, ומענק SSE מCTI של אוניברסיטת אריזונה לחן ש. ק Leuzinger, דנט מ &#39;, ג&#39;הורטדו, וג&#39; Stahnke הם סטודנטים לתואר ראשון הנתמכים על ידי מענק מז.

1. גידול צמחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 60 כדורי כבול לתוך מגש התפשטות. הוסף 4 ליטר של מים ברז ולתת כדורי הכבול לספוג את המים במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 נ &#39; זרעי benthamiana לכל כבול גלולה בשימוש במזרעה, לכסות את המגש עם כיפת פלסטיק שקופה, ולאפשר להם לנבוט ב25 מעלות צלזיוס, סביבת לחות 84% עם מחזור יום / לילה שעות 16/8 (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כיפת שבועיים לאחר זריעה, לנקז מים מהמגש, ולהוסיף 2 ליטר של הדשן של ג&#39;ק בריכוז של 1.48 גר &#39;/ ל&#39; (איור 1). תמשיך לגדל צמחים ב25 מעלות צלזיוס, בסביבת לחות של 50% ביום לשעה / לילה מחזור 16/8. אספקת 2 ליטר של הדשן של ג&#39;ק כל 2 ימים במגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשבוע 4, להעביר את הצמחים עם כדורי כבול למגש חדש שמארח את שישה צמחים כדי לספק מרחב מספיק להמשך הצמיחה (איור 1 ג) עד שהם מוכנים להסתננו לאחר 6 שבועות של גיל (איור1D). </li></ol> 2. א תרבות הכנת tumefaciens 2.1 הכנה להסתננות מזרק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א הפס זני tumefaciens GV3101 המכילים את וקטורי geminiviral P19, pREP110, pBYGFP וpBYDsRed על צלחות אגר LB המכילים kanamycin (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל). פס זן אחד לכל צלחת ולגדול ב 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, פס ולגדול GV3101 זני מחסה וקטורי MagnICON של 5 &#39;מודול (pICH15879), 3&#39; מודול המכיל את גן המטרה של ה-GFP או DsRed (Pich-GFP או Pich-DsRed), וintegrase (pCH14011) על אגר LB צלחות המכילות carbenicillin (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממושבה אחת על הצלחת אגר LB, לחסן GV3101 זני מחסה וקטורי geminiviral ל3 מ&quot;ל של תקשורת YENB (0.75 תמצית שמרי Bacto%, 0.8% מרק מזין, כדי להתאים את pH 7.5 עם NaOH) + kanamycin (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב צינור תרבות מסביב לתחתית 15 מ&quot;ל, לגדול התרבות הנוזלית על 30 מעלות צלזיוס בשייקר לילה עם קצב סיבוב סל&quot;ד 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לחסן ולגדול GV3101 זני מחסה וקטורי MagnICON בYENB תקשורת + carbenicillin (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בלילה בשעה שייקר 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום ערכי OD 600 לכל תרבות נוזלית עם ספקטרופוטומטר ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V משנה) להיות subcultured לתרבות חדשה עם 600 OD של 0.025 מתחיל ב 10 מ&quot;ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה . V תת (מ&quot;ל) = (10 מ&quot;ל) x (0.025) / 600 OD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת V משנה (מ&quot;ל) של תרבות הלילה ל( 10 - V משנה) מ&quot;ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה לכל זן. לגדול התרבות החדשה בין לילה על 30 מעלות צלזיוס בייקרה עם קצב סיבוב סל&quot;ד 250 עד 600 OD הערך הוא בטווח של 1.7-2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום OD 600 ערכים עבור כל תרבות נוזלית ולהשתמש בנוסחה הבאה לCalculate הנפח הדרוש (V INF) להיות מדולל ב 50 מ&quot;ל של חיץ חדירה לתת OD 600 סופי של 0.12 לכל זן. V inf (מ&quot;ל) = (50 מ&quot;ל) X (0.12) / 600 OD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת V inf (מ&quot;ל) של כל תרבות ותרבות לצינור microcentrifuge ולסובב את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר supernatant resuspend התאים 10 מיליליטר חיץ הסתננות (10 מ&quot;מ MES, pH 5.5, 10 מ&quot;מ MgSO 4) על ידי vortexing לזמן קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים resuspended תאים של pBYGFP + + pREP110 P19, לסובב את התאים למטה XG ב 12,000 במשך 2 דקות, וresuspend בסכום כולל של 50 