כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת ולהשוות התפלגויות תלת מימדיות במקביל של שלושה רכיבי ביופילם תאיים וחוץ-תאיים לאחר טיפול בחומרים אנטיבקטריאליים. זה מושג על ידי ייצור תחילה ולאחר מכן ליטוש דגימות מרוכבות שרף. בשלב השני, הביופילמים המעניינים גדלים על הדגימות ולאחר מכן מטופלים בחומרים אנטיבקטריאליים.

לאחר מכן, הביופילמים מוכתמים בפלואורוכרומים עבור חומרים פולימריים חוץ-תאיים, חומצות גרעין וחלבונים, ולאחר מכן מצולמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. בשלב האחרון, תמונות תלת מימדיות של הפלואורוכרומים המונחים משוחזרות כדי להקל על הדמיה בו-זמנית של רכיבי הביופילם ופרמטרים מבניים מחושבים מתמונות הביופילם. בסופו של דבר, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם כגון נפח ביולוגי ועובי ממוצע של ביופילם כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת הטיפול לקבוצת הביקורת.

היתרון העיקרי של הליך זה על פני השיטות הקיימות הוא שהוא משתמש בטכניקות נפרדות אך קשורות זו לזו כדי לאפיין את ההתפלגות של רכיבים מרובים במבנה של ביופילמים הגדלים בתנאים ספציפיים, מה שמדגים את ההליך יהיה ד"ר פרננדו פלורס, עמית מחקר פוסט-דוקטורט, וגב' קריסטן סמארט, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי כדי ליצור את הדגימות התחל בהצבת תוספת אחת של 0.4 או TPH שלושה שרף שיניים מרוכב בהתאמה אישית הכין תבניות נירוסטה. לאחר מכן, פילמרו את התוספת הראשונה עם יחידת ריפוי אור LED למשך 40 שניות. לאחר חזרה על ההליך עבור התוספת השנייה, השתמש בליטוש מטחנה חצי אוטומטי כדי ללטש את הדגימות שנרפאו לגימור משטח סופי מקובל.

לבסוף, עקרו את הדגימות כדי לגדל את הביופילם. ראשית, יש לחסן מושבה בודדת של S mutans בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית לילה, ולאחר מכן לדגור על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות כדי להשיג צפיפות אופטית של לפחות 0.9. לאחר מכן, יש לדלל את התרבית ביחס של 1 ל-100 ב-10 מיליליטר של גידול ביופילם.

בינוני מעביר באופן אספטי את הדגימות המרוכבות של השרף הסטרילי ל-12 לוחות באר סטריליים, ולאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר מהתרבות המדוללת לכל אחת מהבארות. לקבוצות טיפול במי פה וביקורת, הוסיפו 2.5 מיליליטר של גידול ביופילם סטרילי לא מחוסן, בינוני לבארות בקרת הסטריליות, ולאחר מכן גדלו את הביופילמים ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים מיקרו-פאראפיליים על שייקר ב-100 סל"ד. לאחר 24 שעות, יש לשאוב באופן אספטי את המדיום מכל הבארות ולשטוף כל באר פעמיים עם 2.5 מיליליטר PBS סטרילי השואב את מי המלח לאחר כל שטיפה, ואז לחדש כל באר ב-2.5 מיליליטר של מצע גידול ביופילם טרי ולדגור את הצלחת למשך 24 שעות נוספות כפי שהודגם זה עתה לגידול ביופילם כולל משך של 48 שעות לאחר השלמת גידול הביופילם, שאפו את מצע הגידול ולאחר מכן חלקו 2.5 מיליליטר מי פה לכל קבוצת טיפול היטב ו-2.5 מיליליטר מים סטריליים אולטרה-טהורים לקבוצת הביקורת.

ערבבו היטב את הצלחות על שייקר אורביטלי ב-150 סל"ד, ולאחר מכן לאחר 60 שניות, שאפו גם את מי הפה וגם את המים האולטרה-טהורים מהבארות כדי להכתים את רכיב הפוליסכריד האקסו של הביופילמים. דגרו כל ביופילם עם 50 מיקרוליטר של מצומד LOR למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. לאחר מכן שטפו את הדגימות פעמיים עם 2.5 מיליליטר של מאגר TC השואב לאחר כל שטיפה וצבעו את חומצות הגרעין בכל ביופילם עם טיפה של 50 מיקרוליטר של ציטו תשע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.

