גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות חומרים חדשים מבוססי ג'ל סול (sol gel) לייצור מערכי מיקרו (microarrays) ולהשתמש בהם עבור בדיקות אנזימטיות בנפחים ננומטריים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי זיהוי חומרים בעלי זמני סול-ג'ל (sol-gel transition) מספיק ארוכים כדי למנוע ג'לוס בסיכת ההדפסה של מערך המיקרו במהלך תהליך ההדפסה. השלב השני הוא להעריך חומרים בעלי זמני מעבר ארוכים מבחינת יכולת ההדפסה שלהם כמערכי מיקרו, השחזוריות, העמידות לסדקים, איכות ההיצמדות, הפרדה לא רצויה של פאזות, ובסופו של דבר, פעילות גבוהה של האנזימים הכלואים.

בשלב הבא, האנזים הנחקר מודפס כמערך מיקרו (microarray) באמצעות החומרים האופטימליים, ונבדקת יכולתו לספוג את תמיסת הבדיקה וליצור תגובה אנזימטית מדידה. השלב הסופי הוא להעריך את החומרים ביכולתם לספק בדיקות בעלות הדירות גבוהה תוך שימוש באנזים הנחקר ולהפיק נתונים כמותיים. לאחר מכן נבחר החומר הסופי לייצור המערך.

בסופו של דבר, מערכי מיקרו-חלבונים המופקים מ-soul gel משמשים לזיהוי של מולקולות קטנות המפחיתות את פעילות האנזים. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון סריקה מבוססת פלטות, הוא היכולת לסרוק מספר רב של חומרים באופן שיטתי ומהיר מאוד תוך שימוש בנפחים נמוכים של ריאגנטים. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בטכניקה זו יתקלו בקשיים, שכן ייתכן שחומרים יהפכו לג'ל בתוך פיני ההדפסה.

אם אלו לא ינוקו כראוי, הדבר יוביל לכתמים שהופספסו, שעלולים להתפרש כחומרים שאינם ניתנים להדפסה. כדי להתחיל, הכינו את תמיסות התוספים הרבות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. ניתן להכין מראש רבות מהתמיסות ולאחסנן למשך חודש אחד או יותר בתנאים המתאימים, אך חלקן חייבות להיות מוכנות ביום הניסוי.

ערבבו את המסמיכים המבוססים על נתרן סיליקט מיד לפני השימוש, והקפידו לשמור אותם על קרח. יש להשתמש ב-SOS בתוך שעה מהוספת המים, שכן זמני המתנה ממושכים יותר יובילו לזמני DATION קצרים ולא עקביים. לאחר מכן, הכינו שילובים שונים של בופרים, פולימרים של תמיסות ו-organs lanes כפי שמונחה בפרוטוקול הטקסט המצורף, כדי לזהות אילו שילובים יכולים לשמש כחומר להדפסה עם זמני התפשטות העולים על 2.5 שעות.

לאחר שזוהו מספר שילובים, הגדירו את הלחות בתוך תא ההדפסה ל-80% עד 90%; לחות של פחות מ-80% עלולה להוביל להתאיידות של הדגימות ולאי-עקביות בהדפסה עקב נפחי ההשקעה הקטנים של המדפסת. כעת, כאשר המערכת מוכנה, הגדירו את תבניות המערך להדפסה באמצעות תוכנת ה-Chip Writer Pro. הגדירו את מהירות התנועה בכיוון XY ל-10 millimeters per second ואת מהירות הגישה לדגימה בכיוון Z ל-2 millimeters per second, עם זמן טעינת דגימה של 2.5 second, תוך שימוש בשילובים של saw gel שזוהו קודם לכן.

הכינו 25 µL של חומרי הבסיס על ידי שילוב הפולימרים, האורגנו-לנזים ותוספי המולקולות הקטנות המתאימים שזוהו בתהליך הסינון המקדים. השתמשו ב-50 mM HEPES ב-pH של 8.0 בבארות בודדות של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לארבעה פינים בעלי חריצים בקוטר של 100 micron במים מזוקקים פעמיים.