מ&quot;ל של חיץ הסתננות. שילוב Agrobacteria זה לביטוי geminiviral של ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדומה לכך, לערבב את השילובים הבאים של תאי Agrobacteria, ספין למטה וresuspend אותם 50 מ&quot;ל של חיץ הסתננות. הם כוללים (1) pBYDsRed + + pREP110 P19 לביטוי geminiviral של DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 לשיתוף ביטוי של ה-GFP וDsRed, (3) pREp110 + P19 כבקרה שלילית של ביטוי geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 לביטוי MagnICON של ה-GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 geminiviral pCH14011 לביטוי MagnICON של DsRed, ו( 6) pICH15879 + pCH14011 כביקורת שלילית לביטוי MagnICON. </li></ol> 2.2 הכנה להסתננות אבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן ותרבות כל זן GV3101 המכיל וקטורי geminiviral או וקטורי MagnICON לתוך 15 מ&quot;ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה בבקבוק 50 מ&quot;ל autoclaved ולגדול בין לילה כמתואר לחדירת מזרק לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום ערכי OD 600 לכל תרבות נוזלית עם ספקטרופוטומטר ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V משנה) להיות subcultured לתרבות חדשה עם 600 OD של 0.025 מתחיל ב250 מ&quot;ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה . V תת </sub<html> &gt; (מ&quot;ל) = (250 מ&quot;ל) x (0.025) / 600 OD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת V משנה (מ&quot;ל) של תרבות הלילה ל( 250 - V משנה) מ&quot;ל של תקשורת YENB בבקבוק 1 ליטר autoclaved עם אנטיביוטיקה מתאימה לכל זן ולגדול התרבות החדשה בין לילה, כמתואר לחדירת מזרק לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום OD 600 ערכים עבור כל תרבות נוזלית ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V INF) להיות מדולל ב3 ליטר של חיץ חדירה לתת OD 600 סופי של 0.12 לכל זן. V inf (מ&quot;ל) = (3000 מ&quot;ל) X (0.12) / 600 OD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה וresuspend V inf (מ&quot;ל) של כל תרבות ותרבות במאגר החדירה כמתואר לחדירת מזרק ומערבבים תרבויות resuspended בהתאם לשילובים שתוארו לחדירת המזרק. Repellet תאי Agrobacteria המעורבים resuspend אותם 3 ליטר של חיץ הסתננות. </li></ol>S = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הסתננות הסתננות מזרק 3.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ארבע הזקן נ 6 שבועות צמחי benthamiana עם 5 משאיר כל אחד. שלושת הדפים הראשונים לספור מהחלק העליון של כל צמח יהיה הסתנן לחלוטין עם אחד מהשילובים של א &#39; tumefaciens זנים בחיץ הסתננות. העלה הרביעי יהיה ספוט שחדר עם כל צירופי זן ארבעת לביטוי geminiviral או כל שלושת שילובים לביטוי MagnICON. הדף האחרון בכל מפעל יהיה הסתנן עם שילובים של ביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ניק קטן עם מחט בעור בצד האחורי של העלה (איור 2 א). שים לב: הקפד לא לשרוט כל כך קשה כמו לחדור דרך העלה משני הצדדים, כמו תאי Agrobacteria בתערובת ההסתננות יעברו דרך לנקב לצד השני של העלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את אחיזה איתנה של הצד הקדמי של העלה ותוך יישום עדיןלחץ נגדי לניק עם האגודל של יד אחת, להזריק את תערובות Agrobacterium בחיץ חדירה לניק עם מזרק בלי מחט (איור 2). הערה: כתערובת Agrobacterium נכנסה למרחב אינטר של העלה, באזור שהחדר יהפוך ירוקה בעליל כהה (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להזריק את תערובות Agrobacterium לניק עד העיגול הירוק הכהה מפסיק להתרחב. ליצור עוד ניק וחזור על שלבי 3.1.2-3.1.4 עד שכל העלים הוא שחדר ועלו כולו הופך ירוקה כהה יותר בשלושת הדפים הראשונים ובדף האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעלה הרביעי של כל צמח, ארבעה (וקטור geminiviral) או שלוש (MagnICON וקטור) כל השילובים יהיו חדרו לתוכו. לעשות אחד ניק עבור כל שילוב של זני Agrobacterium, ולחדור לכל ניק עם שילוב אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חדירה, לחזור