ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבטא חלבונים בעלי תגית פלורסצנטית בתוך תאי חרקים זמינים מסחרית, לצורך הבהרה משופרת של תפקוד חלבונים ו/או תעבורה תאית של חלבונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של התא ובביוכימיה בנוגע לתפקוד חלבונים, אינטראקציות בין חלבונים ו/או לוקליזציה סוב-תאית של חלבונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להפיק קונסטרוקטים במהירות ולהעריך תפקודית חלבונים מובעים בתאים חיים ללא ההשפעות המזיקות הקשורות לביטוי באמצעות בקולו-וירוס, ובכך לשפר את התפוקה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות במחקר של חלבוני חרקים, ניתן להחיל אותה על כל מערכת שבה נדרש מחקר של תפקוד חלבונים או מיקום תאי. את הפרוצדורה לתרבית תאי חרקים ולטרנספקציה תדגים דני לרוי, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הוציאו את מבחנות המלאי של תאי SF9 ותאי Tni קפואים מהמקפיא בטמפרטורה של 80- °C ואפשרו להם להפשיר באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר ההפשרה, חטאו את המבחנות ב-70% ethanol והניחו אותן על קרח. כל מניפולציות התאים המצריכות פתיחה של מבחנות ובקבוקי תרבית רקמה חייבות להתבצע תחת מ পোশাক זרימה למינרית (laminar flow hood) כדי לשמור על תנאי סטריליות. הוסיפו ארבעה מיליליטרים של מצע חרקים ללא סרום לבקבוק T25 חדש, וארבעה מיליליטרים של מצע TNM-FH לבקבוק T25 אחר.

העבירו מיליליטר אחד של תאי Tni שהופשרו לבקבוק עם מצע חרקים נטול סרום, ומיליליטר אחד של תאי SF9 שהופשרו לבקבוק עם מצע TNM-FH. הניחו את הבקבוקים באינקובטור שאינו מלחח בטמפרטורה של 28 degree celsius והמתינו 30 עד 45 דקות כדי לאפשר לתאים להיקשר. החליפו את מצע הזריעה בחמישה מיליליטרים מהמצע המתאים.

החזירו את הבקריקים למדגרה לא-לחה בטמפרטורה של 28 degree celsius. עקבו אחר התמזגות התאים מדי יום. בצעו מעבר (Passage) לתאים כאשר הם מגיעים ל-90% confluency, כפי שמוצג בתמונות מייצגות אלו.

הטה את הבקבוק המכיל את התאים השטוחים (confluent) כך שהמצע יזרום לעבר פינה אחת הרחק משכבת התאים, והשתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית של 5 mL כדי להסיר בזהירות את המצע מבלי להפריע לתאים. עבור תאי Tni, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית חדשה של 5 mL כדי להוסיף בעדינות 4 mL של מצע חרקים ללא סרום על פני השכבה השטוחה. העבר את קצה הפיפטה לאורך הבקבוק ובצע שטיפה איטית כדי להסיר תאים שנקשרו באופן רופף לתחתית הבקבוק.

כדי לבדוק אם התאים התנתקו כראוי, יש להסיר את כל המצע, להפוך את הבקבוק ולוודא שתחתית הבקבוק נקייה. עבור תאי SF9, הנצמדים בחוזקה רבה יותר, יש להוסיף 4 mL של מצע TNM-FH טרי ולהשתמש במגרדת תאים (cell scraper) כדי לנתק את התאים הצמודים. השתמשו בפיפטה סרולוגית של 5 mL כדי לערבב בעדינות ולהפחית את התגבשות התאים.

לאחר ניתוק התאים, העבירו כ-0.1 מיליליטר מכל תערובת של תאים ומדיום לפרופילת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לפרופילת מיקרו-צנטריפוגה נפרדת של 0.5 מיליליטר, הוסיפו 10 מיקרוליטר מהתערובת של התאים והמדיום ל-10 מיקרוליטר של trypan blue. הוציאו את שקופית תא המנייה של סופר התאים מאריזתה, והוסיפו 10 מיקרוליטר מהתערובת של מדיום התאים ו-trypan blue לכל אחד מצדדי שקופית המנייה.

