זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות את אות המיקום לפלסמודסמטות (plasmodesmata localization signal) בחלבוני מטרה. השיטה יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר של קשרים בין-תאיים בצמחים על ידי זיהוי רכיבים קריטיים באותים המכוונים חלבונים לפלסמודסמטות, מה שמקל בתורו על הובלה של מולקולות גדולות מתא לתא. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שההליך אמין וניתן להתאימו בקלות לגילוי של רצפי אותי מיקום לפלסמודסמטות ברוב החלבונים המכוונים לפלסמודסמטות.

הדגמה וידאו של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי סינון הצמחים וההכנה לתצפית קונפוקלית קשים ללמידה באמצעות פרסומים מודפסים טיפוסיים. שתלו זרעי Nicotiana benthamiana באדמה לחה ובצפיפות גבוהה. במהלך הגדילה, שמרו אותם בתא סביבתי מבוקר בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס ותחת 16 שעות אור ליום, הכולל כ-75 micromole של פוטונים למטר רבוע לשנייה.

לאחר שקוטר ה-u. fil מגיע לחצי סנטימטר, העבירו בזהירות את השתילים לעציצים גדולים יותר והמשיכו את גידולם באותה תא תחת אותם תנאים. תחזקו את הצמחים עד שיגיעו לשלב של ארבע עד שמונה עלים בתוך ארבעה שבועות.

בשלב זה, העלים הגדולים ביותר צריכים להיות בקוטר של ארבעה עד שישה סנטימטרים. לצורך זיהוי ואנליזה קלים, בחרו מערכת ביטוי ותייגו באופן פלואורסצנטי כל חלבון מובטא כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. הכינו פלסמיד המבוסס על pPZP-RCS2 כפי שמתואר, והוסיפו מיקרוגרם אחד ממנו לתרבית של 100 microliter של תאים כשירים של Agrobacterium tumefaciens.

הדגרימו את התאים על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו הקפאה מהירה (flash-freeze) של התאים בחנקן נוזלי למשך דקה אחת. לאחר מכן, חממו את התאים בטמפרטורה של 28 °C למשך 15 דקות והוסיפו מיליליטר אחד של מצע LB לתערובת התאים הכשירים.

לאחר הוספת מצע LB, החזירו את התאים בטמפרטורה של 28 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, סבבו את התאים ב-3,000 ×g למשך דקה אחת. השעיקו את משקע התאים ב-0.2 milliliters של מצע LB והעבירו אותם לצלחות אגר LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית.

גדלו את התאים על הצלחות בטמפרטורה של 28 °C למשך 48 שעות עד להופעת מושבות בודדות. לאחר מכן, בחרו והעבירו מספר מושבות בודדות לצלחות LB agar טריות וגדלו את התאים בטמפרטורה של 28 °C למשך 48 שעות. לאחר מכן, קחו כמות קטנה של בקטריות מכל צלחת לצורך אנליזה והשתמשו ב-Colony PCR כדי לאשר את נוכחותם של המבנים הבינאריים הספציפיים הרצויים.

העבירו כל מושבת אגרובקטריום (agrobacterium) עם הקונסטרוקט הרצוי לחמישה מיליליטר של מצע LB המועשר באנטיביוטיקה המתאימה. גדלו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 28 °C. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 3,000 ×g. השעיקו את המשקע עד להגעה ל-OD600 של 0.5 בבופר אינפילטרציה לאגרובקטריום (agroinfiltration buffer).

דגרו את התרחף למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העמיסו את התוסיף למזרק פלסטיק של מילליטר אחד. החזיקו עלה בוגר לחלוטין של N.Benthamiana בעזרת אצבע כפופה בכפפה על הפני השטח העליון (adaxial face), והצמידו את פיית המזרק לאפידרמיס התחתון של העלה. לאחר מכן, הכניסו לאט את ה-agrobacterium שבתווך הסינון על ידי הזרקת התווך.

יש להחזיק את הצמח שהוחדר לו החומר עד למועד התצפית. השתמשו בלהב כדי לחתוך כל עלה למקטעים בין העורקים 24 עד 48 שעות לאחר ההחדרה. הניחו את פרוסות העלה על זכוכית המיקרוסקופ כאשר הצד האבאקסיאלי (התחתון) של העלה פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, הניחו טיפה של מים על פרוסת העלה וכסו אותה עם זכוכית כיסוי. קבעו את זכוכית הכיסוי בעזרת חתיכות קטנות של סרט דביק בכל צד. העבירו את השקופית אל מתחת למיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר והשתמשו בעדשת אובייקטיב 10X כדי לזהות את התאים בעלי האות הטוב ביותר.

לאחר מכן, השתמש בעדשה אובייקטיבית 63X כדי להקליט תמונות לצורך תצפיות מפורטות יותר. בנוסף, השתמש בפלואורסצנטים המתאימים כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים המובעים. שמור על כל ההגדרות המשמשות לרכישת התמונות על מנת לשמור על עקביות בין הניסויים.

בממוצע, בחנו 100 עד 120 תאים עבור כל תנאי ניסוי. אשחו את הלוקליזציה של החלבונים הנבדקים באמצעות תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי. תמונות אלו ממחישות את דפוסי הלוקליזציה האופייניים של נקודות פריפריאליות ב plazasmodesmata שנצפו עבור חלבון התנועה של TMV באורכו המלא המהוזה למולקולת המטען CFP, ועבור סיגנל הלוקליזציה ל-plasmodesmata שזוהה וההוזה ל-CFP, וכן עבור חלבון הלוקליזציה ל-plasmodesmata שהובע במקביל, PDCB1 המהוזה ל-DsRed.

בתנאי בקרה, התכוון לפלסמודסמטות של חלבון התנועה של TMV באורך מלא המחובר ל-CFP ושל סימון הלוקליזציה בחלבון התנועה של TMV המחובר ל-CFP, מופיע כפי שניתן לראות כאן עם לוקליזציה תת-תאית של CFP ולוקליזציה נוקלאו-ציטופלזמית של המארקר DsRed2. כאשר חומצת האמינו הרביעית, ואלין, מוטציה לאלנין, אובד התכוון לפלסמודסמטות הן של חלבון התנועה של TMV באורך מלא והן של סימון הלוקליזציה שזוהה בחלבון התנועה של TMV. דבר זה מעיד כי שארית זו חשובה למבנה או לתפקוד של סימון הלוקליזציה לפלסמודסמטות.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו ב-50 שעות במידה והיא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בצמחים במצב בריאותי תקין מאוד ובשלב עלים מתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לא רק לגבי האופן שבו ניתן לזהות סיגנל של חלבון הממוקם בפלסמודסמטות, אלא גם כיצד לזהות סיגנלים מסוימים אחרים בחלבונים של צמחים.