Name: כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: חקור כימות תלת-ממדי של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בביופילמים לאחר טיפול בחומרים אנטיבקטריאליים באמצעות מיקרוסקופיית לייזר סורקת קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת ניתוח סטטיסטי מקיף של מבנה הביופילם ותגובתו לטיפולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון למחקר זה ניתן על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות/NIDCR 1R15DE019566-01A1. ד"ר. ג'ים הנתורן (מעבדת OUHSC לזרימה וציטומטריית תמונה) מוכר על מתן סיוע טכני במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. ד"ר פרננדו אסטבן פלורז (המחלקה לחומרים דנטליים) זוכה להכרה על מתן סיוע טכני במהלך צילומי הסרטון הזה.

1. הכנת מצעים וריאגנטים
<ol>
	<li>הכינו 300 ml של מצע גידול לתרבית לילה (THY; 3% Todd Hewitt Broth שהוכן לפי הוראות היצרן בתוספת 0.3% Yeast Extract במים אולטרה-טהורים) ועבדו באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך עד חודשיים.</li>
	<li>הכינו 1 L של אגר THY (3% Todd Hewitt Broth, 0.3% Yeast Extract, ו-1.5% אגר במים אולטרה-טהורים), עבדו באוטוקלבה, וקררו ל-60 °C לפני המזיגה לצלח petri. אחסנו ב-4 °C למשך עד 3 חודשים.</li>
	<li>הכינו 150 ml של מצע גידול לביופילם (0.5X TY בתוספת 10 mM סוכרוז; 1.5% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, ו-10 mM סוכרוז במים אולטרה-טהורים) ועבדו בסטריליזציה באמצעות סינון. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך עד חודש אחד.</li>
	<li>הכינו 1 L של תמיסת סליין בבופר פוספט (PBS; 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, ו-0.24 g KH2PO4 במים אולטרה-טהורים) ועבדו באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.</li>
	<li>הכינו 600 ml של בופר Tris HCl בריכוז 10 mM בתוספת 10 mM CaCl2 במים אולטרה-טהורים (בופר TC; pH 7.2) ועבדו באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.</li>
	<li>עבדו 1 L של מים אולטרה-טהורים באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.</li>
</ol>
2. הכנת הדגימות
<ol>
	<li>ייצרו דגימות בצורת דיסק של קומפוזיטים לשחזור שיניים מסוג Point 4 (PF) ו-TPH3 (TP) בתבנית פלדת אל-חלד בהזמנה מיוחדת, בשתי שכבות. כל שכבה עוברת פוטו-פולימריזציה למשך 40 sec באמצעות יחידת הארה מסוג LED. לשני המוצרים הרכבים ורמות מילוי שונות מעט, ובכך הם יוצרים טופוגרפיות שטח שונות שעליהן יגדלו הביופילמים.
	<ol>
		<li>ניתן לייצר דגימות של מצעים רלוונטיים באמצעות פרוטוקולים מבוססים מדיסציפלינות אחרות במקום שלב 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בצעו גימור והברקה לדגימות עד להשגת גימור שטח סופי מקובל, למשל, באמצעות מכשיר השחזה והברקה חצי-אוטומטי. שטפו את הדגימות המהולקות במים אולטרה-טהורים וייבשו באמצעות אוויר דחוס.</li>
	<li>סטריליזו את הדגימות באמצעות גז ethylene oxide או בשיטת סטריליזציה חלופית.</li>
</ol>
3. צמיחת ביופילם
<ol>
	<li>בצעו אינוקולציה של מושבה אחת של S. mutans לתוך 4 ml של תוצר גידול למשך לילה (שלב 1.1). הדגירו למשך לילה ב-37 °C למשך 16-18 שעות. הצפיפות האופטית (OD600) של התרבית צריכה להיות ≥0.9.
	<ol>
		<li>מומלץ להשתמש במושבה מתרביות בצלחות שעברו מעבר (passage) פעמיים ממלאי המקור, שכן הדבר מוביל לצמיחת ביופילם עקבית יותר.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכינו דילול של 1:100 באמצעות התרבית של הלילה (שלב 1.1) ב-10 ml של תוצר גידול לביופילם (שלב 1.3).</li>
	<li>העבירו דגימות סטריליות של קומפוזיט שרף (e.g. PF, TP) לצלחות סטריליות בעלות 12 בארות.</li>
	<li>הוסיפו 2.5 ml של תוצר גידול מדולל (שלב 3.2) לבארות המיועדות לקבוצות הטיפול (מי פה) והביקורת. הוסיפו 2.5 ml של תוצר גידול סטרילי לביופילם ללא אינוקולציה לבארות ביקורת הסטריליות.</li>
	<li>גדלו את הביופילמים בתנאים מיקרו-אווירופיליים. הניחו את הצלחות על שייקר במהירות של 100 rpm בתוך אינקובטור ב-37 °C למשך 24 שעות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, שאבו באופן אספטי את התוצר מכל הבארות ושטפו פעמיים עם PBS סטרילי (שלב 1.4; 2.5 ml/באר), תוך שאיבת ה-PBS לאחר כל שטיפה. מלאו מחדש 2.5 ml של תוצר גידול טרי לביופילם בכל באר והדגירו למשך 24 שעות נוספות תחת תנאים זהים לשלב הקודם, למשך זמן גידול כולל של הביופילם של 48 שעות.</li>
	<li>במקום השלבים המפורטים לעיל, ניתן לגדל ביופילמים של מינים אחרים על מצעים תוך שימוש בפרוטוקולים מבוססים.</li>
</ol>
4. טיפולים אנטיבקטריאליים/שטיפות פה
<ol>
	<li>שאבו את המצע לאחר השלמת צמיחת הביופילם.</li>
	<li>הוסיפו 2.5 ml של תמיסת פה מסוג Biotène PBF (BIO) או Listerine Total Care (LTO), או שיטת טיפול אחרת, לבארות של קבוצות הטיפול, והוסיפו 2.5 ml של מים סטריליים אולטרה-טהורים לבארת קבוצת הביקורת. השריו את הדגימות למשך 60 sec, בהתאם להוראות היצרן, תוך כדי ניעור של הפלטות על שייקר אורביטלי במהירות של 150 rpm. שאבו מיד את תמיסת הפה ואת המים האולטרה-טהורים מהבארות.</li>
	<li>שטפו את הדגימות 5 פעמים למשך 15 sec לכל שטיפה באמצעות מים סטריליים אולטרה-טהורים על השייקר האורביטלי במהירות של 150 rpm, תוך שאיבת המים לאחר כל שלב שטיפה.</li>
	<li>במקום השלבים שלעיל, ניתן לבחון חומרים אנטיבקטריאליים אחרים באמצעות פרוטוקולים מבוססים.</li>
</ol>
5. צביעה
<ol>
	<li>הכינו את דילול הצבעים עבור ניתוח הביופילם.
	<ol>
		<li>הכינו תמיסת מלאי (stock solution) בריכוז 5 mg/ml של Concanavalin A, Alexa Fluor 647 conjugate (AF) בתוך נתרבicarbonate 0.1 M ב-pH 8.3. אחסנו ב- -20 °C במנות בודדות לשימוש אחד למשך מספר חודשים, שכן יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרת. באמצעות תמיסת המלאי של AF, הכינו דילול של 250 μg/ml בבופר TC.</li>
		<li>הכינו דילול של 10 μM באמצעות תמיסת המלאי של Syto 9 (SY) בריכוז 5 mM, כפי שסופקה על ידי היצרן, בבופר TC. אחסנו את שארית תמיסת המלאי של SY ב- -20 °C למשך מספר חודשים.</li>