הכנס את העריסה לסופר תאים אוטומטי וקבע את צפיפות התאים והחיוניות שלהם. העבר כ-1 עד 1.5 על 10⁶ תאים לבקבוקי T25 עם מצע טרי. סמן את הבקבוקים עם שם שלב התאים, התאריך, סוג המצע שבו נעשה שימוש, מספר התאים שהתווספו ומספר המעבר.

הניחו את הבקבוקים באינקובטור בטמפרטורה של 28 °C למשך עד 72 שעות. יש לבצע את הליך הטרנספקציה של תאי חרקים תחת מ 빠르게 למינרית (laminar flow hood). זרעו בבקבוק T25 עד 1×10⁶ תאי Tni או SF9 במצע גידול מתאים לתאי חרקים.

בתדגמה זו נעשה שימוש בתאי Tni. יש לגדל את התאים עד להגעה לקונפלואנס (confluency) למשך 72 שעות בטמפרטורה של 18 degrees celsius. לאחר 72 שעות, יש להסיר ולהשליך את המצע הישן ולהפריד את תאי ה-Tni באמצעות ארבעה milliliters של מצע חרקים טרי נטול סרום, כפי שהודגם קודם לכן.

ההיבט המאתגר ביותר בפרוצדורה זו הוא השגתו של צפיפות תאים מתאימה המודבקים לצלחות בעלות קרקעית זכוכית במהלך הטרנספקציה. אין להוסיף לכל צלחת יותר מ-7×10⁵ תאים. לאחר הערכת צפיפות התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי, ערבבו ביסודיות אך בעדינות את תרחיף התאים על ידי היפוך המבחנה, והוסיפו כ-7×10⁵ תאים לצלחות זכוכית בודדות בקוטר 35 מילימטר.

אפשרו לתאים להיקשר במשך 20 עד 25 דקות בטמפרטורה של 28 °C. עבור כל טרנספקציה, הוסיפו 2 µg של DNA פלסמידי ל-0.1 mL של מצע חרקים נטול סרום ללא FBS בתוך מבחנה סטרילית של 1.5 mL למיקרו-צנטריפוגה. במבחנה נפרדת, ערבבו 8 µL של ריאגנט טרנספקציה עם 0.1 mL של מצע חרקים נטול סרום.

לאחר מכן, העבירו את התמיסה לשפרור המכיל את ה-plasmid DNA הרצוי. ערבבו קלות בעזרת vortex והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. בשלב הבא, דללו את תערובת הטרנספקציה של הפלסמיד עם 0.8 milliliters של מצע גידול לחרקים ללא סרום, עד להגעה לנפח כולל של מיליליטר אחד.

הסר בזהירות את המצע מהצלחת הזכוכית המכילה תאים צמודים. כסה את התאים הצמודים במצע טרנספקציית פלסמיד מדולל. דגור את התאים בטמפרטורה של 28 °C למשך חמש שעות.

לאחר חמש שעות, הסירו והשליכו את מצע התעתוק (transfection medium) ושטפו בעדינות את התאים עם מיליליטר אחד של מצע תאי חרקים נטול סרום, תוך הקפדה שלא לנתק את התאים. הוסיפו שני מיליליטרים של מצע תאי חרקים טרי נטול סרום והדגירה בטמפרטורה של 28 °C למשך 48 עד 72 שעות. 48 עד 72 שעות לאחר תעתוק תאי החרקים, שטפו את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של מצע חרקים IPL-41 ולאחר מכן כסו בשני מיליליטרים של IPL-41 לצורך הדמיה.

