Name: גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: למד גישת סינון חומרים מודרכת לפיתוח מיקרואריי חלבון מסול-ג'ל באמצעות שיטת הדפסת פין. שיטה זו מאפשרת סינון מערכי אנזימים כמו אצטילכולינאסטרז ומולטי-קינאז לזיהוי מולקולות קטנות ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים מריה Monton, ג&#39;ולי Lebert, Jessamyn ליטל, שין גה ולורה Lautens לסיוע בפיתוח של microarrays החלבון. המחברים גם להודות למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (NSERC) למימון עבודה זו. המחברים גם להודות לקרן קנדה עבור חדשנות ואמון חדשנות אונטריו לתמיכה של עבודה זו. JDB מחזיק קתדרה למחקר בקנדה ובכימית Bioanalytical BioInterfaces.

<ol><li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+HH+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li>
<li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li>
<li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li>
<li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacBeath%2C+GG+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAST+slides%3A+a+novel+surface+for+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li>
<li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li>
<li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+biologicals+within+silicate%2C+siloxane%2C+and+hybrid+sol-gel+polymers%3A+An+efficient+and+generic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sol-gel+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-modified+silanes%3A+precursors+for+silica+monoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469(2004).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+protein+microarray+support+materials%3A+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li>
<li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

המתודולוגיה שתוארה כאן נבחרה כמתאים ביותר לזיהוי חומרים הנגזרים סול ג&#39;ל להדפסה עם מדפסת קשר, בהפקה בזמן והליך יעיל וחסכוני לזיהוי חומרים במהירות אופטימלי מבלי לסנן כמויות גדולות של חומרים. מתוך סך של 20,000 ~ חומרים פוטנציאליים, ניתן היה לזהות ~ 200 חומרים שהיו מתאימים להדפסה על בסיס זמן gelation לבד. זו צמצמה באופן משמעותי את מספר החומרים הדרושים כדי להיות מוכנים לניסויי הדפסה שלאחר מכן. אלה חומרים להדפסה ואז היו מודפסים על גבי משטחי 4 שקופיות עבור סכום כולל של 768 חומר שקופיות שילובים. בממוצע, ניתן להדפיס 50 נקודות / משכפל של חומר אחד ב~ 3 דקות, כולל טעינת מדגם, נקודת תצהיר וניקוי סיכה. מבין אלו, 155 חומרים, או בערך 20%, אפשרו להדפסת המספר המקסימאלי של נקודות בספיגת פתרון והופקו גדלי ספוט לשחזור. יצוין, כי מ4 SLמשטחי IDE נבדקו, החומרים מודפסים טובים יותר לפי הסדר: אמין&gt; אפוקסי&gt; אלדהיד&gt; PMMA; שקופיות PMMA לא לייצר מערכים שימושיים עבור כל חומרים. זה סביר לייחס לקוטביות של משטח הציפוי. השוואה בין משטחי השקופיות האמורים, אמין ואפוקסי הקוטבי יותר היו מתאימים יותר לSols מימיים בהשוואה לשקופיות PMMA. יתר על כן, מהמשטחים שנבדקו, את השקופיות המצופים האמינות מספקות משטח טעון חיובי פוטנציאל להופקד anionic סול לאג&quot;ח. אנחנו חושדים, סיליקה חלקיקים בממשק שבין השקופיות וסול אינטראקציה על פני השטח. גם אפוקסי ומשטחי שקופיות אלדהיד חסרים את אותה האינטראקציה מבוססת עלות ראשונית. על מנת להבטיח מקום אופטימלי תצהיר זה מאוד מומלץ להשתמש בשקופיות מראש מצופים מן ספק כגון Arrayit. ציפוי בבית מייצר משטחים לא עקביים שיובילו לשחזור מקום עני ו13, במקרים מסוימים, עלול להוביל לכימות problems 18. חשיבות שווה, טמפרטורה ולחות ישפיעו &quot;printability&quot; של החומרים. אמנם אין מחקרים מפורטים