לאחר 15 דקות, ייבשו אותם תחת זרם חנקן. לאחר מכן, השתמשו במנקה מקטרות כדי להסיר לחות שאריתית מתוך מחזיק הפינים והניחו בזהירות את הפין בראש ההדפסה של רובוט הדפסת פיני המגע. אי-הסרה של לחות שאריתית עלולה למנוע מהפין לנוע בחופשיות עם המחזיק, דבר שיוביל להשמטת נקודות הדפסה.

לאחר מכן, הוסיפו 25 µL של ה-SA המתאים לבאר רגע לפני ההדפסה. ערבבו את התמיסה באמצעות תנועת פיפטציה מעלה ומטה, כאשר בערבוב באמצעות פיפטה יש לחזור על הפעולה 50 פעמים. מזערו את כמות האוויר הנכנסת לתמיסה.

בועות אוויר מונעות טעינה מלאה של הדגימה בתוך הפין. לאחר מכן, טענו את הפין על ידי השמדתו אל תוך הדגימה. ברגע שהפינים טעונים, התחילו בתהליך ההדפסה והדפיסו את הדגימה על פני השטח של שקף אחד.

עצרו את תהליך ההדפסה לפני הוספת מלח לפלטת המקור הבאה. כאשר התהליך מושהה, הסירו את פין ההדפסה באמצעות מגנט והניחו מנקה מקריאות בראש ההדפסה כדי למנוע הצטברות לחות בראש ההדפסה. לאחר מכן, שטפו את פין ההדפסה במים מזוקקים פעמיים ובצעו לו סוניקציה במים מזוקקים פעמיים נקיים למשך 30 שניות.

בשלב הבא, ייבשו את פין ההדפסה תחת זרם חנקן ולאחר מכן החזירו את הפין לראש ההדפסה. המשיכו בערבוב, בהדפסה ובניקוי עבור כל הדגימות שנותרו בלוח המקור; עד ל-12,000 נקודות בקוטר של 100 microns ניתנות להשקעה על גבי שקופית אחת. עם סיום ההדפסה, יישנו את המערך למשך 30 דקות לפחות ועד 24 שעות בתוך תא ההדפסה בלחות של 80% עד 90%.

הכינו 50 µL של הבקרה החיובית רגע לפני השימוש על ידי ערבוב של 25 µL של acetylcholine iodide בריכוז 1 mM, ו-0.14 µL של bodi pi, FIL cysteine בריכוז 5 mM, ו-tris בריכוז 25 mM ב-pH 7.0 עם 4% glycerol בתוך באר של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות; שאיפו והתירו את התמיסה באיטות באמצעות פיפטה כדי לערבב ללא יצירת בועות. לאחר מכן, הכינו את הבקרות השליליות רגע לפני השימוש על ידי ערבוב של 0.14 µL של boai PI FIL cysteine בריכוז 5 mM עם 49.86 µL של tris בריכוז 25 mM ב-pH 7.0 עם 4% glycerol בתוך באר אחרת של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות, וערבבו בעדינות. הדפיסו את הבקרות על גבי המיקרו-מערכים המיושנים תוך שימוש באותם תהליכים שתוארו בסעיף הקודם. עם זאת, במקום בפינים בעלי קוטר של 100 µm, השתמשו בפיני chief בעלי קוטר של 235 µm.

פעולה זו מבטיחה שהתמיסות יכסו לחלוטין את הנקודות שהורספו קודם לכן. יש להשקיע את הנקודות במערכים בלחות של 80% עד 90% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, וזאת בשל הידרוליזה עצמית של acetylcholine. זמני דגירה ממושכים יותר עלולים להוביל לתוצאות חיוביות שגויות עקב פעילות אנזימטית מוגברת.