		<li>הכינו דילול של 10x באמצעות תמיסת המלאי של Sypro Red (SR) בריכוז 5,000x, כפי שסופקה על ידי היצרן, במים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים. אחסנו את שארית תמיסת המלאי של SR ב- -20 °C למשך מספר חודשים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>שטפו את כל הביופילמים פעמיים (2x) עם בופר TC (נפח של 2.5 ml/well) תוך כדי תנועת סיבוב ידנית, והשאירו את השטיפה השנייה בלוחית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאבו את הנוזלים.</li>
	<li>טפטפו 50 μl של צבע AF על כל דגימת ביופילם. צבעו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. שטפו פעמיים (2x) עם בופר TC (נפח של 2.5 ml/well), תוך שאיבה לאחר כל שטיפה.</li>
	<li>המשיכו בטפטוף של 50 μl של צבע SY על כל דגימת ביופילם. צבעו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. שטפו פעמיים (2x) עם מים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים (נפח של 2.5 ml/well), תוך שאיבה לאחר כל שטיפה.</li>
	<li>לבסוף, טפטפו 50 μl של צבע SR על כל דגימת ביופילם. צבעו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. שטפו שלוש פעמים (3x) עם מים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים (נפח של 2.5 ml/well), תוך שאיבה לאחר כל שטיפה.</li>
	<li>העבירו את הדגימות ללוחית בעלת 6 בארות, כאשר כל דגימה מונחת בבאר אחת ב-6 ml של מים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים, כדי להקל על ביצוע מיקרוסקופיה קונפוקלית.</li>
</ol>
6. דימות באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית
<ol>
	<li>רכש תמונות של כל רכיב (צבע) בתוך הביופילמים של קבוצות הטיפול והביקורת באמצעות מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי עם לייזר (CLSM), בהתאם להגדרות המוצגות ב- טבלה 1במחקר זה נעשה שימוש בעדשת טבילה (dipping lens) בעלת הגדלה של 63X, מפתח מספרי (numerical aperture) של 0.9 ומרחק עבודה של 2.2 מ"מ. 
	<img alt="Biofilm staining chart; laser wavelengths (nm) and emission bands (nm) for EPS, nucleic acids, proteins." fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
	טבלה 1. הגדרות מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי.</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>הגדירו את גודל הסריקה ל-250 μm x 250 μm ורזולוציית פיקסלים מינימלית של 512 x 512 כדי לרכוש תמונות CLSM ברזולוציה המתאימה לניתוח כמותי.</li>
	<li>השתמשו בצביעת SY כדי לקבוע את נקודות העליון והתחתון של ערימת תמונות הביופילם, ולאחר מכן הגדירו את ה-z-step כך שיהיה מתאים לניתוח כמותי (0.6 μm במחקר זה). לפני ביצוע הסריקה, בצעו אופטימיזציה לפרמטרי התמונה והצביעה (i.e. מתח ו-offset של ה-PMT) באמצעות אפשרות ה-QLUT. טבלת חיפוש צבעים (color look-up table) שימשה להקצאת פסאודו-צבעים לכל צבע (ירוק עבור SY, אדום עבור SR, וכחול עבור AF) כדי להפוך כל מרכיב בביופילם למובחן יותר בשחזור התלת-ממדי.</li>
	<li>רכשו תמונות CLSM בתדר של 400 Hz באמצעות סריקה סדרתית במצב "between stacks" כדי למקסם את לכידת התמונות של מספר צבעים בתוך אותו ביופילם.</li>
</ol>
7. ניתוח מבני של ביופילם
<ol>
	<li>נתחו את תמונות ה-CLSM שנאספו באמצעות תוכנה לניתוח תמונות של ביופילמים. השלבים הבאים מתארים את השימוש בתוכנת ISA3D12 לחישוב הפרמטרים המבניים של תמונות הביופילם שנאספו.
	<ol>
		<li>העתיקו את קבצי תמונות ה-CLSM עבור כל ביופילם לתיקיית Images, כפי שמפורט במדריך של התוכנה. ודאו כי אתם פועלים לפי מוסכמות השמיות של קבצי ה-CLSM הנדרשות על ידי התוכנה. התוכנה מאפשרת ניתוח של קבצים בתוך תיקיות משנה במצב אצווה (batch mode), ובכך מקלה על ניתוח ביופילמים של קבוצות טיפול ובקרה בריצה אחת.</li>
		<li>הזינו את ממדי צירי x, y ו-z של תמונות ה-CLSM בשדות dxy ו-dz בתיבת הדו-שיח הראשית. בחרו את הגדרות הסף (threshold) ומיפוי המרחקים, כפי שמתואר במדריך של התוכנה (במחקר זה נעשה שימוש ב-Otsu וב-Quasi-Euclidean, בהתאמה). הזינו שם מתאים לקובץ התוצאות, ולאחר מכן הפעילו את התוכנית. קובץ תוצאות ייווצר בתיקיית ISA.</li>
		<li>עיינו בקובץ התוצאות כדי לקבל ערכים עבור עשרים פרמטרים מבניים בתלת-ממד12, כגון נפח ביולוגי (biovolume) ועובי ממוצע של הביופילם (שנמדדו במחקר זה), המכמתים את ההתפלגות התלת-ממדית של כל רכיב (צבע) בתוך הביופילם.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. ויזואליזציה של מבנה הביופילם
<ol>
	<li>צרו שחזור של רכיבים חופפים (צביעות) בתוך כל ביופילם באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. השלבים הבאים מתארים את השימוש בתוכנת Volocity ליצירת שחזורים בתלת-ממד.
	<ol>
		<li>צרו ספרייה עבור כל ביופילם על ידי העתקת קבצי תמונות CLSM לתוך התוכנה, כפי שמתואר במדריך.</li>
		<li>השתמשו באפשרות התפריט 3D Renderer כדי להפיק תמונת תלת-ממד משוחזרת מתמונות ה-CLSM של כל ביופילם (במחקר זה נעשה שימוש בפורמט HR Opacity).</li>
		<li>סובבו את תמונת התלת-ממד כדי להכווין את כל הביופילמים באופן דומה ביחס לצירים x, y ו-z. צלמו תמונת מצב (snapshot) של שחזור הביופילם המכוון נכונה, ולאחר מכן ייצאו את תמונת המצב בפורמט TIFF, JPEG או פורמט מתאים אחר.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בצעו ניתוח חזותי של ההפצה הסימולטנית של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך הביופילמים על התמונות המשוחזרות.</li>
	<li>השתמשו במקדם המתאם של פירסון (Pearson's correlation coefficient) ובמקדם החפיפה של מנדרס (Manders' overlap coefficient) כדי לבצע ניתוח קולוקליזציה של רכיבי ביופילם מרובים (במחקר זה לא נמדדה קולוקליזציה).</li>
</ol>
9. ניתוח סטטיסטי
<ol>
	<li>השתמש בניתוחים סטטיסטיים של מודלים מעורבים נפרדים כדי להשוות את ערכי הממוצע של פרמטרים מבניים בין קבוצת מי פיית הפה לקבוצת הביקורת (α=0.05). למחקר זה, נעשה שימוש בתוכנת SAS לביצוע הניתוח הסטטיסטי.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. ההפקה והגישה החופשית למאמר זה ממומנים על ידי Leica Microsystems.