על התופעות הקשורות לטמפרטורה בוצעו, הדפסה תמיד בוצעה בטמפרטורת חדר (23 ± 3 מעלות צלזיוס). לחות (יותר מ 80%) הייתה גם שלט בתוך חדר ההדפסה כדי למנוע סדיר צורת תצהיר בשל כרכי תצהיר קטנים (0.7-2.3 NL) ואידוי. בעוד מסך החומר לכוון זיהוי חומרים הנגזרים סול ג אופטימליים במיוחד עבור הדפסה של כאב וקינאזות, קבוצה קטנה של חומרים שאותרו עבדה עבור שני הסוגים של חלבונים. ואכן, גם מהחומרים שזוהו לקינאז microarray ייצור היו מבוסס על הס&quot;ס + + PVA גליצרול, ושני החומרים גם זוהו בתוך 26 החומרים שנבחרו לmicroarrays לכאוב. חומרים אלה &quot;אופטימליים&quot; עשויים להציע נקודת התחלה לפיתוח גנרי prote נוסףmicroarrays במסוממת סול ג מבוסס, והמסכים קטנים התרכזו סביב יצירות אלה עשויות לזהות חומרים טובים עוד יותר לייצור microarray. נקודה שנייה שיש לשים לב לחשיבותו של האנזים בשימוש. במקרה של כאב (אנזים ולא חזק), 26 (או בערך 40%) של 66 חומרים המקוריים שזוהו כassay תואם נשמרים הפעילות של כאב לכוד. עם זאת, לקינאזות העדינה יותר, רק 2 מתוך 69 יצירות assay התואמים, או בערך 3% מהחומרים, הצליחו לשמר את הפעילות של כל קינאזות. אמנם בכמות מספקת של אנזימים שונים לא נחקרה להצהיר הצהרות חד משמעיות, נראה כי מערך ייצור אופטימיזציה עם אנזימים יציבים יחסית יכול להוביל לזיהוי של חומרים שיכולים ללכוד מגוון רחב של חלבונים כדי לאפשר mutliplexed microarray הייצור. עצמאי של החלבון שנבחר, גורם החתך הגדול לזיהוי חומרים להדפסה היה הצורך בזמן רבפעמים gelation מהותיים (&gt; 2.5 שעות). בעת פיתוח חומרים מבוססי SS סול ג&#39;ל, שזה מאוד חשוב על מנת להבטיח כי לאחר חילוף יונים וסינון, סול הוא על ה-pH 4 ב. Sols עם pH ראשוני נמוך עלול לגרום לחומרים עם חומציות נמוכה מניטראלית, אשר יכול להשפיע על פעילות אנזים. 19 התאמת כמות Dowex (שרף חילוף יונים) לאס יכול לשנות את ה-pH הסופי של סול. כאשר קבוצה חדשה של השרף מוכנה היחס של שרף לאס צריך להיות מותאם כדי לייצר Sols בערך pH 4 ביצוע ההליך בסעיף 2 לפרוטוקול. בדומה לכך, הכנת DGS גבישים היא לעתים קרובות מקור השגיאה הקשור לכשל מהותי בעת השימוש בDGS Sols מבוסס למלכודת biomolecule. למרות שלא דווח כאן בהרחבה, בזהירות רבה צריכה להילקח בסינתזה של DGS גבישיים, בפרט בצורך למנוע את נוכחותם של מים במהלך הסינתזה, אשר יכול לייצר סיליקה polyglyceratedTES ולא DGS monomeric. כמו כן, בשל אופי hygroscopic של DGS, מדגם גבישים צריך להיות מאוחסנת מיובש ומשמש בתוך 6 חודשים לאחר סינתזה. DGS הקריסטל ישן יותר מ -6 חודשים לא יכול להתמוסס באופן מלא (הודות לחומרי סיליקט polyglyceryl חלקית מרוכז) אפילו עם sonication בסביבת חומצית. פירוק DGS שלם מייצר Sols עם תוכן בלתי ידוע ובלתי נשלט סיליקה וכך, חומרים פחות חזקים. נקודה חשובה לציין מגע עם הדפסה היא באיכות של הסיכות. סיכות ניזוקו או לרעה (איור 9) אף פעם לא תהיה לייצר מערכי שחזור עצמאיים של החומר המודפס. מומלץ לבדוק את איכות סיכה באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה על מנת להבטיח פינים שבורים או סתומים לא נמצאים בשימוש. טיפול זהיר מבטיח חיים ארוכים לסיכות. תנועה החופשית של הפינים היא גם חשובה. במקרים בהם לחות היא לכוד בתוך ראש ההדפסה בין הראש והסיכה, הסיכהלא מושב כהלכה ולכן לא יעשה את הקשר נכון עם פני השטח, וכתוצאה מכך חוסר בתצהיר של חומר. לסיכום, אנו מספקים גישת הקרנה מפורטת, רב שלבי לפיתוח microarrays חלבון עם צפיפות גבוהה מסוממת סיכה מודפסת. ההקרנה כרוכה באופטימיזציה של תכונות חומר (זמן וprintability gelation) כדי לאפשר הדפסה של חומרים, ואחריו הקרנה ממוקדת יותר לזהות חומרים התואמים את assay נתון והצליח לשמור על פעילות אנזים. גישת הקרנת חומר מודרך זה יכול להיות מיושם על פורמטי microarray נוספים כדי להפחית את הזמן והעלות הכרוך בהפקת microarrays צפיפות גבוהה יעילה.

