גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חומרים חדשים מבוססי ג'ל נשמה לייצור מיקרו-מערך ולהשתמש בהם לבדיקות אנזימים בנפח ננו. זה מושג על ידי זיהוי ראשוני של חומרים שיש להם זמני זמן ארוכים מספיק כדי למנוע ג'ל בסיכת ההדפסה של המיקרו-מערך במהלך תהליך ההדפסה. השלב השני הוא להעריך חומרים עם זמני זמן ארוכים ליכולתם להדפיס כמיקרו-מערכים, עמידות לשחזור בפני סדקים, איכות הידבקות סדקים, הפרדת פאזה לא רצויה, ובסופו של דבר פעילות גבוהה עבור אנזימים כלואים.

לאחר מכן, האנזים המעניין מודפס כמיקרו-מערך תוך שימוש בחומרים האופטימליים ונבדקת יכולתו לזהות יתר על המידה את תמיסת הבדיקה וליצור תגובה אנזימטית מדידה. השלב האחרון הוא להעריך את החומרים על יכולתם לספק בדיקות הניתנות לשחזור באמצעות האנזים המעניין ולהפיק נתונים כמותיים. לאחר מכן נבחר החומר הסופי לייצור מערך.

בסופו של דבר, מיקרו-מערכי חלבונים שמקורם בג'ל נשמה משמשים לזיהוי מולקולות קטנות המפחיתות את פעילות האנזים. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות קיימות כמו סינון מבוסס צלחות, הוא שניתן לסנן מספר רב של חומרים בצורה שיטתית במהירות רבה תוך שימוש בכמויות נמוכות של ריאגנטים. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שאפשר שיהיו חומרים ג'ל בתוך סיכות ההדפסה.

אם מנקים אותם כראוי, זה יגרום להחמצת כתמים שיכולים להתפרש כחומרים שאינם ניתנים להדפסה. כדי להתחיל, הכינו את פתרונות התוספים הרבים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. רבים מהתמיסות ניתנות להכנה מראש ולאחסון עד חודש או יותר בתנאים הנכונים, אך יש להכין את חלקן ביום הניסוי.

מערבבים את המסורים על בסיס נתרן סיליקט מיד לפני השימוש, והקפידו לשמור אותם על קרח. יש להשתמש ב-SOS תוך שעה מהוספת המים מכיוון שתקופות המתנה ארוכות יותר גורמות לזמני DATION קצרים ולא עקביים. לאחר מכן, הכינו שילובים שונים של חוצצים, פולימרים סלנים ונתיבי איברים לפי ההוראות בפרוטוקול הטקסט הנלווה על מנת לזהות אילו שילובים יכולים לשמש כחומר להדפסה עם זמני התרחבות של יותר מ-2.5 שעות.

לאחר שזוהו מספר שילובים, הגדר את הלחות בתוך תא ההדפסה ל-80 עד 90% לחות של פחות מ-80% עלולה לגרום לאידוי הדגימה ולחוסר עקביות בהדפסה עקב נפחי התצהיר הקטנים עם המדפסת. כעת, מוכנים, סדרו את דפוסי המערך להדפסה באמצעות תוכנית Chip Writer Pro. הגדר את הנסיעה בכיוון XY ל-10 מילימטרים לשנייה ואת מהירות הגישה של הדגימה בכיוון Z לשני מילימטרים לשנייה עם זמן טעינת הדגימה של 2.5 שניות באמצעות שילובי ג'ל המסור שזוהו קודם לכן.

הכן 25 מיקרוליטר מחומרי הבסיס על ידי שילוב של פולימרים מתאימים, נתיבי אורגנו ותוספי מולקולות קטנות שזוהו בתהליך הסינון המקדים. שימוש בערימות של 50 מילי-מולרית עם pH של 8.0 לבארות בודדות של צלחת מיקרוטיטר של 384 בארות. לאחר מכן סוניקציה של עד ארבעה פיני נדן מחורצים בקוטר 100 מיקרון במים מזוקקים כפולים.