הוסיפו ארבע טיפות של רכיב צביעת תאים חיים Hoechst למצע והדגרירו בטמפרטורה של 28 °C למשך 20 עד 25 דקות. הניחו את הצלחת בעלת קוטר 35 מילימטר בתוך המיקרוסקופ הקונפוקאלי עם סריקת לייזר המובנית. למרות שצלחות זכוכית רבות זמינות מסחרית, חשוב שהן יתאימו לבמה של המיקרוסקופ, וייתכן שיהיה צורך לקבוע באופן אמפירי איזה כלי זכוכית הוא התואם ביותר להיצמדות תאים.

כווננו את המיקרוסקופ לתנאי תצפית עבור Hoechst, EGFP ו-mCherry. 359 nanometers ו-461 nanometers עבור עירור ופליטה של Hoechst. 489 nanometers ו-510 nanometers עבור עירור ופליטה של EGFP.

ו-580 ננומטר ו-610 ננומטר עבור העירור והפליטה של mCherry. באמצעות עדשה של 10X, בצעו סריקה ראשונית כדי לאשר את הביטוי הפלואורסצנטי. לאחר מכן, עברו למצב סריקה באמצעות עדשת ניגודיות פאזה (phase contrast) עם טבילה במים של 60X.

כוון את עוצמת הלייזר, רגישות הגלאי, מהירות הסריקה, עומק ציר Z והזום הדיגיטלי כדי למקסם את הניגודיות והרזולוציה של התמונה. דגם את התאים בזום דיגיטלי של 1.5X כדי להגיע להגברה כוללת של 90X. שמור וייצא את הנתונים הגולמיים כקבצי תמונה בפורמט TIFF לצורך ניתוח מאוחר יותר.

תאי Tni עברו טרנספקציה עם הפלסמידים המצוינים, והבעתם של חלבונים רקומביננטיים הודגמה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. טרנספקציה מוצלחת והבעה של BtDrip1-EGFP רקומביננטי ניכרות על ידי נוכחות פלואורסצנציה ירוקה על פני השטח של התא. תאים שעברו טרנספקציה עם גרסה אחת של BtDrip2-EGFP מראים פלואורסצנציה ירוקה בתוכם, המעידה על הבעה תוך-תאית של גרסה אחת של BtDrip2.

באופן דומה, תאים שעברו טרנספקציה עם PIB DmSPR-mCherry או PIB PLA2G15-mCherry מראים פלואורסצנציה אדומה המעידה על ביטוי של הכימרות הרלוונטיות. בתמונות הממוזגות, אזורים כתומים או צהובים מעידים על ביטוי שלทั้ง EGFP ו-mCherry, מה שמרמז על כך שהחלבונים ממוקמים יחד (co-localized) בתוך אותם מבנים תת-תאיים. חפיפה של תאים שעברו טרנספקציה כפולה עם PIB BtDrip1-EGFP ו-PIB DmSPR-mCherry מרמזת על מיקום משותף של BtDrip1-EGFP ו-DmSPR-mCherry על פני השטח של התא.

תאים שעברו טרנספקציה כפולה עם BtDrip2 גרסה אחת EGFP ועם PIB DmSPR-mCherry מראים קולוקליזציה מועטה של אותות פלואורסצנציה ירוקים ואדומים, מה שמאשר את הביטוי התוך-תאי של BtDrip2 גרסה אחת. לעומת זאת, ביטוי משותף של PIB BtDrip2 גרסה אחת EGFP ושל המרקר הליזוזומלי PIB PLA2G15-mCherry הוביל לחפיפה משמעותית באותות הפלואורסצנציה הירוקים והאדומים בציטופלזמה. הדבר מרמז בעוצמה כי BtDrip2 מובחן לליזוזומים תוך-תאיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבטא כימרות של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך תאי חרקים מתורגבים. מערכת זו מאפשרת בנייה מהירה של וקטורים בסינתזה של חלבונים, נמנעת מהאתגרים של מערכות ביטוי מבוססות וירוסים, ומספקת אמצעי חסון לצפייה בחלבונים המעורבים בתעבורה תאית.