לאחר שטיפת הדגימות פעמיים, יש לצבוע את רכיבי החלבון בכל ביופילם ב-50 מיקרוליטר של Cipro אדום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים, העבירו אותן לבארות בודדות של צלחת שש בארות המכילה שישה מיליליטר מים אולטרה-טהורים סטריליים לכל באר כדי להקל על ההדמיה שלהן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות של כל אחד מהכתמים המרכיבים בתוך הביופילמים של קבוצות הטיפול והביקורת. הגדר את הלייזרים של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי להגדרות הבאות לזיהוי פוליסכרידים אקסו על ידי כתם מצומד של Exor, השתמש בלייזר של 633 ננומטר ובפס פליטה של 659 עד 749 ננומטר לזיהוי חומצות גרעין על ידי כתם ציטו תשע.

השתמש בלייזר של 488 ננומטר ובפס פליטה של 495 עד 500 ננומטר, ולגילוי חלבונים על ידי כתם אדום Cipro, השתמש בלייזר של 543 ננומטר ובפס פליטה של 615 עד 651 ננומטר. לאחר מכן שימוש בעדשת טבילה פי 63 עם צמצם מספרי של 0.9 ומרחק עבודה של 2.2 מילימטרים. אסוף תמונות מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית ב-400 הרץ באמצעות סריקה רציפה במצב בין ערימות כדי לייעל את לכידת התמונות של כתמים מרובים באותו ביופילם.

לאחר ניתוח תמונות המיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית, השתמש באפשרות תפריט המעבד התלת-ממדי בתוכנת ניתוח תמונות מהירות כדי ליצור תמונה תלת מימדית משוחזרת של כתמי הרכיבים המונחים בתוך כל ביופילם. לאחר מכן, סובב את התמונה התלת-ממדית כדי לקבל תצוגה אופטימלית של הביופילם. לאחר מכן צלם תמונה של שחזור הביופילם וייצא את התמונה בפורמט קובץ תמונה מתאים.

לבסוף, בצע ניתוח חזותי של ההתפלגות המקבילה של חומצת הגרעין האקסו פוליסכריד ורכיבי החלבון בתוך הביופילמים. בתמונות המשוחזרות, חשב פרמטרים מבניים של ביופילם כגון נפח ביופילם ועובי ממוצע של ביופילם באמצעות תוכנת ISA 3D בטבלה זו, מוצגים ערכי הממוצע וסטיית התקן של פרמטרים מבניים של ביופילם המחושבים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. ערכי הממוצע וסטיית התקן עבור הפרמטרים המבניים של הביופילמים שטופלו במי פה שהיו שונים באופן משמעותי מאלה של הביופילמים בקבוצת הביקורת מודגשים במודלים מעורבים אדומים.

ניתוחים סטטיסטיים הראו כי מי הפה של Biotene PBF ייצרו מבני ביופילם השונים באופן משמעותי מקבוצת הביקורת בשני מרכיבי השרף, בעוד שמי הפה לטיפול מלא של ליסטרין לא יצרו הבדלים משמעותיים באף אחד ממרוכבי השרף, מה שמצביע בבירור על הבדלים במרכיבי הביופילם התאיים והחוץ-תאיים שנותרו לאחר שני טיפולי מי הפה. ניתן לדמיין את ההתפלגות המקבילה של אקסו, פוליסכרידים, חומצות גרעין וחלבונים בתוך הביופילמים באמצעות שחזורים תלת מימדיים שנוצרו באמצעות תוכנת מהירות. באיור זה, שחזור מייצג של ביופילמים של קבוצת ביקורת שגדלו על 0.4 מוצג שהצבע הכחול הוקצה לפוליסכריד אקסו.

בתוך ביופילמים של S mutans, הצבע הירוק הוקצה לחומצות גרעין והצבע האדום לחלבונים. החלל המתווך עשוי להיות תפוס על ידי מים או רכיבי ביופילם אחרים שלא סומנו באופן פלואורסצנטי. באיור זה מוצג שחזור מייצג של ביופילמים של קבוצת ביקורת שגדלו על שלושה מרוכבי שרף TPH עם הצבעים המייצגים את אותם רכיבים כמו האיור הקודם.

הליך זה הביא ליישום במגוון דיסציפלינות כגון הרפואה, רפואת השיניים, הגיאולוגית ומדעי הים. מכיוון שניתן להחליף מצעים וביופילמים רבים באלה המשמשים כאן.