רכישת תמונות CLSM צריכה להתבצע באופן ובפורמט הדרושים לכימות ביופילמים ולניתוח קו-לוקליזציה, כך שהתפלגות עוצמת האות בכל תמונה היא ייצוג אמין של ההתפלגות של כל פלואורוכרום בערימת הביופילם. יש להבחין בין עוצמת האות לרעש ורקע10,11, שאינה מושפעת מאוטופלואורסצנטיות מהמצע, ובעלת דימום מינימלי עקב הפרעות ספקטרליות בין הפלואורוכרומים המשמשים11. רעש הוא מגבלה בלתי נמנעת של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית11, ואיכות התמונה יכולה לפעמים להיות מוגבלת מסיבות טכניות או לוגיסטיות. זיהוי פלואורוכרומים עם חפיפה ספקטרלית מינימלית הוא קריטי להצלחת שיטה זו, אך יכול להיות מסובך. יתר על כן, הכימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. לכן, אין זה מפתיע שמעט מאוד מחקרים כימתו בהצלחה את ההתפלגות המקבילה של יותר משני מרכיבים בתוך המבנים של ביופילמים.
מטרת מחקר זה הייתה לדווח על מתודולוגיה המורכבת משלבים נפרדים אך קשורים זה לזה לכימות והשוואה של ההתפלגות התלת-ממדית בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. בדיקת גידול הביופילם המתוארת מאפשרת גידול ביופילם על מצעים רלוונטיים ומייצרת מבני ביופילם הניתנים לשחזור, כפי שמודגם בתוצאות המדווחות בטבלה 1. השילוב של צביעה סימולטנית חדשה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין עם מדידת פרמטרים מבניים של ביופילם תלת מימדי מביא להתפלגות ניתנת לכימות של רכיבים בתוך ביופילמים. ניתוח ויזואלי איכותי של ההתפלגות המקבילה של EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך הביופילם אפשרי באמצעות שחזור של כתמים מכוסים בתוך כל ביופילם. תוכנת ISA3D12 מכילה מספר פרמטרים מבניים ייחודיים כגון ממד פרקטלי, הומוגניות ומקדם חספוס ביופילם בנוסף לפרמטרים הנמדדים באופן מסורתי כגון נקבוביות ועובי ביופילם כדי לשפר את הכימות של המבנים התלת-ממדיים של ביופילמים. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם מאפשר השוואות רלוונטיות של ביופילמים בתנאי ניסוי ספציפיים כגון יעילות אנטיבקטריאלית/אנטי-פאולינג (למשל לאחר טיפול במי פה) או לאורך זמן (השפעות זמניות).
מתודולוגיה זו כימתה והשוותה ביעילות ובהצלחה את ההתפלגות התלת-ממדית המקבילה של שלושה רכיבים עיקריים בביופילמים של S. mutans שגודלו על מצעים רלוונטיים, ובכך התגברה על שני אתגרים להערכה בו-זמנית של רכיבי ביופילם. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לקבוע את היעילות של טיפולים אנטיבקטריאליים או אמצעים נגד עכירות כנגד רכיבי ביופילם מרובים, כפי שהודגם באמצעות שטיפות פה במחקר זה. יתר על כן, ניתן להחליף את רוב הפרוטוקולים שתוארו לעיל בפרוטוקולים לייצור מצעים רלוונטיים ומבחני גידול ביופילם של מיקרואורגניזמים רלוונטיים. לכן, לשיטה זו יש יישום רחב מכיוון שהיא מאפשרת השוואה של מבנים/ארכיטקטורה תלת מימדיים של ביופילמים in vitro ו-in vivo במגוון דיסציפלינות כולל מדעי הרפואה, השיניים, הגיאולוגיקה והים.

ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות מובנות העטופות במטריצה חוץ-תאית המיוצרת בעצמה, ומחוברות למשטחים ביולוגיים או אינרטיים1. ביופילמים מייצגים אורח חיים נפוץ עבור חיידקים רבים, ונוצרים על ידי מעבר בשלבים מתאים צפים חופשיים (פלנקטוניים) לקהילות מורכבות מרובות מינים. העמידות המובנית של ביופילמים לחומרים אנטי-מיקרוביאליים היא השורש לזיהומים חיידקיים מתמשכים וכרוניים רבים1,2, כפי שמודגם על ידי ביופילמים אוראליים (רובד שיניים). מיקרואורגניזמים קריוגניים כגון מוטנס, סטרפטוקוק מעבדים סוכרוז ופחמימות אחרות כדי לייצר מטריצה חוץ-תאית וליצור חומצות שעלולות לפרק את מבנה השן ולגרום לעששת. רוב מטריצות הביופילם הן ביופולימרים המורכבים מרכיבים תאיים וחוץ-תאיים כגון אקסופוליסכרידים (EPS), חלבונים וחומצות גרעין3,4.
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), הטכניקה הנפוצה ביותר להדמיה פלואורסצנטית, שינתה באופן קיצוני את ההדמיה האופטית בביולוגיה מכיוון שיש לה את היכולת לאסוף תמונות תלת מימד של מבנים ביולוגיים מיובשים ללא קיבוע5,6,7. טכניקה לא הרסנית זו כוללת איסוף תמונות של חתכים דקים בתוך אזור עניין על הדגימה באופן שמסירים את התרומה של אור לא ממוקד. האיכות והרזולוציה של התמונות שצולמו על ידי CLSM הן מעבר למה שניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבה. חיסרון מרכזי אחד של CLSM הוא שסריקת תמונות מתרחשת בקצב איטי יותר מאשר בטכניקות מיקרוסקופיה רחבות, בהן תמונות שלמות נאספות בו זמנית5. עם זאת, עם מבחר הולך וגדל של פלואורוכרומים, לייזרים ומסננים, CLSM הפכה לאחת הטכניקות הרווחות להדמיה מולטי-ספקטרלית5,7.
מחקרים קודמים הראו ש-CLSM הוא כלי שימושי לבחינת המבנה או הארכיטקטורה של ביופילמים על ידי שימוש בתג פלואורסצנטי אחד או שניים או כתמים כדי לספק הבנה טובה יותר של התפלגות ה-EPS והתאים בתוך ביופילמים, ובמיוחד בתוך המטריצה החוץ-תאית7,8. בתיאוריה, צביעה/תיוג פלואורסצנטי של רכיבים מרובים רצוי לחקר המבנה המפורט והקו-לוקליזציה של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. עם זאת, ניתוח בו-זמני של רכיבים שונים בתוך ביופילמים יכול להיות מאתגר מכיוון ש: 1) בחירה של צבעים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מינימלית היא מסובכת, ו-2) כימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. קולוקליזציה באמצעות מספר פלואורוכרומים מחייבת שימוש בכתמים ספציפיים ביותר עם הפרעות ספקטרליות מינימליות כדי למנוע השפעות דימום, המתרחשות כאשר לשני פלואורוכרומים יש חפיפה משמעותית בשיא הספקטרלי שלהם, מה שגורם לאחד להתרגש חזק יותר מהשני9. באופן אידיאלי, פלואורוכרומים בעלי ספקטרום עירור שאינם חופפים יספקו את התוצאות הטובות ביותר, אולם קשה מאוד למצוא כתמים העומדים בקריטריון זה. במקום זאת, בחירת הכתמים מותאמת על ידי בחירת פלואורוכרומים שספקטרום הפליטה שלהם הוא בעל חפיפה מינימלית, מה שמאפשר לראות את הכתמים בזה אחר זה בתוך פס אורך גל תצפית מוגבל9.
סופר-אימפוזיציה של תמונות פלואורסצנטיות היא כנראה השיטה הנפוצה ביותר להערכת התפלגות בו-זמנית של פלואורוכרומים. קולוקליזציה של הרכיבים השונים מופיעה כחפיפה של צבעים שונים דרך ערוצים מרובים שנוצרו על ידי הפלואורוכרומים הנבדקים10. הכלים להצגת תמונות פלואורסצנטיות מרובות ערוצים כתמונות צבעוניות ממוזגות זמינים ברוב תוכנות CLSM ותוכנות ניתוח תמונות ביולוגיות. למרות שסופר-אימפוזיציה של תמונות שימושית להערכה מרחבית של קו-לוקליזציה, ניתן לבחון את התמונות באופן איכותי רק על ידי ניתוח חזותי. זה מספק כמות מוגבלת של מידע, מכיוון שייצוגים אלה בדרך כלל אינם מועילים לכימות קולוקליזציה בתנאי ניסוי שונים ואינם קובעים אם הקולוקליזציה חורגת מצירוף מקרים אקראי11. מעט מאוד מחקרים עד כה השתמשו בשיטות כמותיות כדי לנתח את המבנה התלת-ממדי של ביופילמים ורכיבי ביופילם, ומעטים עוד יותר כימתו את ההשפעה של טיפולים אנטיבקטריאליים או אמצעים נוגדי עכירות על רכיבי ביופילם.
מטרת מחקר זה הייתה לדווח על מתודולוגיה לכימות והשוואה של ההתפלגות התלת-ממדית בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים. השיטה מורכבת משלבים נפרדים אך קשורים זה בזה הכוללים צמיחת ביופילם, צביעה, הדמיית CLSM של ביופילמים, ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם וניתוח סטטיסטי של פרמטרים מבניים. בדיקת גידול הביופילם מאפשרת גידול ביופילם על מצעים רלוונטיים, ומייצרת מבני ביופילם הניתנים לשחזור. השילוב של צביעה סימולטנית חדשה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין עם מדידת פרמטרים מבניים של ביופילם תלת מימדי מביא להתפלגות ניתנת לכימות של רכיבים בתוך ביופילמים. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם מאפשר הערכה של ביופילמים בתנאי ניסוי ספציפיים (למשל לאחר טיפול במי פה), כפי שיתואר בסעיף הבא.