צמחים לחדר הצמיחה ומוניביטוי חלבון טור בין חדירת פוסט 2-15 ימים (dpi). </li></ol> הסתננות אבק 3.2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אמבטיה לייבוש ואקום וחיץ חדירת L 3 העברה המכיל את זני Agrobacterium לאמבטיה. חברו לתא ייבוש משאבת ואקום סרעפת VACUUBRAND (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צמח במהופך על צלחת ייבוש (איור 3) ולהוריד את הצלחת עם הצמח עד שמערכת כולה גבעול העלה והוא שקוע לתוך מאגר החדירה עם הצלחת מונחת על של האמבטיה. מניחים את טבעת O ייבוש לאורך השפה ולשים את מכסה תא ייבוש על החדר (איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת הוואקום ולהתחיל עיתוי שבו מגיע ל -100 mbar הוואקום. לאט לאט לפתוח את שסתום השחרור בייבוש לאחר דקות 1 ב 100 mbar, כדי לאפשר כניסה של Agrobacteria לתוך חללי ביניים של רקמת צמח מתחת למים. חזור על פעולה זו אחת additiזמן onal כדי להבטיח חדירה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חדירה, לקחת את הצמח מחוץ לייבוש והחזיר אותו למצב הזקוף שלו. להעביר צמחים לחדר הצמיחה וביטוי חלבון לפקח בין 2-15 dpi. </li></ol> 4. איתור חלבון פלואורסצנטי וצילום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ 2 dpi, צמחים לעבור לחדר חשוך ולהאיר אור UV בצד האחורי של עלים שחדר עם מנורת UV מוחזקת ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב פלואורסצנטי הירוקה של GFP או הקרינה האדומה של DsRed. GFP נותן את אות חזקה עם אור UV גל ארוך, בעוד DsRed הוא חזק יותר תחת אור UV גל קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמונות של עלים ניאון עם מצלמה דיגיטלית רגילה ללא פלאש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר צמחים לחדר הצמיחה לאחר תצפית או צילום. </li></ol>

<ol><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22Transgenic+Horticultural+Crops%3A+Challenges+and+Opportunities+-+Essays+by+Experts%22">Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts</a>. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).</li>
<li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li>
<li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559(2010).</li>
<li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+new+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biopharm.+Rev%22%5BJournal%5D)">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22New+Generation+Vaccines%22">New Generation Vaccines</a>. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).</li>
<li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li>
<li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li>
<li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li>
<li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li>
<li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li>
<li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li>
<li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li>
<li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li>
<li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li>
<li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells%3A+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Tech.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103(2013).</li>
</ol>

המחברים לא מתחרים אינטרסים כספיים.

הדרישה הגוברת לתרופות המבוססות על חלבונים ברחבי העולם דורשת פלטפורמות ייצור חדשות כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. צמחים הראו להיות אחת ממערכות הייצור החלופיות המבטיחות ביותר לייצור חלבון תרופות. בשנים האחרונות, ההתפתחות של וקטורים מבוססי וירוס מפורקים אפשרה ביטוי חולף של חלבונים בצמחים, אשר משפר באופן משמעותי את המהירות ואת התשואה של מערכות ביטוי צמח 2,10. כדי לייעל עוד יותר את השירות של מערכת הביטוי החולף, אנחנו מדגימים את הגישה פשוטה אך יעילה וניתן להרח...