ודאו שסורק המערכים alpha innotech novo array imager דלוק ומצויד במסנן עירור של 478 ± 17 nanometer ובמסנן פליטה של 538 ± 21 nanometer למדידת מערכי המיקרו-מערכים של acetylcholine esterase. לאחר מכן, הניחו את השקופית במחזיק השקופיות כאשר הנקודות פונות כלפי מעלה. הגדירו את מספר מקטעי התצוגה המקדימה כך שלפחות מקטע אחד מכל צד של שקופית המיקרוסקופ יוצג בתצוגה מקדימה ברזולוציה מינימלית של 4 micrometers תוך שימוש בחשיפה אוטומטית.

לאחר שהפרמטרים נמצאו מקובלים, רכשו תמונת סלייד ושמרו אותה כקובץ TIFF. לאחר מכן, פתחו את תמונת הסלייד שנרכשה ב-Image J 64. לחצו על כלי הבחירה האובלי (Oval Selection Tool) ובחרו כל נקודה.

בחר אזור הגדול מעט מהנקודה שנצפתה, והקפד להשתמש בגודל עקבי בין הנקודות כדי להפחית את הסובייקטיביות של Image J. לאחר מכן, מדוד את עוצמת האות של כל נקודה באמצעות אפשיית המדידה (measure) תחת לשונית הניתוח (analyze). חשב ממוצע של העוצמה מ-25 נקודות דומות של ביקורת חיובית וחלק אותו בעוצמה הממוצעת של 25 נקודות דומות של ביקורת שלילית, כדי לקבל את היחס בין הביקורת החיובית לביקורת השלילית עבור הרכבי החומרים הבודדים.

מוצגת כאן דוגמה לטווח הדינמי של המיקרומערכים שהוכנו בשיטות אלו. הביקורות הגבוהות הניבו אזורים ירוקים בהירים, בעוד שהביקורות הנמוכות הניבו נקודות עמומות הרבה יותר. העוצמה כפי שנמדדה באמצעות Image J 64 מראה כי בביקורות הגבוהות הממוצע הוא כ-22,000 יחידות פלואורסצנציה יחסיות, ובביקורות הנמוכות הממוצע היה קרוב ל-8,000.

הקווים המקווקוים מייצגים שלוש סטיות תקן מהממוצע. להלן דוגמאות למערכי מיקרו-מערכים (microarrays) עבור סריקת מערך כבוד של אנלוגים סינתטיים של alkaloids מ-ameral sier שזוהו כתרכובת אחת ותרכובת שתיים. שני הצירים מייצגים את אחוז האנזים כפי שנקבע על ידי האות הפלואורסצנטית.

בכפולות, קרבת הנקודות לאלכסון מייצגת הדירות גבוהה של הבדיקה. מוצגים כאן גרפי IC 50 של שני מעכבים פוטנציאליים שונים. תרכובת אחת הניבה רמת IC 50 של 16 micromolar, בעוד שה-IC 50 של תרכובת שתיים היה 21 micromolar. נקודות מייצגות מוצגות לעיל כדי להמחיש הבדלים באות הפרופורציונלי לריכוזי המעכבים.

המערך המוצג כאן הודפס עם ארבעה קינזות שונות, P 38 map kinase, EGFR ו-GSK, ועליו הודפסו בתוספת באפר בלבד, באפר המכיל ATP ובאפר המכיל ATP ו-staurosporin, מעכב של פעילות אנזימטית. התוצאות מראות השפעה משמעותית של מעכב הקינזה staurosporin, בהתבסס על עצימויות הפלואורסצנציה שהתקבלו כפי שמתואר כאן. ההבדל הגדול ביותר שנראה בריכוז ה-staurosporin שנעשה בו שימוש כאן היה בנקודות ה-P 38.

כאן מוצגים נקודות מייצגות של מערך מיקרו-מערך (microarray) מסוג BP P 30 8:00 AM, אשר עליהן הונחו ריכוזים שונים של stor sporin. כפי שצוין, ה-IC 50 של מולקולה זו נקבע כ-one micromolar והוא מוצג בגרף מימין. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי על פי פרוטוקול זה.

ניתן לבצע גם שיטות אחרות, כגון בדיקות אימונו-אסיי (immunoassays) או בדיקות אינטראקציה של חלבונים, כדי להשיב על שאלות נוספות הקשורות לאבחון או לגילוי מולקולות קטנות.