<table><tbody><tr><td>בקטו אגר</td><td>בקטון, דיקינסון ושות</td>' <td>214010</td><td></td></tr><tr><td>בקטו טוד יואיט מרק</td><td>בקטון, דיקינסון ושות</td>' <td>249240</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים, EMD מגורען</td><td>Millipore</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>בקטו טריפטון</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur סוכרוז</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, מגיב ACS, 99.0-100.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, מונובסיסי, &ge; 99.0%, מגיב ACS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט, מונובסיסי, מונוהידראט</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן, 99.8+%, מגיב ACS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Red</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 או S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot&egrave; ne שטיפת פה PBF</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ליסטרין Total Care</td><td>McNeil-PPC, Inc.</td><td>לא ישים</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) הוא כלי רב עוצמה לחקר ביופילמים. מעט מאוד מחקרים כימתו בהצלחה התפלגות בו-זמנית של יותר משני רכיבים בתוך ביופילמים כי: 1) בחירה של צבעים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מינימלית היא מסובכת, ו-2) כימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. מטרות: דווח על מתודולוגיה לכימות והשוואה של התפלגויות תלת מימדיות במקביל של שלושה רכיבים תאיים/חוץ-תאיים של ביופילמים הגדלים על מצעים רלוונטיים. שיטות: השיטה מורכבת משלבים נפרדים ומחוברים זה לזה הכוללים צמיחת ביופילם, צביעה, הדמיית CLSM, ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם וניתוח סטטיסטי של פרמטרים מבניים. ביופילמים של Streptococcus mutans (זן UA159) גודלו במשך 48 שעות על דגימות סטריליות של חומרים מרוכבים של שרף Point 4 ו-TPH3. הדגימות הוטבלו לאחר מכן למשך 60 שניות במי פה של Biotène PBF (BIO) או Listerine Total Care (LTO), או במים (קבוצת ביקורת; n=5/קבוצה). ביופילמים נצבעו בפלואורוכרומים עבור חומרים פולימריים חוץ-תאיים, חלבונים וחומצות גרעין לפני הדמיה עם CLSM. הפרמטרים המבניים של ביופילם שחושבו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ISA3D היו נפח ביולוגי ועובי ממוצע של ביופילם. מודלים מעורבים ניתוחים סטטיסטיים השוו פרמטרים מבניים בין מי פה לקבוצת ביקורת (תוכנת SAS; α=0.05). תוכנת Volocity אפשרה הדמיה של הפצות תלת מימד של רכיבי ביופילם (פלואורוכרומים). תוצאות: שטיפת פה BIO ייצרה מבני ביופילם השונים באופן משמעותי מהביקורת (p<0.05) על שני מרכיבי השרף, בעוד ש-LTO לא ייצר הבדלים (p>0.05) באף אחד מהמוצרים. מסקנות: מתודולוגיה זו כימתה והשוותה ביעילות ובהצלחה התפלגויות תלת-ממדיות בו-זמניות של שלושה רכיבים עיקריים בתוך ביופילמים של S. mutans על מצעים רלוונטיים, ובכך התגברה על שני אתגרים להערכה בו-זמנית של רכיבי ביופילם. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לקבוע את יעילותם של חומרים אנטיבקטריאליים/נוגדי עכירות כנגד רכיבי ביופילם מרובים, כפי שמוצג באמצעות מי פה. יתר על כן, לשיטה זו יש יישום רחב מכיוון שהיא מאפשרת השוואה של מבנים תלת מימדיים/ארכיטקטורה של ביופילמים במגוון דיסציפלינות.

