אופטימיזציה וניצול Agrobacterium בתיווך ב Nicotiana

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח שיטה פשוטה, יעילה וניתנת להרחבה לייצור חלבון רקומביננטי חולף במערכת מבוססת צמחים תוך שימוש בטכניקת חדירה אגרו. זה מושג על ידי אופטימיזציה של תנאי הגידול של הצמח. השלב השני הוא טרנספורמציה של אגרובקטריום עם וקטורי שיגור המשלבים רכיבים של וירוסים צמחיים ופלסמידים בינאריים, ולאחר מכן תרבית האגרובקטריום שעבר טרנספורמציה לשימוש בניסויים החקלאיים.

במהלך חדירת אגרובקטריום, הצמחים מתהפכים וחלקי אוויר טובלים בתרחיף אגרובקטריום. לאחר מכן מופעל ואקום הגורם לפינוי אוויר מחללים בין-תאיים ברקמות העלים. באמצעות St Rapid לחץ חוזר לאחר שחרור הוואקום מביא לעירוי של תרחיף האגרובקטריום לעלים.

בסופו של דבר, מבחני כתמים חיסוניים ופלואורסצנטיים משמשים להצגת ייצור חלבון רקומביננטי בצמחים שהסתננו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הסננה ידנית, הוא שניתן להרחיב את שיטת הסננת הוואקום לייצור תעשייתי של חלבונים רקומביננטיים, כולל חיסונים וחלבונים טיפוליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוטכנולוגיה של הצמח, ולהקל עוד יותר על השימוש בצמחים כפלטפורמה חלופית לייצור מסחרי של חלבון רקומביננטי.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשגילינו שהגדלת הסינון החקלאי בצמחים הגדלים בקרקע היא מאתגרת. מכמה סיבות, האדמה מכילה אוכין כגון וירוסים, חיידקים, נמטודות, ובנוסף, תכולת הקרקע ומי ההשקיה משתנים מאצווה לאצווה ומעונה לעונה, וביצי האדמה לאורך זמן באחסון. יתר על כן, היפוך של צמחים הגדלים באדמה יגרום לטפטוף לא רצוי של אדמה לתוך תרבית האגרובקטריום במהלך החדירה.

ידגימו את ההליך הזה רבקה סנואו, עוזרת מחקר בכירה מהמעבדה לביולוגיה של הצמח וההנדסה, ואמה גוט רובין לובה. היא, היא ואדם טרבור, שהם עוזרי מחקר מהמעבדה שלי. מחקר זה משתמש במצע גידול צמחים הידרופוני ובתמיסת תזונה כדי להבטיח אחידות של צמיחת הצמח ולמנוע מורכבויות הקשורות לשימוש באדמה לגידול צמחים.

כדי להתחיל בהליך זה, יש להשרות לוחות צמר סלעים בתמיסת דשן צמחי למשך חמש דקות, לזרוע ידנית זרעים על משטח צמר הסלעים הספוג בחומרים מזינים. באמצעות הארז יוערכו במחקר זה שלושה מינים של ניקו אוקיאנה, שני מינים מסוג בר, ניקו אוקיאנה, בנהם אנה וניקו אוקיאנה אקסלסיור, והכלאה של בנהם, אנה ואקסלסיור בשם ניקו אוקיאנה. אקסלה מגדלת צמחים מהזרעים בתנאים מבוקרים ותקופת צילום ארוכה של יום במערכת מדורגת הידרופונית גדלה.

ניקו אושיאנה, בנת'ם מיאנה וניקו אוקיאנה אקסלה במשך ארבעה עד חמישה שבועות, וניקו אוקיאנה אקסלסיור במשך חמישה עד שישה שבועות. זני Fasion של גידול Agrobacterium ששימשו בניסוי זה עברו טרנספורמציה עם וקטורי השיגור המתאימים כמתואר בכתב היד המצורף. למטרות הדגמה זו משתמשים בחמישה זני אגרובקטריום מותאמים.