מאז 1970, צמחים נחקרו כחלופות לתרביות של תאי יונקים, חרקים, חיידקים ולייצור המסחרי של חלבונים רקומביננטיים ותרופות 1 חלבון. מערכות המבוססות על הצמח לביטוי של תרופות ביולוגיות הראו הבטחה בשנים האחרונות כמספר טיפולים החדשניים למחלות, כמו מחלת גושה 2, ושפעת עופות H5N1 3, הראו הצלחה בניסויים קליניים. פיתוח מנגנונים מוסמכים לביטוי חלבון רקומביננטי בצמחים בעשורים שחלף מאז ניסויים הראשוניים יצר את הפוטנציאל למערכות המבוססות על הצמח לשנות את הפרדיגמה הנוכחית של ייצור חלבון משלוש סיבות עיקריות. ראשית, יש ירידה בולטת בעלות כbioreactors יונקים, חרקים, חיידקים ודורשים עלויות משמעותיות בהפעלה, תקשורת צמיחה היקרות, מסובכים ותהליכים לטיהור מורד הזרם 4. יצירת הצמח מהונדס יציבקווים גם מאפשר להם לעבור את יכולת ההרחבה של מערכות ביטוי אחרות ניתן לגדל צמחים לבטא חלבון ונקטפו בקנה מידה חקלאית 5. שנית, מערכות ביטוי על בסיס צמחי להפחית באופן משמעותי את הסיכון להעברת הפתוגן אדם או בעל חיים מהמארח החלבון להביע לבני אדם, הוכיחו עליונות בביטחון ציבור 6. לבסוף, צמחים לנצל את מערכת endomembrane אוקריוטים כי הוא דומה לתאי יונקים, דבר המאפשרים לשינוי לאחר translational הנכון של חלבונים, כולל glycosylation וההרכבה של חלבונים מרובים מקטע 7. יכולת זו מעמידה את מערכות על בסיס צמחי לפני אלה המבוססים על מערכות פרוקריוטים, כגון חיידקים, שכן מספר רחב יותר של חלבונים רקומביננטיים תרופות, כולל נוגדנים חד שבטיים (מבז), יש מבנה מסובך יותר ודורש שינויים נרחבים posttranslational או הרכבה 8. ישנם שתי appro הגדולהכאבים כדי לבטא חלבונים רקומביננטיים בצמחים. הראשון הוא הפיתוח של קו מהונדס ביציבות, כאשר ה-DNA המקודד חלבון המטרה הוא משובט לתוך קלטת ביטוי והציג גם את הגנום הגרעיני או הכלורופלסט. בתוך כך, דנ&quot;א הזר הופך להיות תורשתי באמצעות דורות הבאים ומאפשר ליכולת הרחבה השתפרה מאוד, הרבה מעבר לזה של מערכות ביטוי אחרות 1. מבוא של ה-DNA אקסוגני לגנום הגרעיני מושגת בדרך כלל על ידי זיהום Agrobacterium tumefaciens של רקמת צמח או, לעתים קרובות יותר, בהפצצות microprojectile של הרקמה 9. הורמונים צמחיים משמשים לאחר מכן כדי לגרום להתמיינות וגדילה של רקמות צמח מהונדס כמו שורשים ועלים. הפיכתו של הגנום הכלורופלסט לא ניתן להשיג עם א &#39; tumefaciens, אלא מסתמך אך ורק על חלקיקי זהב או טונגסטן מצופה דנ&quot;א ירה בליסטי לתוך תאי צמח. השיטה השנייה של הבעת recombinaחלבון NT בצמחים הוא דרך ביטוי חולף 10. בתרחיש זה, וקטורי הנגזרות וירוס מחסה הגן של עניין מועברים דרך א tumefaciens לצמחים המפותחים באמצעות תהליך הנקרא agroinfiltration. במקום להשתלב בגנום הצמח, מבנה הגן נמסר אז יהיה להתחיל לכוון את הייצור החולף של החלבון הרצוי, שיכול להיות שנקטפו ומבודד לאחר תקופת דגירה קצרה. ביטוי חולף גן מציע את היתרון של הצטברות גדולה יותר הכוללת חלבון, כמו גם זמן משופר של ייצור חלבון, כמו צמחים יהיו מוכנים לקצור כ 1-2 שבועות לאחר agroinfiltration 11. זו מהירה יותר באופן משמעותי מתהליכי ייצור, בחירה ואישור של קווי צמחים מהונדסים יציבים, אשר יכול לקחת מספר חודשים עד שנה. זה לעומת זאת, הוא גם המגבלה של מערכת הביטוי החולף, כפי שהוא לא יניב יציב גנטי צמח Liנס שיכול לשמש ליצירת בנק זרע לייצור מסחרי בקנה מידה גדול. למרות זאת, גישות פותחו כדי לשפר את הביטוי חולף בקנה מידה גדול. כאן אנו מדגימים שיטה אחת של דור של צמחים חולפים חלבון המבטא-ניקוטיאנה benthamiana באמצעות וקטורים ויראליים מפורקים נמסרו על ידי א tumefaciens. שתי שיטות עיקריות מפותחות עבור המשלוח של א &#39; tumefaciens לתוך רקמות צמח: היקף חדירת ספסל באמצעות מזרק והסתננות בקנה מידה גדולה באמצעות תא ואקום. שני הפרוטוקולים מתוארים כאן באמצעות נ benthamiana, אשר