תוצאות מייצגות עבור הטיפולים (מי פה) וקבוצת הביקורת שלא טופלה מוצגות בטבלה 2, ובאיורים 1 ו 2. טבלה 2 מציגה את ערכי הממוצע וסטיית התקן של פרמטרי המבנה של הביופילם: נפח ביולוגי (μm3) ועובי ממוצע של הביופילם (μm), אשר חושבו באמצעות תוכנת ISA3D. פרמטרים מבניים של ביופילמים שטופלו במי פה שהבדילו באופן מובהק מאלו של ביופילמים בקבוצת הביקורת (p&lt;0.05) מסומנים בערכי ממוצע וסטיית תקן המודגשים באדום. תוצאות הניתוחים הסטטיסטיים של המודלים המעורבים הדגימו כי מי פה מסוג BIO יצרו מבני ביופילם שהבדילו באופן מובהק מהביקורת (p&lt;0.05) בשני סוגי השרף הקומפוזיטי, בעוד שמי פה מסוג LTO לא יצרו הבדלים מובהקים (p&gt;0.05) באף אחד משני סוגי השרף הקומפוזיטי. התוצאות מראות בבירור כי רכיבי הביופילם התאיים והחוץ-תאיים שנותרו לאחר שני טיפולי מי הפה היו שונים. כמו כן, יש לציין כי ביופילמים של S. mutans שגדלו על שתי התשתיות (PF ו-TP) הבדילו במבנה התלת-ממדי שלהם, למרות שגדלו בתנאים דומים ושתי התשתיות פולשו באמצעות חומרי שיוף דומים.
ניתן להדמיות את ההפצה הסימולטנית של EPS, חלבונים וחומצות גרעיניות בתוך ביופילמים באמצעות שחזורי תלת-ממד (3D) שנוצרו באמצעות תוכנת Volocity. איורים 1 ו- 2 מציגים שחזורים מייצגים של ביופילמים מקבוצת ביקורת שגדלו על קומפוזיטים של שרף PF ו-TP, בהתאמה. הצבע הכחול מייצג EPS בתוך ביופילמים של S. mutans, הצבע הירוק מדגים חומצות גרעיניות, והצבע האדום מראה חלבונים. החלל שביניהם עשוי להיות תפוס על ידי מים או רכיבי ביופילם אחרים שאינם מסומנים באופן פלואורסצנטי.
<img alt="תרשים פיזור תלת-ממדי, ויזואליזציה דינמית של נתונים, גרף, כלי מחקר אינטראקטיבי, תצוגת אנליזה." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 1"> 
איור 1. שחזור תלת-ממדי מייצג של ביופילם של S. mutans שגדל על קומפוזיט שרף PF בקבוצת הביקורת (שלא טופלה במי פה). חפיפה סימולטנית של שלושת הצביעים בתוך ביופילם בודד מאפשרת ויזואליזציה בו-זמנית של רכיבי EPS (צבע כחול), חומצה גרעינית (צבע ירוק) וחלבון (צבע אדום) בתוך ביופילם של S. mutans. (1 Unit = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת האיור בגודל מלא</a>.
<img alt="ויזואליזציה של מבנה תאי תלת-ממדי, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתוח נתונים מרחביים, גרף מדעי." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 2"> 
איור 2. שחזור תלת-ממדי מייצג של ביופילם של S. mutans שגדל על קומפוזיט שרף TP בקבוצת הבקרה (שלא טופלה במי פה). חפיפה סימולטנית של שלושת הצבעים בתוך ביופילם בודד מאפשרת ויזואליזציה בו-זמנית של רכיבי EPS (צבע כחול), חומצות גרעין (צבע ירוק) וחלבונים (צבע אדום) בתוך ביופילמים של S. mutans. (1 Unit = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank"> לחצו כאן להצגת איור מוגדל</a>.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ש composite שרף</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">נקודה 4</td>
			<td colspan="2">TPH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מי פה</td>
			<td>מרכיב</td>
			<td>BV (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
			<td>BV (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotène PBF</td>
			<td>חומצות גרעיניות</td>
			<td>279,517±53,291</td>
			<td>9.32±2.80</td>
			<td>195,033±42,014</td>
			<td>7.45±3.70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>344,902±56,386</td>
			<td>35.22±17.19</td>
			<td>197,840±62,351</td>
			<td>9.83±7.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>חלבונים</td>
			<td>298,796±62,868</td>
			<td>54.21±21.65</td>
			<td>216,033±66,654</td>
			<td>24.33±39.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listerine Total Care</td>
			<td>חומצות גרעיניות</td>
			<td>355,707±110,444</td>
			<td>26.45±14.21</td>
			<td>273,296±47,323</td>
			<td>13.43±2.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>494,099±180,592</td>
			<td>64.90± 26.68</td>
			<td>329,150±47,145</td>
			<td>34.35±30.32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>חלבונים</td>
			<td>348,416±161,316</td>
			<td>58.68±47.28</td>
			<td>303,150±54,705</td>
			<td>34.18±41.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ביקורת (לא מטופל)</td>
			<td>חומצות גרעיניות</td>
			<td>388,375±42,152</td>
			<td>51.15±40.66</td>
			<td>327,809±39,400</td>
			<td>17.08±1.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>660,448±173,197</td>
			<td>91.37±74.84</td>
			<td>363,850±67,612</td>
			<td>28.33± 15.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>חלבונים</td>
			<td>517,274±119,475</td>
			<td>127.96±73.84</td>
			<td>353,161±56,518</td>
			<td>21.17±4.41</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2. ערכי ממוצע וסטיית תקן של נפח ביולוגי (BV) ועובי ממוצע של הביופלם (MT) בביופלמים שטופלו ב-BIO או LTO, או שהושארו ללא טיפול (קבוצת ביקורת). פרמטרים מבניים של ביופלמים שטופלו בתמיסות לחיטוי הפה והיו שונים באופן מובהק מאלה של ביופלמים בקבוצת הביקורת (p&lt;0.05) מסומנים בערכי ממוצע וסטיית תקן המודגשים באדום.