GV 3 1 0 1, הנושא חלבון פלואורסצנטי ירוק מדווח, או גן GFP GV 3 1 0 1, הנושא את הגן הנגיפי של מדכא ההשתקה של וירוס הפעלולים העגבניות P 19 ו-A 4 GV 3 1 0 1, ו-T 10. נושא את הגן של חלבון נשא שעבר שינוי או ליקוק KM לגדל זני אגרובקטריום בן לילה במדיום LB, בתוספת 50 מיליגרם לליטר של פחית מיצין ב-28 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 עד 250 סל"ד למחרת. הכנת תרחיפי אגרובקטריום לניסויים הרצויים כדי לבחון את היתכנות השימוש בזני אגרובקטריום מרובים לייצור חלבון חולף, לדלל זן מעבדה ושני זנים מסוג בר, המכילים את וקטור ה-PBI של ארבעה ק"מ ללקק במילי Q מים לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.5.

כדי לחקור את הצורך בהשראת גנים אלימים של אגרובקטריום לפני ההסתננות, תרביות אגרובקטריום צנטריפוגות ראשונות הנושאות את וקטור ה-P bid 4G FP שגדל במדיום LB ב-4,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השעו מחדש במדיום אינדוקציה MMA לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.5 וערבבו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לבדוק אם חרוט אצטיל משפר את ייצור החלבון החולף צנטריפוגה ותרבית אגרובקטריום. נושא את וקטור PBI 4G FP שגדל בן לילה במדיום LB ומושעה במאגר הסתננות המכיל מלח X ms אחד 10 מילימולר, MES ו-2% גלוקוז.

חלקו את תרחיף התאים לארבעה מיכלים. הוסף ריכוז שונה של חרוט אצטו לכל אחד ממתלי האגרובקטריום ודגר בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לבחון את ההשפעה של חדירה משותפת של מדכא השתקה ויראלית על תערובת ייצור חלבון GFP חולף.

תרבית אגרובקטריום מדוללת במים של מילי Q הנושאת את הגן GFP ותרבית הנושאת את מדכא ההשתקה הנגיפי P 19 ביחס של ארבעה לאחד במהלך חדירת ואקום של צמחים, אשר יודגם. הבא הוא קריטי לשליטה בלחץ הוואקום ומשך החדירה לצמחים מסתננים בוואקום. ראשית, העבירו את תרחיף האגרובקטריום המוכן למיכל בתוך תא הוואקום.

לאחר מכן הפוך את הצמח הפוך באגרובקטריום המדולל והחל ואקום של 50 עד 400 מיליבר למשך 30 או 60 שניות. החדירה האופטימלית מיושמת באופן שגרתי ב-50 עד 100 מיליבר למשך 60 שניות. לאחר שבירת הוואקום, הוציאו צמחים מתא הוואקום, שטפו במים וגידלו במשך חמישה עד שבעה ימים באותם תנאי גידול המשמשים לגידול לפני סינון.

כדי להכין דגימות לניתוח מערבי, ראשית, אסוף דגימות עלים אקראיות מצמחי ניקו אושיאנה, בנהם מיאנה, ניקו אוקיאנה אקסלסיור או ניקו אוקיאנה אקסלה ארבעה עד שבעה ימים לאחר החדירה או DPI לרסק את דגימות העלים בחנקן נוזלי לאבקה דקה. הוסף שלושה נפחים של מאגר XPBS אחד המכיל 0.5% טריטון X 100 לכל דגימה, והעבר את הדגימה לצינור einor. יש לנער או לסובב בעדינות את הדגימות שחולצו למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

סובבו את התמצית במשך חמש דקות ואספו את החלבון המסיס הכולל לתוך שפופרת עינור נקייה. יש לדלל את התמציות לדילול מתאים במאגר מיצוי XPBS אחד, ולהוסיף חמישה x מאגר דגימה לריכוז X אחרון. הרתיחו דגימות במשך חמש דקות לפני הפרדת החלבונים לפי דף SDS.

לאחר העברת חלבונים לקרום העברת P נייח וזיהוי GFP באמצעות סרום אנטי-GFP רב-שבטי של ארנב בדילול של 1 עד 5,000 בתמיסת חסימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה עם נדנדה עדינה לאחר שטיפת הממברנות שלוש פעמים עם X-P-B-S-T 20 אחד. דגירה עם הנוגדן נגד כלבת מצומד צנון הסוסים פרוקסידאז הוסף דילול של 1 עד 5,000 למשך שעה לזיהוי GFP.