קשור באופן הדוק לצמח הטבק המשותף, כצמח הפונדקאי לביטוי זמני של שני חלבוני ניאון: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea ויקטוריה וחלבון פלואורסצנטי האדום מDiscosoma אלמוגים (DsRed) 12,13. נ benthamiana הוא הצמח הפונדקאי הנפוץ ביותר עבורחלבון רקומביננטי כי זה ניתן לשינוי גנטי, יכול להניב כמויות גבוהות של ביומסה במהירות, והוא מפיק זרעים פורה לייצור בהיקף של עד 14. יתרון נוסף של שימוש בנ benthamiana כמארחים לביטוי חלבון הוא הזמינות של מגוון רחב של וקטורי ביטוי 2,5. במחקר זה, שני וקטורים ויראליים מפורקים, אחד המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) רנ&quot;א replicon מערכת (וקטורי MagnICON) והאחר שהופק ממערכת replicon DNA (וקטורי geminiviral) 4,11 וירוס הגמד הצהוב השעועית (BeYDV), 15-18, משמשים לביצוע ה-GFP וגן DsRed ולספק אותם לנ תאי benthamiana Via A. tumefaciens. שלוש בונה DNA תשמש לGFP או ביטוי DsRed עם וקטורי MagnICON. הם כוללים &#39;מודול (pICH15879) המכיל את האמרגן ואלמנטים גנטיים אחרים לנהיגת הביטוי של גן המטרה, 3&#39; 5 מודול המכיל את הגן של עניין (Pich-GFP או Pich-DsRed), ומודול integrase (pICH14011) קידוד לאנזים המשלב 5 &#39;ו 3&#39; מודולים יחד על ביטוי 8,15. שלושה מבני DNA גם יש צורך לביטוי עם וקטורי geminiviral. בנוסף לוקטורים המכילים replicon של גן המטרה (pBYGFP או pBYDsRed), וקטור המקודד חלבון השכפול (pREP110) נדרש ההגברה של יעד replicon 11,14,16. יתר על כן, הכללתו של וקטור קידוד P19 מדכא השתקה מוירוס פעלולים סבוך עגבנייה היא רצויה לביטוי גן המטרה ברמה גבוה 11,16. יש בדרך כלל שלושה שלבים עיקריים לכניסתה של הגנים של חלבונים רקומביננטיים לתוך תאי צמח על ידי agroinfiltration כולל גידול צמח, א tumefaciens תרבות הכנה, והסתננות. כמו בכל שלב הוא קריטי להצלחתו הסופית של הליך זה ולכן, תיאור מפורט, לכל אחד מהם סיפקעבור שניהם חדירת מזרק וחדירת ואקום בהמשך.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> ראה הפניה: Lico and Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> ראה הפניה: Baird and Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> ראה הפניה: giritch and Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral Vector</td><td>Author' s Lab</td><td>n/a</td><td>ראה הפניה: Chen and He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Author' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens זן gv3101</td><td>מחבר' s Lab</td><td>n/a</td><td>ראה הפניה: Lai and Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, לוחות</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי hepa hydrate</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>תמצית שמרים בקטו</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Broth</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES hydrate buffer</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>221465</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack' s דשן</td><td>האמרט אינטרנשיונל</td><td>Jul-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 משאבת ואקום</td><td>פישר</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>אוויר ואקום שסתום רגולטור</td><td>פישר</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Desiccator 12 1/8" עם טבעת O</td><td>פישר</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L Tub</td><td>Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10 כוסות יעבוד</td></tr><tr><td>צלחת/מדף 230 מ"ל</td><td>פישר</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Propagation Tray Dome