Microarrays צבר פופולריות בקרב הקהילה המדעית כאמצעי להגדלת תפוקת assay. מאז הפיתוח של טכנולוגיית microarray להעריך ביטוי גני 1 בשנת 1990 באמצע, microarrays מצאו שימוש בפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה כדי לזהות מולקולת אינטראקציות בין חלבונים וחלבונים קטנים, ולמצוא חומרים חדשים בעלי תכונות ייחודיות. 2-5 לאחרונה, microarrays פותחו בו חומרים מסוימים המשמשים כדי לשתק חלבונים פונקציונליים, בהפקת אלמנט microarray תלת ממדי שבתוכו חלבונים בפח, מה שמאפשר למדידה קלילה של פעילות האנזימטית ועיכוב בmicroarray עצמו באמצעות הקרינה מתאימה assay כי הוא יחד למחזור המצע. 5-10 חשוב לציין, יכולה להיות מתוכנן microarrays כאלה שיכלול את כל המרכיבים הדרושים לדגימות מסך ובקרים יחד בצורה מאוד מקבילה. 5,8 &lt;/ P&gt; דוגמאות הראשונות של microarrays החלבון בדרך כלל הוכנו תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות לקיבוע על גבי חלבון תומך מוצק, כגון קובץ מצורף קוולנטיים, 11 זיקה ללכוד 3 וספיחה פיזית. בעוד 12 שיטות של ביו immobilization אלה מאפשרות לריכוז מדגם גדל וקינטיקה תגובה מואצת נדרשים מזעור assay, כל אחד מהם סובלים חסרונות. באופן כללי, כל לגרום לירידה בתפקוד האם של biomolecule בשל שינוי הכימי של פני השטח, הפריעה את גישה לאתרים פעילים, או נטייה פסולה בשל חוסר תנועה שאינה ספציפית. לפיכך, בכל שיטות התוצאה ברגישות assay נמוכה למרות עלייה בתצהיר biomolecule, סביר להניח שתגובה עולה בשל הצורך לקשור מולקולות ביולוגיות באופן מלאכותי למשטח. גישה המתעוררות לייצור microarrays biomolecule הפונקציונלי היא באמצעות סיכת הדפסה של חלבון מסומםSols סיליקה על גבי תומך מוצק, שהם בדרך כלל שקופיות זכוכית או פונקציונלית או בארות בודדות של צלחות microwell. תהליך סול ג&#39;ל עצמו מתרחש בסביבה מימית בטמפרטורת חדר, וזה מבשר נוזל שמודפס ולאחר מכן ג&#39;ל לביומולקולות לוכד בתוך מטריצת 3D, המאפשר לחלבון גבוה טעינת 13 כמו גם מלכודת של רכיבים מרובים בתוך אותו יסוד microarray. 13,14 חייטות של החומר נגזר סול ג ניתן לעשות זאת באמצעות בחירה זהירה של מבשרי סיליקה שונים, כמו גם על ידי שינוי המרכיב המימית באמצעות שימוש במאגרים שונים (pH, חוזק יוני), והכללתו של תוספים שונים (פולימרים, מולקולות קטנות) כדי להשיג את חומר אופטימלי, האופי המיוחד של אשר תלוי biomolecule כי הוא ממולכד. 10 מגבלה פוטנציאלית הקשורים בפיתוח microarrays חלבון הנגזר סול ג באמצעות סיכת הדפסההצורך לזהות חומרים מרוכבים על בסיס סול ג&#39;ל שניתן להדפיס ללא gelling בסיכה או מראים תכונות לא רצויות (גדלי irreproducible ספוט, פיצוח, הדבקה לקויה, חוסר תאימות עם רכיבי assay, פעילות חלבון עניה) מודפסות פעם אחת על משטח. 5 סימולטני אופטימיזציה של כל הפרמטרים הללו מונעת ניתן עצבו חומרי מסגרתו גישת דה נובו, או בדקה באיטיות באופן סדרתי. מצד השני, הקרנה של אלף רבים או עשרות אלפי של חומרים אקראיים היא לא זמן ולא, יעיל וחסכוני. במאמר זה, אנו מתארים את גישת הקרנה מכוונת המאפשרת זיהוי מהיר של חומרים המתאימים לייצור של חלבון microarrays ללא צורך במסך באופן אקראי מספר גדול של חומרים. באמצעות גישה מודרכת, חומרים מתאימים להדפסת microarray מזוהים ראשון, ואחריו סדרה של מסכי בקנה מידה קטנה לזיהוי אופטימלי סול ג נגזר materiשילובי al שניתן להדפיס reproducibly, ללא פיצוח ותואמים assay נתון. לבסוף, חומרים אופטימליים מזוהים מבוססים על שמירה של פעילות אנזים ובביצועי assay הקרנת מולקולה קטנה סופי. בדרך זו, ניתן לזהות חומרים אופטימליים מאלף מועמדים רבים באמצעות צעדי assay רק כמה מאה. אנו מדגימים גישה זו עבור ייצור של שניהם acetylcholinesterase בצפיפות גבוהה וmicroarrays multikinase ושימוש microarrays כאלה להקרנה מולקולה קטנה.