לאחר מכן, הכתמים המערביים מעובדים ועוצמות הפס המתאימות לחלבונים מנותחות כמתואר בכתב היד המצורף. זיהוי חזותי של פלואורסצנטיות GFP בצמחים שלמים שעברו טרנספורמציה חולפת מתבצע באמצעות מנורת UV באורך גל ארוך כף יד, השתמש במצלמה דיגיטלית וזמן חשיפה של 15 שניות כדי לצלם צמחים שעברו טרנספורמציה זמנית באמצעות מסנן שמונה ES 52 צהוב. השג תמונות מניתוחי כתמים מערביים באמצעות תוכנת הצמדת הגנים בגנום.

כימות התוצאות באמצעות תוכנת כלי הגנים עם עקומת כיול המבוססת על תקן GFP מטוהר, ניק אושיאנה בנת'ם מיאנה גדל על לוחות רוקוול שהושרו בדשנים זמינים מסחרית כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לגידול צמחים והצטברות ביומסה. נוכחות הזרחן היא קריטית להשגת נביטה וצמיחה של NICO Oceana. זרעי בנת'ם כפי שמוצג על ידי צמחים בני שישה שבועות אלה הגדלים בתמיסת דשן המכילה 4.8% זרחן או בתמיסת דשן המכילה 0% זרחן.

ההשפעות של גידול אגרובקטריום ואמצעי חדירה על בריאות הצמח וייצור החלבון נבדקו על ידי השוואת ייצור GFP בניקוטיאנה. צמחי המנה חדרו בוואקום עם PBI 4G FP המכילים תרביות אגרובקטריום הגדלות בשלוש מדיות שונות. תרביות YEB AB ו-LB שגדלו בן לילה במדיה YEB או LB צנטריפוגה במהירות נמוכה והושעו מחדש במדיום אינדוקציה MMA או גדלו בן לילה במדיה YEB LB או AB ודוללו ישירות אחד עד חמישה או אחד עד 10 במי Milli Q כפי שמודגם בתוצאת הכתם המערבי הזה, צמחים שהסתננו עם תרביות אגרובקטריום שגדלו במדיה YEB LB או AB ודוללו ב-Milli Q. מים לא הראו הבדל משמעותי בייצור GFP ממוצע מתרבויות צנטריפוגות והושעו מחדש ב-MMA.

לכן, מי מילי Q מומלצים לדילול תרביות אגרובקטריום לחדירת צמחים ושימשו באופן שגרתי בניסויים הבאים להשגת צפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.5. לאחר מכן, נבדקו ההשפעות של צפיפות ההשעיה של תאי אגרובקטריום ומהלך הזמן על ביטוי המטרה. הוערכו ארבע צפיפויות שונות של תרחיף תאים של אגרובקטריום הנושא PBI 4G FP ודגימות עלים נאספו בארבעה, שבעה ועשרה ימים לאחר החדירה או DPI לניתוח כתמים מערביים בארבעה DPI, היו הבדלים ניכרים בקרינה של GFP בין צמחים שחדרו עם צפיפות תרחיף תאים שונה של אגרובקטריום לא נצפה ביטוי GFP ב-600 של 0.05 בשבעה D-P-I-G-F-P.

הקרינה הייתה דומה בצמחים שחדרו בתרחיף התאים. צפיפות של 601.0, 0.5 ו-0.1, אך היו שתלים נמוכים יותר שחדרו ב-A 600 של 0.05 בניגוד ל-10 DPI. לא נצפו הבדלים בייצור GFP בין צמחים שחדרו לאף אחד מארבעת צפיפויות תרחיף התאים כדי להגדיל את מגוון זני האגרובקטריום הזמינים לייצור חלבון חולף.

צמחי Nicotiana Benham miana חדרו לוואקום עם שבעה זנים שונים של חיידקים חקלאיים המכילים את הווקטור KBI ארבעה ק"מ. העלים שחדרו נאספו ב-7 DPI ורמת ביטוי הקינאז הוערכה על ידי כתם מערבי. כפי שמוצג בגרף זה, הרמה הגבוהה ביותר של ייצור ליאז הושגה עם הזנים GV 3 1 10, 1 A 4 ו-LBA 4 4 0 4 עם הבדלים קלים.