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת ולהשוות התפלגויות תלת מימדיות במקביל של שלושה רכיבי ביופילם תאיים וחוץ-תאיים לאחר טיפול בחומרים אנטיבקטריאליים. זה מושג על ידי ייצור תחילה ולאחר מכן ליטוש דגימות מרוכבות שרף. בשלב השני, הביופילמים המעניינים גדלים על הדגימות ולאחר מכן מטופלים בחומרים אנטיבקטריאליים.לאחר מכן, הביופילמים מוכתמים בפלואורוכרומים עבור חומרים פולימריים חוץ-תאיים, חומצות גרעין וחלבונים, ולאחר מכן מצולמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. בשלב האחרון, תמונות תלת מימדיות של הפלואורוכרומים המונחים משוחזרות כדי להקל על הדמיה בו-זמנית של רכיבי הביופילם ופרמטרים מבניים מחושבים מתמונות הביופילם. בסופו של דבר, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם כגון נפח ביולוגי ועובי ממוצע של ביופילם כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת הטיפול לקבוצת הביקורת.היתרון העיקרי של הליך זה על פני השיטות הקיימות הוא שהוא משתמש בטכניקות נפרדות אך קשורות זו לזו כדי לאפיין את ההתפלגות של רכיבים מרובים במבנה של ביופילמים הגדלים בתנאים ספציפיים, מה שמדגים את ההליך יהיה ד"ר פרננדו פלורס, עמית מחקר פוסט-דוקטורט, וגב' קריסטן סמארט, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי כדי ליצור את הדגימות התחל בהצבת תוספת אחת של 0.4 או TPH שלושה שרף שיניים מרוכב בהתאמה אישית הכין תבניות נירוסטה. לאחר מכן, פילמרו את התוספת הראשונה עם יחידת ריפוי אור LED למשך 40 שניות. לאחר חזרה על ההליך עבור התוספת השנייה, השתמש בליטוש מטחנה חצי אוטומטי כדי ללטש את הדגימות שנרפאו לגימור משטח סופי מקובל.לבסוף, עקרו את הדגימות כדי לגדל את הביופילם. ראשית, יש לחסן מושבה בודדת של S mutans בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית לילה, ולאחר מכן לדגור על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות כדי להשיג צפיפות אופטית של לפחות 0.9. לאחר מכן, יש לדלל את התרבית ביחס של 1 ל-100 ב-10 מיליליטר של גידול ביופילם.בינוני מעביר באופן אספטי את הדגימות המרוכבות של השרף הסטרילי ל-12 לוחות באר סטריליים, ולאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר מהתרבות המדוללת לכל אחת מהבארות. לקבוצות טיפול במי פה וביקורת, הוסיפו 2.5 מיליליטר של גידול ביופילם סטרילי לא מחוסן, בינוני לבארות בקרת הסטריליות, ולאחר מכן גדלו את הביופילמים ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים מיקרו-פאראפיליים על שייקר ב-100 סל"ד. לאחר 24 שעות, יש לשאוב באופן אספטי את המדיום מכל הבארות ולשטוף כל באר פעמיים עם 2.5 מיליליטר PBS סטרילי השואב את מי המלח לאחר כל שטיפה, ואז לחדש כל באר ב-2.5 מיליליטר של מצע גידול ביופילם טרי ולדגור את הצלחת למשך 24 שעות נוספות כפי שהודגם זה עתה לגידול ביופילם כולל משך של 48 שעות לאחר השלמת גידול הביופילם, שאפו את מצע הגידול ולאחר מכן חלקו 2.5 מיליליטר מי פה לכל קבוצת טיפול היטב ו-2.5 מיליליטר מים סטריליים אולטרה-טהורים לקבוצת הביקורת.ערבבו היטב את הצלחות על שייקר אורביטלי ב-150 סל"ד, ולאחר מכן לאחר 60 שניות, שאפו גם את מי הפה וגם את המים האולטרה-טהורים מהבארות כדי להכתים את רכיב הפוליסכריד האקסו של הביופילמים. דגרו כל ביופילם עם 50 מיקרוליטר של מצומד LOR למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. לאחר מכן שטפו את הדגימות פעמיים עם 2.5 מיליליטר של מאגר TC השואב לאחר כל שטיפה וצבעו את חומצות הגרעין בכל ביופילם עם טיפה של 50 מיקרוליטר של ציטו תשע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.לאחר שטיפת הדגימות פעמיים, יש לצבוע את רכיבי החלבון בכל ביופילם ב-50 מיקרוליטר של Cipro אדום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים, העבירו אותן לבארות בודדות של צלחת שש בארות המכילה שישה מיליליטר מים אולטרה-טהורים סטריליים לכל באר כדי להקל על ההדמיה שלהן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות של כל אחד מהכתמים המרכיבים בתוך הביופילמים של קבוצות הטיפול והביקורת. הגדר את הלייזרים של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי להגדרות הבאות לזיהוי פוליסכרידים אקסו על ידי כתם מצומד של Exor, השתמש בלייזר של 633 ננומטר ובפס פליטה של 659 עד 749 ננומטר לזיהוי חומצות גרעין על ידי כתם ציטו תשע.השתמש בלייזר של 488 ננומטר ובפס פליטה של 495 עד 500 ננומטר, ולגילוי חלבונים על ידי כתם אדום Cipro, השתמש בלייזר של 543 ננומטר ובפס פליטה של 615 עד 651 ננומטר. לאחר מכן שימוש בעדשת טבילה פי 63 עם צמצם מספרי של 0.9 ומרחק עבודה של 2.2 מילימטרים. אסוף תמונות מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית ב-400 הרץ באמצעות סריקה רציפה במצב בין ערימות כדי לייעל את לכידת התמונות של כתמים מרובים באותו ביופילם.לאחר ניתוח תמונות המיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית, השתמש באפשרות תפריט המעבד התלת-ממדי בתוכנת ניתוח תמונות מהירות כדי ליצור תמונה תלת מימדית משוחזרת של כתמי הרכיבים המונחים בתוך כל ביופילם. לאחר מכן, סובב את התמונה התלת-ממדית כדי לקבל תצוגה אופטימלית של הביופילם. לאחר מכן צלם תמונה של שחזור הביופילם וייצא את התמונה בפורמט קובץ תמונה מתאים.לבסוף, בצע ניתוח חזותי של ההתפלגות המקבילה של חומצת הגרעין האקסו פוליסכריד ורכיבי החלבון בתוך הביופילמים. בתמונות המשוחזרות, חשב פרמטרים מבניים של ביופילם כגון נפח ביופילם ועובי ממוצע של ביופילם באמצעות תוכנת ISA 3D בטבלה זו, מוצגים ערכי הממוצע וסטיית התקן של פרמטרים מבניים של ביופילם המחושבים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. ערכי הממוצע וסטיית התקן עבור הפרמטרים המבניים של הביופילמים שטופלו במי פה שהיו שונים באופן משמעותי מאלה של הביופילמים בקבוצת הביקורת מודגשים במודלים מעורבים אדומים.ניתוחים סטטיסטיים הראו כי מי הפה של Biotene PBF ייצרו מבני ביופילם השונים באופן משמעותי מקבוצת הביקורת בשני מרכיבי השרף, בעוד שמי הפה לטיפול מלא של ליסטרין לא יצרו הבדלים משמעותיים באף אחד ממרוכבי השרף, מה שמצביע בבירור על הבדלים במרכיבי הביופילם התאיים והחוץ-תאיים שנותרו לאחר שני טיפולי מי הפה. ניתן לדמיין את ההתפלגות המקבילה של אקסו, פוליסכרידים, חומצות גרעין וחלבונים בתוך הביופילמים באמצעות שחזורים תלת מימדיים שנוצרו באמצעות תוכנת מהירות. באיור זה, שחזור מייצג של ביופילמים של קבוצת ביקורת שגדלו על 0.4 מוצג שהצבע הכחול הוקצה לפוליסכריד אקסו.בתוך ביופילמים של S mutans, הצבע הירוק הוקצה לחומצות גרעין והצבע האדום לחלבונים. החלל המתווך עשוי להיות תפוס על ידי מים או רכיבי ביופילם אחרים שלא סומנו באופן פלואורסצנטי. באיור זה מוצג שחזור מייצג של ביופילמים של קבוצת ביקורת שגדלו על שלושה מרוכבי שרף TPH עם הצבעים המייצגים את אותם רכיבים כמו האיור הקודם.הליך זה הביא ליישום במגוון דיסציפלינות כגון הרפואה, רפואת השיניים, הגיאולוגית ומדעי הים. מכיוון שניתן להחליף מצעים וביופילמים רבים באלה המשמשים כאן.

