Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

מערכת ניסויית זו משתמשת באינפילטרציה של אגרו-בקטריום כדי להחדיר ביעילות קונסטרוקטים גנטיים לעלים לצורך ייצור רמות גבוהות של חלבון רקומביננטי. ראשית, גדלו צמחי end hamana בסביבה מבוקרת למשך ששה שבועות, עד שלושה ימים לפני האינפילטרציה. הכינו את תרביות ה-agrobacterium המכילות את הגן המטרה המיועד לביטוי בצמחים ביום האינפילטרציה.

החדירו את תרביות ה-agrobacterium לרקמת הצמח באמצעות מזרק או באמצעות חלחול בוואקום. תוצאות כגון עוצמת הפלואורסצנציה הירוקה של GFP בעלי tobacco תחת אור UV מדגימות ביטוי חזק של חלבונים רקומביננטיים בצמחים, המשתווה למערכות ביטוי המבוססות על יונקים, חיידקים וחרקים הקיימות כיום. חלחול על ידי Agro הוא דרך יעילה להחדרת גנים זרים לתאי צמחים, דבר המוביל לרמת ביטוי גבוהה של חלבונים רקומביננטיים.

ניתן להשתמש בשיטה עבור מגוון רחב של מיני צמחים. חשוב מכך, ניתן להגדיל את קנה המידה של התהליך לייצור מסחרי של חלבונים פרמצבטיים. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הקינטיקה והביטוי של GFP, וניתן ליישמה עבור חלבונים אחרים כגון חיסוני תת-יחידה, נוגדנים מונוקלונליים רקומביננטיים, וכן להשתמש בה בטיפולים לסרטן ומחלות זיהומיות.

ניסוי מוצלח דורש תנאים אופטימליים הן עבור תרבית החיידקים והן עבור החומר הצמחי. תהליך חלחול זה קל יותר לשחזור לאחר הדגמה חזותית. התחל בהנחת עד 60 כדורי פית (peat pellets) במגש השבחה.

הוסיפו ארבעה ליטרים של מי ברז והניחו לכדורי הכבול לספוג את המים במשך שעתיים. כעת, הוסיפו שני זרעי hamana לכל כדור כבול וכסו את המגש כיפה פלסטית שקופה לצורך הנבטה. מקמו את הזרעים בסביבה של 25 °C ו-84% לחות.

שבועיים לאחר הזריעה, הסיר את הכיסוי והעבר את הצמחים למגש חדש. לאחר מכן, הוסף שני ליטרים של דשן Jack's בריכוז 1.48 גרם לליטר. המשך לגדל את הצמחים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.

סביבה בעלת 50% humidity מדי יומיים. ספקו שני ליטרים של jack's fertilizer לכל מגש. בשבוע הרביעי, העבירו את הצמחים עם ה-peat pellets למגש חדש המכיל שישה צמחים להמשך גדילה עד לגיל שש שבועות.

בחרו ארבעה צמחי hamama בני שש שבועות, עם חמישה עד שישה עלים לכל צמח. הקצו שלושה עלים להסננה מלאה עם זני האגרובקטריה הנושאים את הגנים הרצויים, עלה אחד לביקורת שלילית ועלה אחד להסננת נקודות. צרו חריץ קטן בעזרת מחט באפידרמיס בצדו האחורי של העלה, תוך הקפדה שלא לנקב את העלה משני צדדיו.

החזקו בחוזקה את הצד הקדמי של העלה הראשון תוך הפעלת לחץ נגדי עדין על הצוואר. באמצעות אגודל של יד אחת, הזריקו את תערובות ה-agrobacterium בבופר חלחול (infiltration buffer) אל תוך הצוואר באמצעות מזרק ומחט.

המשיכו להזריק את תערובות האגרובקטריום (agrobacterium) אל תוך החריץ עד שהמעגל הירוק הכהה מפסיק להתרחב. לאחר מכן, צרו חריץ נוסף וחזרו על ההזרקות עד שכל העלה יסונן והעלה כולו יהפוך לירוק כהה יותר. השלימו את הסינונים של שלושת העלים הראשונים, ועבור העלה האחרון, העלה הרביעי של כל צמח, סננו עם שילובי וקטורים של ארבעת וקטורי נגיעי ה-Gemini או שלושה וקטורי magcon.

כמו כן, צרו חריץ אחד עבור כל שילוב של זני agrobacterium והחדירו לכל חריץ שילוב אחד. לאחר ההחדרה, העבירו את הצמחים בחזרה לחדר הגידול ועקבו אחר ביטוי החלבון בין יומיים ל-15 ימים. לאחר ההחדרה, הניחו אמבטיה בתוך מייבש ואקום והעבירו אליה שלושה ליטרים של בופר חדירה המכיל את זני ה-agrobacterium.