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>ריאגנט/חומר</חזק></td></tr><tr><td>פולי (ויניל אלכוהול) (PVA)</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>360627</td><td>80% הידרולוז, M<תת>w 600</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 600 (PEG)</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>תמיסה של 50% משקל במים</td></tr><tr><td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>25% במים</td></tr><tr><td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>50% באתנול</td></tr><tr><td>ביס[(3-מתיל-דימתוקסיליל)פרופיל]תחמוצת פוליפרופילן (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מתילטרימתוקסילן (MTMS)</td><td>ג'לסט, בע"מ</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(triethoxysiyly)אתאן (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-אמינופרופילטריאתוקסילן (APTES)</td> <td>ג'לסט, בע"מ</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-טרהלוז דיהידראט</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N ואפסילון; </טווח>-אצטיל-L-ליזין</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, 1.0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 1.0 N/0.1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דיגליצרולסילן (DGS)</td><td></td><td></td><td>מוכן במעבדה</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן סיליקט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 שרף יונים אקסצ'אנס</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אצטילתיוכולין יודיד</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אצטילכולין אסטראז מElectrophorus electricus (צלופח חשמלי)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-CYSTINE</td><td>INVITROGEN</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q יהלום פוספופרוטאין/פוספופפטיד מיקרו-מערך ערכת כתמים</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת מלח דיסודיום אדנוזין 5'טריפוספט (ATP)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), EMD פעיל</td><td>Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>נתרם על ידי Millipore</td></tr><tr><td>Glycogen synthase kinase 3&beta; (GSK-3&בטא;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חלבון בסיסי מיאלין (MBP)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Substrate עבור MAPK2 ו-p38&alpha;, נתרם על ידי Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Substrate עבור GSK-3&beta;</td></tr><tr><td>פולי-גלו-טיר פוליפפטיד p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>מצע עבור</td></tr><tr><td>מערך סיכות התגנבות</td><td></td> EGFRIt <td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סיכת התגנבות</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות מצופות אמין</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות מצופות אלדהיד</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות מצופות אקספוזיציה</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות מצופות פולי (מתיל-מתקרילט) (PMMA)</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2-&mu; מסנן מזרק m</td><td>PALL מדעי החיים</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>Virtek מדפסת מגע</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיקרו-מערך שולחני</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>משמש לסינון כל המים הנדרשים לניסויים</td></tr></tbody></table>

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays מצאו שימוש בפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה לחומרים חדשים וגילוי של מוביל סמים מולקולות קטנות. מסמך זה אנו מתארים את הגישה חומרית הקרנה מודרכת לזיהוי חומרים מבוססי סול ג המתאימים לייצור חלבון microarrays תלת ממדית. הגישה ראשונה מזהה חומרים שניתן להדפיס כmicroarrays, מצמצמת את מספר החומרים אלו על ידי זיהוי התואמים את assay אנזים מסוים, ולאחר מכן התמקדות ברזולוציה גבוהה על חומרים אופטימליים המבוסס על שמירה של פעילות אנזים מקסימלית. גישה זו מיושמת לפתח microarrays מתאימה לשני מבחני אנזים שונים, אחד באמצעות acetylcholinesterase והשני באמצעות סדרה של ארבע קינאזות המרכזיות מעורבת בסרטן. בכל מקרה, אפשר היה לייצר microarrays שיכול לשמש למבחני מיון מולקולות קטנות כמותיים וייצור של עקומות תגובה מעכבים תלויות מינון. חשוב מכך, את יכולת מסך בן זוג רביםריאל הניב מידע על סוגי חומרים שהמתאימים ביותר הן ייצור microarray ושימור של פעילות אנזים. נתוני החומרים לספק תובנות לגבי דרישות חומר בסיסיות הנדרשות להתאמה אופטימלית microarrays, בצפיפות גבוהה הנגזרת סול ג.