concurrent-quantification-cellular-extracellular-components

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כימות בו זמנית של רכיבים תאיים ותאיים חוץ תאיים של ביופילמים

מאמר זה מתאר את הליך הקמת ויזואליזציה של biofilm חיידקי גדל בתוך שקופית 8-גם...

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin...

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Cytometry זרימה בשילוב עם קיבוץ באשכולות חזותית מציע שיטה קלה לשימוש ומהיר עבור הלומדים biofilms הימית. זה יכול לשמש biofilm אפיון, זיהוי שינויים במבנה הקהילה biofilm, וזיהוי של חלקיקים והאביוטיים שמוטבע על biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם Pseudomonas aeruginosa שונים בין מבודדים קליניים שגודלו בתרבית מחולים עם סיסטיק פיברוזיס וזיהום ריאתי כרוני. לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להשתמש בתוכנת COMSTAT כדי לכמת וריאציות בארכיטקטורת ביופילם (למשל, שטח פנים, עובי, ביומסה) עבור מבודדים בודדים כדי להעריך את היעילות של חומרים אנטי זיהומיים.

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מודולרי מסוג BSL-2 המשלב בדיקות ביומסה קריסטל-סגולה, קינטיקת פאזה-ניגודיות טיים-לאפס, מיפוי קונפוקלי תלת-ממדי/מטריצות, מבנה SEM אולטרה-סטרוקטיבי, ומודול זיהום אוגר ב-vivo לטיפוח, כמות, אפיון וחקר תפקיד פונקציונלי של ביופילם לפטוספירה , ומאפשר הערכה סטנדרטית של מוטנטים והתערבויות אנטי-ביופילם במעבדות.

תהליך עבודה מודולרי לניתוח כמותי, מבני ופונקציונלי של ביופילמים של לפטוספירה

חקור כימות תלת-ממדי של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בביופילמים לאחר טיפול בחומרים אנטיבקטריאליים באמצעות מיקרוסקופיית לייזר סורקת קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת ניתוח סטטיסטי מקיף של מבנה הביופילם ותגובתו לטיפולים.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

גלה סרטונים נוספים