לאחר מכן, חברו את המייבש למשאבת ואקום עם דיאפרגמה של מותג ואקום. כעת, הניחו צמח הפוך על פלטת המייבש והורידו את הפלטה עם הצמח עד שמערכת העלה והגבעול כולה שקועה בבופר האינפילטרציה, כאשר הפלטה נשענת על חלקו העליון של האמבט. לאחר מכן, מקמו את טבעת ה-O של המייבש לאורך השוליים.

לאחר הנחת מכסה המייבש על התא, הפעל את משאבת הוואקום והתחל במדידת הזמן כאשר הוואקום מגיע ל-100 millibar. לאחר כיבוי משאבת הוואקום, פתח לאט את שסתום השחרור של המייבש לאחר דקה אחת ב-100 millibar כדי לאפשר חדירה של agro bacteria למרווחים הבין-תאיים של רקמת הצמח הטבולה. חזור על תהליך חדירה זה.

בצעו את השלבים הראשונים כדי להבטיח חדירה טובה. לאחר מכן, הוציאו את הצמח מהחומר המייבש והחזירו אותו למנח זקוף. העבירו את הצמחים בחזרה לחדר הגידול ועקבו אחר ביטוי החלבון בין יומיים ל-15 ימים לאחר החדירה.

כדי להדגים את יעילות ההחדרה של אגרובקטריה לרקמת צמח באמצעות מזרק, בדקנו את הביטוי של שני חלבונים פלואורסצנטיים, GFP ו-Ds red, באמצעות שני וקטורים ויראליים צמחיים דקונסטרוקטיביים שונים, Gemini viral ו-magcon, בעלי עלים של Hamana שהוחדרו באופן מלא באגרובקטריה המכילה וקטורים ויראליים מסוג Gemini. ביטוי GFP נצפה על פני שטח העלה כולו תחת אור UV, החל כבר מ-2D PI והגיע לשיא הצבירה ב-4 DPI.

לעומת זאת, עלים שהוחדרו עם וקטור magcon המכיל שילובי agrobacterium הראו פלואורסצנציית GFP רק לאחר חמישה DPI והגיעו לשיא ההצטברות בשבעה DPI. לא נצפתה פלואורסצנציה ירוקה בעלים שהוחדרו עם תערובות agro bacteria של ביקורת שלילית של EP one 10 פלוס P 19, מה שמעיד על כך שהפלואורסצנציה הייתה ספציפית לגן GFP ולא הייתה תוצאה של פלואורסצנציית רקע מהעלים. בשיא ההצטברות, הפלואורסצנציה של וקטור magcon המבטא GFP היא אינטנסיבית יותר מזו של וקטור Gemini viral.

לא נצפתה נמקרוזה משמעותית בעלים שהוחדרו עם מבני GFP; כאשר שני החלבונים הפלורסצנטיים בוטאו על אותו עלה באמצעות וקטורים ויראליים מסוג Gemini בשיטת הזרקה נקודתית באמצעות מזרק, הם זוהרו בצבע הפלורסצנטי הצפוי בנקודת ההחדרה. באופן מעניין, הדחסה משותפת של GFP ו-DS RED גרמה לפלורסצנציה צהבהבה. כמו כן נבחנה חדרה בוואקום כדי לפתח שיטת הדחסה אגרו-בקטריאלית ניתנת להרחבה, שניתן להשתמש בה לייצור רחב של חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכות ביטוי זמני בצמחים.

כצפוי, נצפתה פלואורסצנציית GFP בכל העלים של הצמח שעבר אינפילטרציה בהשוואה לאינפילטרציה באמצעות מזרק. שיטה זו היא חסונה יותר ויכולה להשיג אינפילטרציה של כל צמח בלוח זמנים קצר בהרבה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות.

ברוב המקרים הדבר נועד לתרבית חיידקי Agrobacterium, שכן זמן ההספיגה בפועל נמשך רק מספר דקות. להשגת יעילות הספיגה אופטימלית וביטוי חלבון ממוקד, יש לפעול לפי הפרוטוקול. זכרו לשלוט בפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי גידול הצמחים, ריכוז חיידקי ה-Agrobacterium, לחץ הוואקום ומשך הזמן, בתחום הביוטכנולוגיה של הצמחים.

ניתן להשתמש בגישה ניסיונית זו כדי לחקור את הפיתוח והביופרודוקציה של חלבונים פרמצבטיים חדשים במגוון רחב של מיני צמחים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש ב-agro infiltration כדי להחדיר מבני גנים מטרות לצמח, ולאפשר למערכות ביטוי זמני בצמחים לייצר חלבון רקומביננטי, ברמה המתחרה בזו של תרביות תאים של יונקים, חיידקים וחרקים.