Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

מערכת ניסיונית זו משתמשת בהסתננות אגרו כדי להעביר ביעילות מבני גנים לעלים לייצור רמות גבוהות של חלבון רקומביננטי. ראשית, לגדל צמחי המנה בסביבה מבוקרת במשך שישה שבועות, שלושה ימים לפני ההסתננות. להכין את תרביות האגרובקטריום המכילות את גן המטרה שיתבטא בצמחים ביום ההסתננות.

הכניסו את תרביות האגרובקטריום לרקמת הצמח על ידי מזרק או הסננת ואקום. תוצאות כמו עוצמת הקרינה הירוקה של GFP בעלי טבק תחת אור UV מדגימות ביטוי חזק של חלבונים רקומביננטיים בצמחים המתחרה בזה של מערכות ביטוי מבוססות חיידקים וחרקים של יונקים. חדירה אגרו היא דרך יעילה להחדרת גנים טראנס לתאי הצמח, מה שמוביל לביטוי ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטיים.

זה יכול לשמש למגוון רחב של מיני צמחים. והכי חשוב, ניתן להגדיל אותו לייצור מסחרי של חלבונים פרמצבטיים. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הקינטיקה והביטוי של GFP וניתן ליישם אותה על חלבונים אחרים כמו חיסונים תת-יחידתיים, נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים, וניתן להשתמש בה בטיפולים לסרטן ומחלות זיהומיות.

ניסוי מוצלח דורש תנאים אופטימליים הן לתרבית החיידקים והן לחומר הצמחי. קל יותר לשכפל את תהליך החדירה הזה לאחר הדגמה חזותית. התחל בהנחת עד 60 כדורי כבול למגש ריבוי.

מוסיפים ארבעה ליטר מי ברז ונותנים לכדורי האפונה לספוג את המים למשך שעתיים. כעת, הוסיפו שניים וזרעי חמנה לכל כדור כבול וכסו את המגש בכיפת פלסטיק שקופה לנביטה. מניחים את הזרעים בסביבה של 25 מעלות צלזיוס, 84% לחות.

שבועיים לאחר הזריעה מסירים את הכיפה ומעבירים את הצמחים למגש חדש. לאחר מכן מוסיפים שני ליטר של 1.48 גרם לליטר. הדשן של ג'ק המשיכו לגדל את הצמחים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

סביבת לחות של 50% כל יומיים. ספק שני ליטר דשן ג'ק לכל מגש. בשבוע הרביעי, העבירו את הצמחים עם כדורי כבול למגש חדש המארח שישה צמחים להמשך צמיחה עד גיל שישה שבועות.

בחר צמחים בני ארבעה, שישה שבועות וחמאמה עם חמישה עד שישה עלים כל שלושה עלים לחדירה מלאה עם זני החיידקים האגרו-חיידקים המכילים את הגנים המעניינים. עלה אחד לבקרה השלילית ועלה אחד לחדירה נקודתית. צרו חתך קטן עם מחט באפידרמיס בצד האחורי של העלה, והקפידו לא לנקב את העלה משני הצדדים.

אחזו בחוזקה בצד הקדמי של העלה הראשון תוך הפעלת לחץ נגדי עדין על הצוואר. עם אגודל של יד אחת. הזרקו את תערובות האגרובקטריום במאגר הסתננות לצוואר בעזרת מזרק, מחט.

המשיכו להזריק את תערובות האגרובקטריום לתוך החריץ עד שהעיגול הירוק הכהה מפסיק להתרחב. לאחר מכן צור חתך נוסף וחזור על הזריקות עד שכל העלה חודר והעלה כולו הופך לירוק כהה יותר. חדירות מלאות של שלושת העלים הראשונים והעלה האחרון של העלה הרביעי של כל צמח חודרות עם שילובים וקטוריים של כל ארבעת הווקטורים הוויראליים של ג'מיני או שלושה וקטורים של מגקון.

כמו כן, הכינו חריץ אחד לכל שילוב של זני אגרובקטריום והסתננו לכל ניק בשילוב אחד. לאחר החדירה, החזירו את הצמחים לחדר הגידול ועקבו אחר ביטוי החלבון בין יומיים ל-15 ימים. לאחר ההסתננות, הכניסו גיגית לתוך ספיחה בוואקום והעבירו בשלושה ליטרים של מאגר הסתננות המכיל את זני האגרובקטריום.