על ידי ביצוע ניתוח גורמים מודרך למסך חומר, היינו יכול לצמצם את מספר החומרים שנבדקו מ~ 20,000 לכמה מאה שהיו פעמים gelation מתאימות להדפסה. על ידי יישום קפדני זמן הנחיה הדורש חומר gelation של 2.5 שעות או יותר, חומרים העשויים להדביק את סיכות הדפסה או לייצר מערכי irreproducible מעולם לא הודפסו. את החומרים להדפסה זיהו שיש (&gt; 2.5 שעות) פעמים gelation מספיק היו מודפסים על גבי משטחי זכוכית שקופית 4 פונקציונליות שונים. כדי להיחשב &quot;להדפסה&quot;, מספר המקסימאלי של נקודות בהיקף ספיגה של הסיכה היה צריך להיות מודפס (SMP3 = 200). כתמים נבדקו גם למורפולוגיה נקודה כדי להבטיח שאין הפרדת פאזות פיצוח או לא רצויה שהתרחשה באמצעות מיקרוסקופ brightfield פשוט כפי שמוצג באיור 2. מהשלב הזה של חומרים להדפסה שזוהו, microarrays יוצרו עם כאב וקינאזות שולבה המרכיב המימית שנאגרו. חומרים שהיו בקנה אחד עם נוהל assay (כולל overprinting פוטנציאל ושטיפה או צביעת מדרגות) זוהו על ידי התבוננות שימור של כתמי microarray (לא נסדק, אובדן של כתמים או דפוסי הקרינה חריגים) ושליטה חיובית (PC) לביקורת שלילית (NC ) יחס גדול מ -1 כפי שנצפה דרך תמונה. כפי שזה היה בערך 50% מהחומרים, יחס מחשב / NC גדול יותר של 3 שימש להגדרת חומרים אופטימליים עם שמירה של פעילות חלבון. באמצעות שיטה זו, 26 חומרי סול ג נגזרות המכילים חומרים המכילים 2 כאב וקינאזות עומדת בקריטריונים&gt; 3 PC / NC. איור 3 ואיור 4 מראים פירוט גרפי של 5 שלבים מהותי המסך המודרכים לזיהוי של כאב וקינאז אופטימליים microarrays, בהתאמה. יכולים להיות גם תוקף את מבחני באמצעות הדור של הציון &#39;זי. 17 </sup&gt; זה נעשה שימוש בחומר שהופק יחס המחשב / NC הגבוה ביותר. איור 5 מראה העלילה &quot;Z מתקבלת על ידי השוואת האותות שנוצרו מ200 נקודות, 100 ומחשב 100 NC לאחר overprinting צבע המחוון והמצע על המערך לכאוב. את הכאב ואת מערכי קינאז הביאו את ציוני ההתאמה &quot;Z של 0.60 ו 0.67, מעידים על assay מצוין. עם זאת, יש לציין כי לפני אימות assay, ריכוזי אנזים, צבע, מצע וcofactor על מערך היינו צריכים להיות מותאמים על ידי overprinting טווח הריכוזים של כל רכיב ובחירה בריכוז שהפיק את האות הגבוה ביותר, כפי שתוארו בפירוט במקום אחר 5. כדי לאמת את מבחני, נתונים כמותיים עיכוב התקבלו באמצעות מעכבי כאב ידועים ובלתי ידועים, עם תוצאות שבוצעו בשני עותקים, ומשמשות לייצור מגרשים כפולים (איור 6 א) ועיקולים עיכוב (האיורים 6B ו6C). &lt;כתמים&gt; חזקים היו overprinted הראשון עם תערובות של מעכבי מולקולות קטנות פעילים ביולוגי הידועים לאחר מכן עם צבע ומצע, ותערובות המכילות גם בקרת מעכבים ידועים או לא מעכב נכללו. מגרשים כפולים נוצרו כדי להעריך את פעילות אנזים, וכל תערובות שתסתיימנה בפחות מ -25% בפעילות אנזים נחשבו חיובית לעיכוב. תרכובות בודדות מתערובות כאלה אז נבדקו בשני עותקים לזהות מולקולה הקטנה (ים) הספציפית אחראית לעיכוב. לאחר שזוהה, מולקולות קטנות אלה משמשים ליצירת עקומות עיכוב כמותיים כדי לקבוע IC 50 ערכים וקבועים עיכוב. תוצאות איכותיות דומות התקבלו באמצעות מערך multikinase עם מעכבי קינאז משותפים, staurosporine. איור 7 א ו -7 להראות את תמונת microarray ומצביעים על כך שעוצמות האות לאחר overprinting ומכתים את multikinaseמערך הוא כצפוי לביקורת שלילית (- ATP), בקרה חיובית (+ ATP) ומעכב ידוע (+ + INH-ATP). כדי להדגים את היכולת לקבל נתונים כמותיים עיכוב מmicroarrays, assay עיכוב תלוי ריכוז נעשה לקינאז אחת. כפי שניתן לראות בתרשימים ו8A 8B, עוצמת אות יורדת עם עלייה בריכוז מעכב, ואת התגובה להלן עקומה תלוית הריכוז הצפוי עיכוב למערכת קינאז / מצע p38α/MBP. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי כללי לגישת הקרנת חומרים מודרכת. כל בלוק, מהווה צעד של המסך בסדר רציף. מספרים בצד השמאל מייצגים את המספר הכולל של חומרים שהוכנו לצורך הניתוח. שימוש בזמן gelation יותר מ -2.5 שעות (חומרים בעלי פעמים gelation פחות מ -2.5 שעות arדואר מצויינים על ידי הקו החוצה), מספר החומרים שעברו כל אחד משלבים ומועברים בזמן מסך חומר מסומן במספר בצד ימין. * מייצג חומרים עם פחות מהפרדת פאזות אופטימלית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> איור 2. תמונות אופטיות המראות מצבי כשל שונים של חומרים בצעד printability של המסך. תמונה של חומר &quot;טוב&quot; (שורה שנייה, עמודה שלישית) היא גם הראתה להשוואה. התפרסם באישור התייחסות 8, האגודה אמריקנית לכימית זכויות יוצרים 2013. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> איור 3. גישה מכוונת לזיהוי חומרי הקרנה של חומרים אופטימליים לבודת סול ג הנגזרות microarrays לכאוב. הודפס מחדש בסלסולission מהתייחסות 5, האגודה אמריקנית לכימית זכויות יוצרים 2013. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> איור 4. גישה מכוונת חומרי סינון לזיהוי של חומרים אופטימליים לבודת microarrays קינאז סול ג הנגזרות. התפרסם באישור התייחסות 8, האגודה אמריקנית לכימית זכויות יוצרים 2013. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> איור 5. (א) קטע של microarray AChE מראה HC (ירוק בהיר) וLC (אור ירוק) נקודות (צבעים שחורים, ירוקים יושמו כpseudocolor לבהירות של מצגת), (ב) תצוגה מוגדלת של האזור התאגרף כדי להדגיש נקודה מורפולוגיה ויישור; ו. (ג) העלילה &quot;Z קווים מלאים מצביעים על הממוצע של<html> משכפל, בעוד קווים מקווקווים מתאים ל3SD. התפרסם באישור התייחסות 5, האגודה אמריקנית לכימית זכויות יוצרים 2013. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> איור 6. () שכפל מגרש להקרנה על מערך של אנלוגים סינטטיים של אלקלואידים Amaryllidaceae, (ב) IC 50 מגרשים של מעכבים פוטנציאליים שזוהו סומנו כתרכובות 1 ו (ג) במתחם 2, עם טווח טעות מייצג סטיית תקן אחת של הממוצע בין 25 משכפל. כתמי נציג מוצגים כדי להמחיש הבדלים באות פרופורציונלית לריכוזים מעכבים. התפרסם באישור התייחסות 5, האגודה כימי זכויות יוצרים 2013 אמריקנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> NT &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> איור 7. assay על מערך של ארבע קינאזות באמצעות 1.4SS/1.0PVA למלכוד ומודפס על גבי שקופית אמין-derivatized. () תמונה של קטע מmicroarray בי כתמים עם קינאז במשותף ממולכד עם מצעים שלהם היו overprinted עם חיץ (צפון קרוליינה, בשורה העליונה), או פתרונות המכילים ATP (מחשב, בשורה האמצעית) או ה-ATP + staurosporine (בשורה תחתונה). (ב) גרפים בר השוואת עוצמות אות בין עכבות ותגובות חסרות מעצורים, לאחר הפחתה של אותות רקע וברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת מהממוצע מ 25 חזרות. התפרסם באישור התייחסות 8, האגודה אמריקנית לכימית זכויות יוצרים 2013. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> איור 8. Inhibiti. על assay על microarray p38a/MBP (א) סעיפים של microarrays מראה כתמים יציגים overspotted עם ריכוזים שונים של staurosporine, כפי שצוינו (את התמונות התקבלו על ידי סריקה בודדת של אותה השקופית; תמונה מורכבת מוצגת לבהירות). (ב) עקומת IC 50 נוצרה מתמונות המערך נותחו. העצמה השיגה ב 100 מ&quot;מ מפחיתים את כל התמונות, את כל העוצמות האחרות היו מנורמלות על ידי קביעת עוצמת הושגה ב10 ננומטר לערך של 100% פעילות. התפרסם באישור התייחסות 8, האגודה אמריקנית לכימית זכויות יוצרים 2013. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> איור 9. תמונות של סיכת התגנבות מיקרוסקופית המשמשת למגע סיכת הדפסה מראה פגמים שונים: (א) סתום, (ב) מקופלות.

גישה חומרי הקרנה מודרכת לפתח microarrays מסוממת סול ג נגזר חלבון באמצעות שיטת סיכת הדפסה מתפתחת של ייצור מתוארת. מתודולוגיה זו באה לידי ביטוי באמצעות הפיתוח של acetylcholinesterase וmultikinase microarrays, המשמשים להקרנת מולקולה קטנה וחסכונית.