בעוד שרמת הביטוי הנמוכה ביותר הייתה עם C חמש, שמונה C, ייצור ליאז ביניים אחד הושג עם זנים T 77 A, T אפס שש ופעילות אנזימטית של T 10 ליאז הודגמה באמצעות בדיקת XMO Graham. חלבון הליאז החיידקי המטוהר שימש כבקרה חיובית לפעילות האנזים. מעניין לציין שצמחי ניקוטיאנה בנהם מיאנה שהסתננו עם A ארבע ו-T שבעה זני אגרובקטריום מסוג בר הראו תסמינים פתולוגיים כמו עיכוב, התארכות חיות מחמד וסלסול ועלים ב-7 DPI.

התסמינים היו קלים בצמחי ניקוטיאנה בנהם שחדרו לסוג הבר בזן T 10. לא נצפו תסמינים בצמחי ניקו אושיאנה בנהאם שהסתננו עם זן המעבדה GV 3 1 0 1. השוואה של ייצור ביומסה צמחית במינים מסוג הבר גילתה כי באותם תנאי גידול, הביומסה הגבוהה ביותר של העלים שניתן להפיק מ-Nico Oceana Excela גבוהה בערך פי שניים בהשוואה ל-Nico Oceana.

ייצור החלבון של בנהאם נבדק בניקו אושיאנה בנהאם, ניקו אושיאנה אקסלסיור וניקו אוקיאנה אקסלה שחדרו עם זן האגרובקטריום. GV 3 1 0 1 הצטברות PBI 4G F-P-G-F-P הוערכה בשבעה DPI בעלים שלמים שהסתננו. בדיקה ויזואלית של ביטוי GFP באור UV הראתה התפלגות אחידה של GFP בניקו אושיאנה המנה וניקו אוקיאנה אקסלה והתפלגות לא אחידה בניקו אוקיאנה אקסלסיור עקב קושי לחדור לאזור עלה שלם של ניקו אוקיאנה אקסלסיור ניתוח הכתם המערבי של הצטברות GFP בעלים אלה שהסתננו בשבעה DPI הראה שרמת ה-GFP הייתה גבוהה יותר בניקו אוקיאנה המנה מאשר בניקו אוקיאנה אקסלה וניקו Oceana Excelsior הרמה הנמוכה של ייצור חלבון בניקו אושיאנה.

אקסלסיור נובע מחדירה לא אחידה והתפלגות לא אחידה של GFP שהצטבר בעלה שנאסף. כדי לבחון את השפעת לחץ הוואקום על העלים, צמחי ניקו אושיאנה בנהאם חדרו עם זן האגרובקטריום, GV 3 1 0 1 המכיל PBI 4G FP בלחץ ואקום של 400, 200, 100 או 50 מיליבר בזמן החזקת ואקום של 30 או 60 שניות. לא נצפו הבדלים בייצור GFP והשפעה מזיקה קלה עד ללא השפעה על בריאות הצמח כאשר הופעלו לחצי ואקום של 5, 100 ו-200 מיליבר למשך 30 או 60 שניות.

השפעת משך הוואקום על ביטוי המטרה הוערכה על ידי חדירה אחת של מפעלי ניקו אושיאנה בנהאם מדי שעה עם A 600 של 0.5 של GV 3 1 0 1 המכיל PBI 4G FP למשך שמונה שעות. באותה תרבית אגרובקטריום כפי שמוצג בתוצאה מייצגת זו, רמת ייצור ה-GFP הייתה דומה בכל הזמנים, מצביעה על שמונה שעות, מה שמרמז על כך שלאורך פרק זמן זה האגרובקטריום שומר על יכולתו לשגר DNA גדיל יחיד. מכיוון שכימיקלים וחד סוכרים רבים דווחו כמשפרים את ייצור החלבון החולף במיני צמחים שונים.

