זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אות לוקליזציה של פלסמודסמטה בחלבוני מטרה. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר הקשרים הבין-תאיים של צמחים על ידי זיהוי חשיבה ביקורתית באותות המכוונים חלבונים לפלסמודסמטה, מה שבתורו מקל על הובלת תא לתא של מולקולרי גדול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שההליך אמין וניתן להתאים אותו בקלות לגילוי רצפי אותות לוקליזציה של פלסמודסמטה ברוב החלבונים הממוקדים של פלסמודסמטה.

הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את השתילה, הסינון וההכנה לשלבי תצפית קונפוקליים על ידי פרסום טיפוסי מבוסס הדפסה. שתלו זרעי Nicotiana benthamiana באדמה רטובה ובצפיפות גבוהה. בזמן הגידול, שמור אותם בתא סביבתי מבוקר בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס ומתחת ל-16 שעות אור ביום, המכיל כ-75 מיקרומול של פוטונים למטר מרובע לשנייה.

לאחר שקוטר ה- u. fil מגיע לחצי סנטימטר, העבירו בזהירות את השתילים לעציצים גדולים יותר והמשיכו את צמיחתם באותו תא באותם תנאים. שמרו על הצמחים עד שהם גדלים לשלב של ארבעה עד שמונה עלים תוך ארבעה שבועות.

בשלב זה, העלים הגדולים ביותר צריכים להיות בקוטר של ארבעה עד שישה סנטימטרים. לזיהוי וניתוח קלים, בחר מערכת ביטוי ותייג פלואורסצנטי כל חלבון מבוטא כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הכן פלסמיד מבוסס pPZP-RCS2 כמתואר והוסף מיקרוגרם אחד ממנו לתרבית של 100 מיקרוליטר של תאים מוכשרים מ- Agrobacterium tumefaciens.

דגרו את התאים על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, הקפיאו את התאים בחנקן נוזלי למשך דקה אחת. לאחר מכן, יש לחמם את התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מדיום LB לתערובת התאים המוסמכת.

לאחר הוספת מדיום ה-LB, החזירו את התאים ל-28 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, סובב את התאים ב-3,000 פעמים G למשך דקה אחת. השעו מחדש את כדור התא ב-0.2 מיליליטר של מדיום LB וצלחו אותם על צלחות אגר LB סלקטיביות אנטיביוטיות.

גדל את התאים על הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות עד שמושבות בודדות נראות לעין. לאחר מכן, בחרו וצלחו כמה מושבות בודדות על צלחות אגר LB טריות וגידלו את התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר מכן, קח כמות קטנה של חיידקים מכל צלחת לניתוח והשתמש ב-Colony PCR כדי לאשר את נוכחותם של המבנים הבינאריים הספציפיים המעניינים.

הוסף כל מושבת אגרובקטריום עם המבנה המעניין לחמישה מיליליטר של מדיום LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה. גדל את התאים בן לילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-3,000 פעמים G.השעו מחדש את הגלולה ל-OD600 של 0.5 במאגר אגרו-אינפילטרציה.

דגרו את התרחיף למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העמיסו את החיסון למזרק פלסטיק של מיליליטר אחד. אוחזים בעלה N.Benthamiana בוגר לחלוטין עם אצבע עטויה כפפה על הפנים האדקסיאליות, לחץ את זרבובית המזרק על האפידרמיס התחתון של העלה. לאחר מכן, הכניסו לאט את האגרובקטריום למדיום ההסתננות על ידי הזרקת המדיום.

שמור על הצמח שהסתנן עד שיש לצפות בו. השתמש בלהב כדי לחתוך כל עלה לשברים בין הוורידים 24 עד 48 שעות לאחר החדירה. הנח את פרוסות העלים על שקופית האובייקט כשמשטח העלה האבקסיאלי פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, הניחו טיפת מים על פרוסת העלה וכסו אותה בכוס הכיסוי. קבעו את זכוכית הכיסוי עם חתיכות סרט קטנות מכל צד. העבר שקופית מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר והשתמש בעדשה סובייקטיבית פי 10 כדי לזהות תאים עם האות הטוב ביותר.

לאחר מכן, השתמש בעדשה סובייקטיבית של 63X כדי להקליט תמונות לתצפיות מפורטות יותר. בנוסף, השתמש בפלואורסצנטים המתאימים כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים המבוטאים. שמרו על כל ההגדרות המשמשות לרכישת תמונות כדי לשמור על עקביות בין הניסויים.

בממוצע, בדוק 100 עד 120 תאים עבור כל מצב ניסוי. אבחן את הלוקליזציה של החלבונים שנבדקו באמצעות תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי. תמונות אלה ממחישות את דפוסי הלוקליזציה האופייניים של פלסמודסמטה לנקב היקפי שנצפו עבור חלבון התנועה TMV באורך מלא שהתמזג למולקולת המטען CFP, ועבור אות הלוקליזציה של פלסמודסמטה שזוהה התמזג ל-CFP, כמו גם עבור חלבון הלוקליזציה של פלסמודסמטה המתבטא במשותף, PDCB1 התמזג ל-DsRed.

בתנאי בקרה, מיקוד הפלסמודסמטה של חלבון התנועה TMV באורך מלא שהתמזג ל-CFP ואות הלוקליזציה בחלבון התנועה TMV שהתמזג ל-CFP, מופיע כפי שמוצג כאן עם לוקליזציה תת-תאית של CFP ולוקליזציה נוקלאוציטופלזמית של הסמן DsRed2. כאשר חומצת האמינו הרביעית, ואלין, עוברת מוטציה לאלנין, פלסמודסמטה מכוונת הן על ידי חלבון התנועה TMV באורך מלא והן על ידי אות הלוקליזציה המזוהה בחלבון התנועה TMV אובדת. זה מצביע על כך ששאריות אלה חשובות למבנה או לתפקוד האות של לוקליזציה של פלסמודסמטה.

לאחר שליטה, ניתן לסיים טכניקה זו תוך 50 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהצמחים יהיו במצב בריא מאוד והצמחים נמצאים בשלב העלים הנכון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב, לא רק כיצד לזהות אות חלבון לוקליזציה של פלסמודסמטה, אלא גם לדעת לזהות אותות מסוימים אחרים בחלבונים צמחיים.