hydrofarm</td><td></td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton Tray</td><td>hydrofarm</td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo Hand Seeder</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>עגלת פלורה 4 מדף</td><td>האמרט אינטרנשיונל</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות תרבית תחתונים עגולים</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><<td>a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Incubator/Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>דגם אור אולטרה סגול#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

תרבית תאי יונקים היא הפלטפורמה הגדולה לייצור מסחרי של חיסונים לבני אדם וחלבונים טיפוליים. עם זאת, הוא לא יכול לענות על ביקוש העולמי הגובר לתרופות בשל יכולת הרחבה המוגבלת שלה ועלותו הגבוהה. צמחים הראו להיות אחת פלטפורמות ייצור התרופות החלופיות המבטיחות ביותר כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. ההתפתחות האחרונה של וקטורים מבוססי וירוס אפשרה ביטוי חולף ומהיר ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטיים בצמחים. כדי לייעל עוד יותר את השירות של מערכת הביטוי החולף, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, יעילה וניתן להרחבה להציג Agrobacterium המכיל יעד גן לתוך רקמות צמח במחקר זה. התוצאות שלנו מעידות agroinfiltration שעם שניהם ומזרק ואקום שיטות הביאו במבוא יעיל של Agrobacterium לעלים וייצור חזק של שני חלבוני ניאון; GFP וDsRed. יתר על כן,אנחנו מדגימים את היתרונות הייחודיים המוצעים על ידי שתי השיטות. חדירת המזרק היא פשוטה ואינה זקוק לציוד יקר. זה גם מאפשר את הגמישות או לחדור לכל החופשה עם גן המטרה אחת, או להציג את הגנים של מטרות מרובות בדף אחד. לפיכך, ניתן להשתמש בו לביטוי בקנה מידה מעבדה של חלבונים רקומביננטיים, כמו גם להשוואה בין חלבונים או וקטורים שונים לקינטיקה תשואה או הביטוי. הפשטות של חדירת המזרק גם מציעה השירות שלה בבית הספר תיכון ומכללה לחינוך לנושא של ביוטכנולוגיה. לעומת זאת, חדירת האבק היא חזקה יותר, וניתן לשנות כלפי מעלה לייצור מסחרי של חלבוני תרופות. הוא מציע גם את היתרון של להיות מסוגל agroinfiltrate מיני צמחים שאינם ניתן לחדירת המזרק כגון חסה וארבידופסיס. בסך הכל, שילוב של מזרק וagroinfiltration הוואקום מספק לחוקרים ומחנכים פשוטים, יעיל וחזקהמתודולוגיה לביטוי חולף חלבון. זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של חלבוני תרופות ולקדם את החינוך מדעי.

1. ביטוי של חלבונים ניאון על ידי חדירת המזרק כדי להדגים את היעילות של חדירת המזרק של Agrobacterium לתוך רקמות צמח, בדקנו את הביטוי של שני חלבוני ניאון - GFP וDsRed - ידי שני וקטורים שונים מפורקים צמחים ויראלי - geminiviral וMagnICON - בנ benthamiana. לנ העלים benthamiana שהסתננו לחלוטין עם וקטורים המכילים geminiviral Agrobacteria, הביטוי של GFP נצפה מעל האזור כל העלה תחת אור UV הח...

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן המכיל<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; לצמחים לביטוי חלבון חולף.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