לאחר מכן חבר את הייבוש למשאבת ואקום דיאפרגמה של מותג ואקום. כעת הניחו צמח הפוך על צלחת הייבוש והורידו את הצלחת עם הצמח עד שכל מערכת העלים והגבעול שקועה במאגר ההסתננות כשהצלחת מונחת על גבי האמבטיה. לאחר מכן, מקם את טבעת ה-O הייבוש לאורך השפה.

לאחר הנחת מכסה הייבוש על החדר, הפעל את משאבת הוואקום והתחל לתזמן כאשר הוואקום מגיע ל -100 מיליבר. לאחר כיבוי משאבת הוואקום, פתח לאט את שסתום השחרור על הייבוש לאחר דקה אחת ב-100 מיליבר כדי לאפשר כניסה של חיידקים אגרו-חיידקים לחללי הביניים של רקמת הצמח השקועה. חזור על הסתננות זו.

צעדים ראשונים כדי להבטיח הסתננות טובה. לאחר מכן הסר את הצמח מהחומר היבש והחזיר אותו למצבו הזקוף. החזירו את הצמחים לחדר הגידול ועקבו אחר ביטוי החלבון בין יומיים ל-15 ימים לאחר ההסתננות.

כדי להדגים את יעילות המזרק, חדירת אגרובקטריום לרקמת הצמח, בדקנו את הביטוי של שני חלבונים פלואורסצנטיים, GFP ו-Ds אדום על ידי שני וקטורים נגיפיים צמחיים מפורקים שונים, Gemini, viral ו-magcon for end. עלי חמאנה שחדרו לגמרי עם חיידקי אגרו המכילים וקטורים נגיפיים של מזל תאומים. ביטוי GFP נצפה על פני כל שטח העלים באור UV, החל מ-PI דו-ממדי והגיע להצטברות שיא ב-4 DPI.

לעומת זאת, עלים שחדרו עם וקטור מגקון המכיל שילובי אגרובקטריום הראו פלואורסצנטיות של GFP רק לאחר חמישה DPI והגיעו להצטברות המקסימלית שלו בשבעה DPI. לא נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה מעלים שחדרו עם תערובות אגרו חיידקים בקרה שלילית של EP אחד 10 פלוס P 19, מה שמצביע על כך שהפלואורסצנטיות הייתה ספציפית לגן GFP ולא הייתה תוצאה של פלואורסצנטיות רקע מהעלים. בשיא הצטברותו, הקרינה של וקטור מגקון המתבטא ב-GFP אינטנסיבית יותר מזו של וקטור נגיפי תאומים.

לא נצפה נמק משמעותי על עלים שחדרו עם מבני GFP כאשר שני החלבונים הפלואורסצנטיים באו לידי ביטוי באותו עלה באמצעות וקטורים נגיפיים של ג'מיני עם חדירת נקודת מזרק, הם זוהו עם צבעם הפלואורסצנטי הצפוי במקום בו הם הסתננו. מעניין שחדירה משותפת של GFP ו-DS RED הביאה לפלואורסצנטיות צהבהבה. חדירת ואקום נבדקה גם כדי לפתח שיטת חדירה אגרו ניתנת להרחבה שיכולה לשמש לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות ביטויים חולפים של צמחים.

כצפוי, פלואורסצנטיות GFP נצפתה עבור כל העלים של הצמח שהסתנן בהשוואה לחדירת מזרק. הוא חזק יותר ויכול להשיג חדירה לכל מפעל עם מסגרת זמן קצרה בהרבה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות.

לרוב זה מיועד לתרבית חיידקים אגרו מכיוון שזמן החדירה בפועל הוא רק כמה דקות ליעילות חדירה אגרו אופטימלית וביטוי חלבון ממוקד. עקוב אחר הפרוטוקול. זכור לשלוט בפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי גידול הצמח, ריכוז חיידקים אגרו, לחץ ואקום ומשך זמן בתחום הביוטכנולוגיה של הצמח.

ניתן להשתמש בגישה ניסויית זו כדי לחקור את הפיתוח והייצור הביולוגי של חלבונים פרמצבטיים חדשים במגוון רחב של מיני צמחים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להשתמש בהסתננות חקלאית כדי להעביר מבני גן מטרה לצמח ולאפשר למערכות ביטוי חולפות של צמחים לייצר חלבון רקומביננטי, המתחרה בזה של תרביות תאי חיידקים וחרקים של יונקים.