לאחר 15 דקות, נסה אותם תחת זרם חנקן. לאחר מכן, השתמש במנקה צינורות כדי להסיר שאריות לחות מתוך מחזיק הסיכה והנח בזהירות את הסיכה בראש ההדפסה של רובוט הדפסת סיכות המגע. אי הסרת לחות שיורית עלולה להפריע לסיכה לנוע בחופשיות עם המחזיק, וכתוצאה מכך להחמיץ כתמים.

לאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של ה-SA המתאים לבאר ממש לפני ההדפסה. מערבבים את התמיסה בתנועת פיפטינג למעלה ולמטה חוזרים על עצמם 50 פעמים בעת ערבוב על ידי פיפטה. צמצם את כמות האוויר המשולבת בתמיסה.

בועות אוויר מונעות טעינה מלאה של הדגימה בתוך הסיכה. לאחר מכן, טען את הסיכה על ידי הורדתה לדגימה. לאחר טעינת הסיכות, התחל בתהליך ההדפסה והדפס את הדגימה על משטח שקופית אחד.

השהה את תהליך ההדפסה לפני הוספת מלח ללוחית המקור שלאחר מכן. ובכן, עם השהיית התהליך, הסר את סיכת ההדפסה באמצעות מגנט והנח מנקה צינורות בראש ההדפסה כדי למנוע הצטברות לחות בראש ההדפסה. לאחר מכן שטפו את סיכת ההדפסה במים מזוקקים כפולים והפכו אותה לסוניקציה במים מזוקקים כפולים נקיים למשך 30 שניות.

לאחר מכן, יבש את סיכת ההדפסה מתחת לזרם חנקן ולאחר מכן הנח את הסיכה בחזרה לראש ההדפסה. המשך לערבב, להדפיס ולנקות עבור כל הדגימות שנותרו בתוך לוחית המקור ניתן להפקיד עד 12,000 נקודות, בקוטר 100 מיקרון על שקופית אחת. לאחר סיום ההדפסה, יישן את המערך למשך 30 דקות לפחות ועד 24 שעות בתוך תא ההדפסה ב-80 עד 90% לחות.

הכן 50 מיקרוליטר של הבקרה החיובית ממש לפני השימוש על ידי שילוב של 25 מיקרוליטר של מילימול אחד, אצטילכולין יודיד ו-0.14 מיקרוליטר של חמישה מילי-מולרי בודי פי, FIL ציסטאין ו-25 מילי-מולרי טריס ב-pH 7.0 עם 4% גליצרול בבאר של צלחת מיקרוטיטר 384 באר פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה לאט כדי לערבב מבלי ליצור בועות. לאחר מכן, הכינו את הבקרות השליליות ממש לפני השימוש על ידי שילוב של 0.14 מיקרוליטר של חמישה מילי-מולארי boai PI FIL ציסטאין ל-49.86 מיקרוליטר של 25 מילי-מולרי טריס ב-pH 7.0 עם 4% גליצרול לבאר נוספת של צלחת מיקרו טיטר של 384 בארות וערבבו אותם בעדינות מעל הדפסת הפקדים על המיקרו-מערכים המיושנים תוך שימוש באותם תהליכים שתוארו בסעיף הקודם. עם זאת, במקום הפינים בקוטר 100 מיקרון, חירצת סיכות ראשיות בקוטר 235 מיקרון.

זה מבטיח שהפתרונות מכסים לחלוטין את הכתמים שהופקדו בעבר. כתמים מזדקנים את המערכים בלחות של 80 עד 90% למשך שעה בטמפרטורת החדר עקב הידרוליזה אוטומטית של אצטילכולין. זמני דגירה ארוכים יותר עלולים לגרום לתוצאות חיוביות כוזבות עקב פעילות אנזימים מוגברת.