מערכת ניסויית זו משתמשת באינפילטרציה של אגרו-בקטריום כדי להחדיר ביעילות קונסטרוקטים גנטיים לעלים לצורך ייצור רמות גבוהות של חלבון רקומביננטי. ראשית, גדלו צמחי end hamana בסביבה מבוקרת למשך ששה שבועות, עד שלושה ימים לפני האינפילטרציה. הכינו את תרביות ה-agrobacterium המכילות את הגן המטרה המיועד לביטוי בצמחים ביום האינפילטרציה.החדירו את תרביות ה-agrobacterium לרקמת הצמח באמצעות מזרק או באמצעות חלחול בוואקום. תוצאות כגון עוצמת הפלואורסצנציה הירוקה של GFP בעלי tobacco תחת אור UV מדגימות ביטוי חזק של חלבונים רקומביננטיים בצמחים, המשתווה למערכות ביטוי המבוססות על יונקים, חיידקים וחרקים הקיימות כיום. חלחול על ידי Agro הוא דרך יעילה להחדרת גנים זרים לתאי צמחים, דבר המוביל לרמת ביטוי גבוהה של חלבונים רקומביננטיים.ניתן להשתמש בשיטה עבור מגוון רחב של מיני צמחים. חשוב מכך, ניתן להגדיל את קנה המידה של התהליך לייצור מסחרי של חלבונים פרמצבטיים. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הקינטיקה והביטוי של GFP, וניתן ליישמה עבור חלבונים אחרים כגון חיסוני תת-יחידה, נוגדנים מונוקלונליים רקומביננטיים, וכן להשתמש בה בטיפולים לסרטן ומחלות זיהומיות.ניסוי מוצלח דורש תנאים אופטימליים הן עבור תרבית החיידקים והן עבור החומר הצמחי. תהליך חלחול זה קל יותר לשחזור לאחר הדגמה חזותית. התחל בהנחת עד 60 כדורי פית (peat pellets) במגש השבחה.הוסיפו ארבעה ליטרים של מי ברז והניחו לכדורי הכבול לספוג את המים במשך שעתיים. כעת, הוסיפו שני זרעי hamana לכל כדור כבול וכסו את המגש כיפה פלסטית שקופה לצורך הנבטה. מקמו את הזרעים בסביבה של 25 °C ו-84% לחות.שבועיים לאחר הזריעה, הסיר את הכיסוי והעבר את הצמחים למגש חדש. לאחר מכן, הוסף שני ליטרים של דשן Jack's בריכוז 1.48 גרם לליטר. המשך לגדל את הצמחים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.סביבה בעלת 50% humidity מדי יומיים. ספקו שני ליטרים של jack's fertilizer לכל מגש. בשבוע הרביעי, העבירו את הצמחים עם ה-peat pellets למגש חדש המכיל שישה צמחים להמשך גדילה עד לגיל שש שבועות.בחרו ארבעה צמחי hamama בני שש שבועות, עם חמישה עד שישה עלים לכל צמח. הקצו שלושה עלים להסננה מלאה עם זני האגרובקטריה הנושאים את הגנים הרצויים, עלה אחד לביקורת שלילית ועלה אחד להסננת נקודות. צרו חריץ קטן בעזרת מחט באפידרמיס בצדו האחורי של העלה, תוך הקפדה שלא לנקב את העלה משני צדדיו.החזקו בחוזקה את הצד הקדמי של העלה הראשון תוך הפעלת לחץ נגדי עדין על הצוואר. באמצעות אגודל של יד אחת, הזריקו את תערובות ה-agrobacterium בבופר חלחול (infiltration buffer) אל תוך הצוואר באמצעות מזרק ומחט.המשיכו להזריק את תערובות האגרובקטריום (agrobacterium) אל תוך החריץ עד שהמעגל הירוק הכהה מפסיק להתרחב. לאחר מכן, צרו חריץ נוסף וחזרו על ההזרקות עד שכל העלה יסונן והעלה כולו יהפוך לירוק כהה יותר. השלימו את הסינונים של שלושת העלים הראשונים, ועבור העלה האחרון, העלה הרביעי של כל צמח, סננו עם שילובי וקטורים של ארבעת וקטורי נגיעי ה-Gemini או שלושה וקטורי magcon.כמו כן, צרו חריץ אחד עבור כל שילוב של זני agrobacterium והחדירו לכל חריץ שילוב אחד. לאחר ההחדרה, העבירו את הצמחים בחזרה לחדר הגידול ועקבו אחר ביטוי החלבון בין יומיים ל-15 ימים. לאחר ההחדרה, הניחו אמבטיה בתוך מייבש ואקום והעבירו אליה שלושה ליטרים של בופר חדירה המכיל את זני ה-agrobacterium.לאחר מכן, חברו את המייבש למשאבת ואקום עם דיאפרגמה של מותג ואקום. כעת, הניחו צמח הפוך על פלטת המייבש והורידו את הפלטה עם הצמח עד שמערכת העלה והגבעול כולה שקועה בבופר האינפילטרציה, כאשר הפלטה נשענת על חלקו העליון של האמבט. לאחר מכן, מקמו את טבעת ה-O של המייבש לאורך השוליים.לאחר הנחת מכסה המייבש על התא, הפעל את משאבת הוואקום והתחל במדידת הזמן כאשר הוואקום מגיע ל-100 millibar. לאחר כיבוי משאבת הוואקום, פתח לאט את שסתום השחרור של המייבש לאחר דקה אחת ב-100 millibar כדי לאפשר חדירה של agro bacteria למרווחים הבין-תאיים של רקמת הצמח הטבולה. חזור על תהליך חדירה זה.בצעו את השלבים הראשונים כדי להבטיח חדירה טובה. לאחר מכן, הוציאו את הצמח מהחומר המייבש והחזירו אותו למנח זקוף. העבירו את הצמחים בחזרה לחדר הגידול ועקבו אחר ביטוי החלבון בין יומיים ל-15 ימים לאחר החדירה.