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות חומרים חדשים מבוססי ג'ל סול (sol gel) לייצור מערכי מיקרו (microarrays) ולהשתמש בהם עבור בדיקות אנזימטיות בנפחים ננומטריים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי זיהוי חומרים בעלי זמני סול-ג'ל (sol-gel transition) מספיק ארוכים כדי למנוע ג'לוס בסיכת ההדפסה של מערך המיקרו במהלך תהליך ההדפסה. השלב השני הוא להעריך חומרים בעלי זמני מעבר ארוכים מבחינת יכולת ההדפסה שלהם כמערכי מיקרו, השחזוריות, העמידות לסדקים, איכות ההיצמדות, הפרדה לא רצויה של פאזות, ובסופו של דבר, פעילות גבוהה של האנזימים הכלואים.בשלב הבא, האנזים הנחקר מודפס כמערך מיקרו (microarray) באמצעות החומרים האופטימליים, ונבדקת יכולתו לספוג את תמיסת הבדיקה וליצור תגובה אנזימטית מדידה. השלב הסופי הוא להעריך את החומרים ביכולתם לספק בדיקות בעלות הדירות גבוהה תוך שימוש באנזים הנחקר ולהפיק נתונים כמותיים. לאחר מכן נבחר החומר הסופי לייצור המערך.בסופו של דבר, מערכי מיקרו-חלבונים המופקים מ-soul gel משמשים לזיהוי של מולקולות קטנות המפחיתות את פעילות האנזים. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון סריקה מבוססת פלטות, הוא היכולת לסרוק מספר רב של חומרים באופן שיטתי ומהיר מאוד תוך שימוש בנפחים נמוכים של ריאגנטים. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בטכניקה זו יתקלו בקשיים, שכן ייתכן שחומרים יהפכו לג'ל בתוך פיני ההדפסה.אם אלו לא ינוקו כראוי, הדבר יוביל לכתמים שהופספסו, שעלולים להתפרש כחומרים שאינם ניתנים להדפסה. כדי להתחיל, הכינו את תמיסות התוספים הרבות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. ניתן להכין מראש רבות מהתמיסות ולאחסנן למשך חודש אחד או יותר בתנאים המתאימים, אך חלקן חייבות להיות מוכנות ביום הניסוי.ערבבו את המסמיכים המבוססים על נתרן סיליקט מיד לפני השימוש, והקפידו לשמור אותם על קרח. יש להשתמש ב-SOS בתוך שעה מהוספת המים, שכן זמני המתנה ממושכים יותר יובילו לזמני DATION קצרים ולא עקביים. לאחר מכן, הכינו שילובים שונים של בופרים, פולימרים של תמיסות ו-organs lanes כפי שמונחה בפרוטוקול הטקסט המצורף, כדי לזהות אילו שילובים יכולים לשמש כחומר להדפסה עם זמני התפשטות העולים על 2.5 שעות.לאחר שזוהו מספר שילובים, הגדירו את הלחות בתוך תא ההדפסה ל-80% עד 90%; לחות של פחות מ-80% עלולה להוביל להתאיידות של הדגימות ולאי-עקביות בהדפסה עקב נפחי ההשקעה הקטנים של המדפסת. כעת, כאשר המערכת מוכנה, הגדירו את תבניות המערך להדפסה באמצעות תוכנת ה-Chip Writer Pro. הגדירו את מהירות התנועה בכיוון XY ל-10 millimeters per second ואת מהירות הגישה לדגימה בכיוון Z ל-2 millimeters per second, עם זמן טעינת דגימה של 2.5 second, תוך שימוש בשילובים של saw gel שזוהו קודם לכן.הכינו 25 µL של חומרי הבסיס על ידי שילוב הפולימרים, האורגנו-לנזים ותוספי המולקולות הקטנות המתאימים שזוהו בתהליך הסינון המקדים. השתמשו ב-50 mM HEPES ב-pH של 8.0 בבארות בודדות של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לארבעה פינים בעלי חריצים בקוטר של 100 micron במים מזוקקים פעמיים.לאחר 15 דקות, ייבשו אותם תחת זרם חנקן. לאחר מכן, השתמשו במנקה מקטרות כדי להסיר לחות שאריתית מתוך מחזיק הפינים והניחו בזהירות את הפין בראש ההדפסה של רובוט הדפסת פיני המגע. אי-הסרה של לחות שאריתית עלולה למנוע מהפין לנוע בחופשיות עם המחזיק, דבר שיוביל להשמטת נקודות הדפסה.לאחר מכן, הוסיפו 25 µL של ה-SA המתאים לבאר רגע לפני ההדפסה. ערבבו את התמיסה באמצעות תנועת פיפטציה מעלה ומטה, כאשר בערבוב באמצעות פיפטה יש לחזור על הפעולה 50 פעמים. מזערו את כמות האוויר הנכנסת לתמיסה.בועות אוויר מונעות טעינה מלאה של הדגימה בתוך הפין. לאחר מכן, טענו את הפין על ידי השמדתו אל תוך הדגימה. ברגע שהפינים טעונים, התחילו בתהליך ההדפסה והדפיסו את הדגימה על פני השטח של שקף אחד.עצרו את תהליך ההדפסה לפני הוספת מלח לפלטת המקור הבאה. כאשר התהליך מושהה, הסירו את פין ההדפסה באמצעות מגנט והניחו מנקה מקריאות בראש ההדפסה כדי למנוע הצטברות לחות בראש ההדפסה. לאחר מכן, שטפו את פין ההדפסה במים מזוקקים פעמיים ובצעו לו סוניקציה במים מזוקקים פעמיים נקיים למשך 30 שניות.