מחקר זה העריך גם את ההשפעה של ריכוזים שונים של אצטו, קרינון וגלוקוז. על ייצור חלבון GFP חולף בניקו אושיאנה בנהם, אנה הסתננה עם זן האגרובקטריום, GV 3 1 0 1 המכיל PBI 4G FP. חיידקי האגרו גודלו בן לילה במדיה YEB, צנטריפוגה והושעה ל-a 600 של 0.5 או ב-MMA המכיל 2% גלוקוז עם אצטיל סרון בריכוזים שצוינו או ב-MMA המכיל 200 אצטופנון מיקרו-מולרי עם גלוקוז בריכוזים שצוינו. כפי שמוצג כאן, אף אחד מהריכוזים שנבדקו של תרכובות אלו לא גרם לעלייה משמעותית בייצור חלבון GFP בהשוואה לביקורת שבה אמצעי האינדוקציה לא הכיל אצטופנון או גלוקוז.

לאחר מכן, ההשפעה של חדירה משותפת של מדכא השתקה על ביטוי חולף של גנים GFP ו-HAC אחד בניקו אושיאנה. עלי בנהאם נבדקו לפני ההסתננות אגרובקטריום GV שלוש תרביות אחת עשר ואחת המכילות PBI 4G FP ומדכא ההשתקה הנגיפי P 19 של נגיף הפעלולים העגבניות עורבבו בהתאמה ביחסים של אחד לאחד, שניים לאחד, שלושה לאחד וארבעה לאחד. כפי שעולה מתוצאות ניתוח הכתמים המערביים ב-7 DPI, נוכחותו של P 19 לא הגדילה או הפחיתה את ייצור ה-GFP בניקוטיאנה בנהם מיאנה ביחס כלשהו של שניים מהתרחיפים האגרובקטריום.

בנוסף, נבדקה ההשפעה של שני מדכאי השתקת גנים נגיפיים P 23 ו-P 19 על מניעת השתקת גנים לאחר שעתוק עבור HAC אחד. קופה של אגרובקטריום הנושא את וקטור השיגור PBI ארבעה HAC, אחד ואחד משני הפלסמידים מדכאי ההשתקה הנגיפית עורבבו ביחס של ארבעה לאחד בהתאמה והסתננו יחד לניקוטיאנה בנת'ם מיאנה. דגימות העלים שהסתננו נאספו משלושה עד שמונה DPI.

גרף זה מציג רמות ממוצעות של ביטוי HAC אחד משלושה ניסויים כפי שנקבע על ידי ניתוח כתמים מערביים. חדירה משותפת של ניקו אושיאנה בנהאם עם P 23 או P 19 הביאה לעלייה בייצור HAC אחד בהשוואה לשימוש ללא מדכא השתקה ב-60 pi. זה מצביע על כך ש-P 23 ו-P 19 יעילים במערכת זו.

כמו כן, נצפה כי הן בנוכחות והן בהיעדר מדכא השתקה, רמת ייצור החלבון HAC one החלה לרדת ב-7 DPI. זה מצביע על כך שעיתוי הירידה בייצור החלבון החולף בניקו אושיאנה בנהאם מיאנה שחדרה עם וקטור השיגור הוא ספציפי למטרה. לבסוף, היציבות של בנק תאי האגרובקטריום מוערכת מדי שנה על ידי חדירה לצמחי ניקוטיאנה בנהם עם אותה אצווה של בנק תאי האגרובקטריום כדי להעריך את הצטברות החלבון.

תוצאות מייצגות אלה מצביעות על כך שייצור חלבון HA one יציב מאוד במשך יותר משלוש שנים. הייצור הממוצע של HAC One במפעלי Nicotiana benam הוא 651 פלוס או מינוס 49.4 מיליגרם לקילוגרם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם את טכניקת ההסתננות החקלאית לייצור חלבונים רקומביננטיים בקנה מידה גדול, שיכול לשמש לייצור חיסון תת-יחידה, נוגדנים לחלבון תיאו ואנטיגנים אבחוניים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשלוט בצמח הצלב הידרופוני, להשתמש בחיידקים אגרו-ברי קיימא, לשלוט בלחץ הוואקום ובקצב הביטוי של החלבון. לאחר המאסטר, ניתן לבצע את טכניקת הסינון האגרו תוך 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי בתנאים מבוקרים.