ודא שמצלמת מערך ה-alpha innotech novo מופעלת ומצוידת בעירור של 478 פלוס מינוס 17 ננומטר ומסנן פליטה של 538 פלוס מינוס 21 ננומטר למדידת מערכי המיקרו-מערכי אצטילכולין אסטראז. לאחר מכן הנח את השקופית לתוך מחזיק השקופיות כשהכתמים פונים כלפי מעלה. הגדר את מספר קטעי התצוגה המקדימה כך שלפחות אחד משני צידי שקופית המיקרוסקופ יוצג בתצוגה מקדימה ברזולוציה מינימלית של ארבעה מיקרומטר באמצעות חשיפה אוטומטית.

לאחר שהפרמטרים נמצאו מקובלים, רכוש תמונת שקופית ושמור אותה כקובץ TIFF. לאחר מכן, פתח את תמונת השקופית שנרכשה בתמונה J 64. לחצו על הכלי Oval Selection ובחרו בכל נקודה.

בחר אזור מעט גדול יותר מהנקודה שנצפתה, והקפד להשתמש בגודל עקבי בין כתמים כדי להפחית את הסובייקטיביות של התמונה J.לאחר מכן מדוד את עוצמת האות של כל נקודה באמצעות אפשרות המדידה. תחת לשונית הניתוח. ממוצע את העוצמה מ-25 נקודות בקרה חיוביות דומות וחלקו בעוצמה הממוצעת של 25 נקודות בקרה שליליות דומות כדי להשיג יחסי בקרה חיוביים לשליליים עבור הרכבי החומר הבודדים.

מוצגת כאן דוגמה לטווח הדינמי של המיקרו-מערכים המתקבלים שהוכנו בשיטות אלה. הבקרות הגבוהות הביאו לאזורים ירוקים בהירים, בעוד שהבקרות הנמוכות הביאו לכתמים עמומים בהרבה. העוצמה כפי שנמדדה על ידי תמונה J 64 מראה את הפקדים הגבוהים בממוצע כ-22,000 יחידות פלואורסצנטיות יחסיות, והבקרות הנמוכות היו בממוצע קרוב ל-8,000.

הקווים המקווקוים מייצגים שלוש סטיות תקן מהממוצע. להלן מיקרו-מערכים לדוגמה לבדיקת מערך כבוד של אנלוגים סינתטיים של אלקלואידים אמרליים המזוהים כתרכובת אחת ותרכובת שתיים. שני הצירים מייצגים את אחוז האנזים כפי שנקבע על ידי האות הפלואורסצנטי.

בשכפול הקרבה של הנקודות לאלכסון מייצגת שחזור בדיקה גבוהה. עלילות IC 50 של שני מעכבים פוטנציאליים שונים מוצגות כאן. תרכובת אחת הביאה לרמת IC 50 של 16 מיקרומולר, בעוד שה-IC 50 של תרכובת שתיים היה 21 מיקרו-מולרי נקודות מייצגות מוצגות למעלה כדי להמחיש את ההבדלים באות ביחס לריכוזי המעכבים.

המערך המוצג כאן הודפס עם ארבעה קינאזות שונות, P 38 map kinase, EGFR ו-GSK, והודפס עם מאגר בלבד המכיל A TP ומאגר המכיל A TP ו-starro sporin מעכב פעילות אנזימים. התוצאות מראות השפעה משמעותית של מעכב הקינאז starro sporin בהתבסס על עוצמות הקרינה המתקבלות כמתואר כאן. ההבדל הגדול ביותר שנראה בריכוז ספורין הסטור ששימש כאן היה מכתמי P 38.

כאן, מוצגים כתמים מייצגים של מיקרו-מערך P 30 8:00 AM BP, שזוהו יתר על המידה עם ריכוזים משתנים של ספורין סטור. כפי שצוין, ה-IC 50 של מולקולה זו נקבע כמיקרו-טוחנת אחת ומוצג בגרף מימין לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות אימונולוגיות או מבחני אינטראקציה עם חלבונים כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לאבחון או גילוי מולקולות קטנות.