כדי להדגים את יעילות ההחדרה של אגרובקטריה לרקמת צמח באמצעות מזרק, בדקנו את הביטוי של שני חלבונים פלואורסצנטיים, GFP ו-Ds red, באמצעות שני וקטורים ויראליים צמחיים דקונסטרוקטיביים שונים, Gemini viral ו-magcon, בעלי עלים של Hamana שהוחדרו באופן מלא באגרובקטריה המכילה וקטורים ויראליים מסוג Gemini. ביטוי GFP נצפה על פני שטח העלה כולו תחת אור UV, החל כבר מ-2D PI והגיע לשיא הצבירה ב-4 DPI.לעומת זאת, עלים שהוחדרו עם וקטור magcon המכיל שילובי agrobacterium הראו פלואורסצנציית GFP רק לאחר חמישה DPI והגיעו לשיא ההצטברות בשבעה DPI. לא נצפתה פלואורסצנציה ירוקה בעלים שהוחדרו עם תערובות agro bacteria של ביקורת שלילית של EP one 10 פלוס P 19, מה שמעיד על כך שהפלואורסצנציה הייתה ספציפית לגן GFP ולא הייתה תוצאה של פלואורסצנציית רקע מהעלים. בשיא ההצטברות, הפלואורסצנציה של וקטור magcon המבטא GFP היא אינטנסיבית יותר מזו של וקטור Gemini viral.לא נצפתה נמקרוזה משמעותית בעלים שהוחדרו עם מבני GFP; כאשר שני החלבונים הפלורסצנטיים בוטאו על אותו עלה באמצעות וקטורים ויראליים מסוג Gemini בשיטת הזרקה נקודתית באמצעות מזרק, הם זוהרו בצבע הפלורסצנטי הצפוי בנקודת ההחדרה. באופן מעניין, הדחסה משותפת של GFP ו-DS RED גרמה לפלורסצנציה צהבהבה. כמו כן נבחנה חדרה בוואקום כדי לפתח שיטת הדחסה אגרו-בקטריאלית ניתנת להרחבה, שניתן להשתמש בה לייצור רחב של חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכות ביטוי זמני בצמחים.כצפוי, נצפתה פלואורסצנציית GFP בכל העלים של הצמח שעבר אינפילטרציה בהשוואה לאינפילטרציה באמצעות מזרק. שיטה זו היא חסונה יותר ויכולה להשיג אינפילטרציה של כל צמח בלוח זמנים קצר בהרבה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות.ברוב המקרים הדבר נועד לתרבית חיידקי Agrobacterium, שכן זמן ההספיגה בפועל נמשך רק מספר דקות. להשגת יעילות הספיגה אופטימלית וביטוי חלבון ממוקד, יש לפעול לפי הפרוטוקול. זכרו לשלוט בפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי גידול הצמחים, ריכוז חיידקי ה-Agrobacterium, לחץ הוואקום ומשך הזמן, בתחום הביוטכנולוגיה של הצמחים.ניתן להשתמש בגישה ניסיונית זו כדי לחקור את הפיתוח והביופרודוקציה של חלבונים פרמצבטיים חדשים במגוון רחב של מיני צמחים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש ב-agro infiltration כדי להחדיר מבני גנים מטרות לצמח, ולאפשר למערכות ביטוי זמני בצמחים לייצר חלבון רקומביננטי, ברמה המתחרה בזו של תרביות תאים של יונקים, חיידקים וחרקים.

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בניקוטיאנה benthamiana. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לטיהור והדמיה חזותית של חלבונים רבים המשתמשים כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא הסתגלות למעבדת הוראה פנים אל פנים ווירטואלית במכללה, מתן מחקר מבוסס פרוייקט.

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי סימון קרבה (PL) במלפפון (Cucumis sativus L.) באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2)-AirID כמודל. השיטה מתארת בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירת אגרו-אין, חדירת ביוטין, מיצוי חלבונים וטיהור חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הראשון לחדירת ואקום מקומית למחקרי in vivo של טרנספורמציה גנטית של צמחים גדולים. באמצעות מתודולוגיה זו, השגנו לראשונה את הטרנספורמציה הארעית של קקאו בתיווך אגרובקטריום בפלנטה .

חדירה חקלאית כפויה בוואקום עבור בצמח טרנספורמציה של צמחים סרבנים: קקאו כמקרה בוחן

למד את שיטת האגרואינפילטרציה לביטוי חלבונים רקומביננטיים ברמה גבוהה בצמחי Nicotiana benthamiana. שיטה זו מאפשרת ייצור תרופתי בקנה מידה גדול.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

גלה סרטונים נוספים