בשלב הבא, ייבשו את פין ההדפסה תחת זרם חנקן ולאחר מכן החזירו את הפין לראש ההדפסה. המשיכו בערבוב, בהדפסה ובניקוי עבור כל הדגימות שנותרו בלוח המקור; עד ל-12,000 נקודות בקוטר של 100 microns ניתנות להשקעה על גבי שקופית אחת. עם סיום ההדפסה, יישנו את המערך למשך 30 דקות לפחות ועד 24 שעות בתוך תא ההדפסה בלחות של 80% עד 90%.הכינו 50 µL של הבקרה החיובית רגע לפני השימוש על ידי ערבוב של 25 µL של acetylcholine iodide בריכוז 1 mM, ו-0.14 µL של bodi pi, FIL cysteine בריכוז 5 mM, ו-tris בריכוז 25 mM ב-pH 7.0 עם 4% glycerol בתוך באר של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות; שאיפו והתירו את התמיסה באיטות באמצעות פיפטה כדי לערבב ללא יצירת בועות. לאחר מכן, הכינו את הבקרות השליליות רגע לפני השימוש על ידי ערבוב של 0.14 µL של boai PI FIL cysteine בריכוז 5 mM עם 49.86 µL של tris בריכוז 25 mM ב-pH 7.0 עם 4% glycerol בתוך באר אחרת של פלטת מיקרוטיטר בעלת 384 בארות, וערבבו בעדינות. הדפיסו את הבקרות על גבי המיקרו-מערכים המיושנים תוך שימוש באותם תהליכים שתוארו בסעיף הקודם. עם זאת, במקום בפינים בעלי קוטר של 100 µm, השתמשו בפיני chief בעלי קוטר של 235 µm.פעולה זו מבטיחה שהתמיסות יכסו לחלוטין את הנקודות שהורספו קודם לכן. יש להשקיע את הנקודות במערכים בלחות של 80% עד 90% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, וזאת בשל הידרוליזה עצמית של acetylcholine. זמני דגירה ממושכים יותר עלולים להוביל לתוצאות חיוביות שגויות עקב פעילות אנזימטית מוגברת.ודאו שסורק המערכים alpha innotech novo array imager דלוק ומצויד במסנן עירור של 478 ± 17 nanometer ובמסנן פליטה של 538 ± 21 nanometer למדידת מערכי המיקרו-מערכים של acetylcholine esterase. לאחר מכן, הניחו את השקופית במחזיק השקופיות כאשר הנקודות פונות כלפי מעלה. הגדירו את מספר מקטעי התצוגה המקדימה כך שלפחות מקטע אחד מכל צד של שקופית המיקרוסקופ יוצג בתצוגה מקדימה ברזולוציה מינימלית של 4 micrometers תוך שימוש בחשיפה אוטומטית.לאחר שהפרמטרים נמצאו מקובלים, רכשו תמונת סלייד ושמרו אותה כקובץ TIFF. לאחר מכן, פתחו את תמונת הסלייד שנרכשה ב-Image J 64. לחצו על כלי הבחירה האובלי (Oval Selection Tool) ובחרו כל נקודה.בחר אזור הגדול מעט מהנקודה שנצפתה, והקפד להשתמש בגודל עקבי בין הנקודות כדי להפחית את הסובייקטיביות של Image J. לאחר מכן, מדוד את עוצמת האות של כל נקודה באמצעות אפשיית המדידה (measure) תחת לשונית הניתוח (analyze). חשב ממוצע של העוצמה מ-25 נקודות דומות של ביקורת חיובית וחלק אותו בעוצמה הממוצעת של 25 נקודות דומות של ביקורת שלילית, כדי לקבל את היחס בין הביקורת החיובית לביקורת השלילית עבור הרכבי החומרים הבודדים.מוצגת כאן דוגמה לטווח הדינמי של המיקרומערכים שהוכנו בשיטות אלו. הביקורות הגבוהות הניבו אזורים ירוקים בהירים, בעוד שהביקורות הנמוכות הניבו נקודות עמומות הרבה יותר. העוצמה כפי שנמדדה באמצעות Image J 64 מראה כי בביקורות הגבוהות הממוצע הוא כ-22,000 יחידות פלואורסצנציה יחסיות, ובביקורות הנמוכות הממוצע היה קרוב ל-8,000.הקווים המקווקוים מייצגים שלוש סטיות תקן מהממוצע. להלן דוגמאות למערכי מיקרו-מערכים (microarrays) עבור סריקת מערך כבוד של אנלוגים סינתטיים של alkaloids מ-ameral sier שזוהו כתרכובת אחת ותרכובת שתיים. שני הצירים מייצגים את אחוז האנזים כפי שנקבע על ידי האות הפלואורסצנטית.בכפולות, קרבת הנקודות לאלכסון מייצגת הדירות גבוהה של הבדיקה. מוצגים כאן גרפי IC 50 של שני מעכבים פוטנציאליים שונים. תרכובת אחת הניבה רמת IC 50 של 16 micromolar, בעוד שה-IC 50 של תרכובת שתיים היה 21 micromolar. נקודות מייצגות מוצגות לעיל כדי להמחיש הבדלים באות הפרופורציונלי לריכוזי המעכבים.המערך המוצג כאן הודפס עם ארבעה קינזות שונות, P 38 map kinase, EGFR ו-GSK, ועליו הודפסו בתוספת באפר בלבד, באפר המכיל ATP ובאפר המכיל ATP ו-staurosporin, מעכב של פעילות אנזימטית. התוצאות מראות השפעה משמעותית של מעכב הקינזה staurosporin, בהתבסס על עצימויות הפלואורסצנציה שהתקבלו כפי שמתואר כאן. ההבדל הגדול ביותר שנראה בריכוז ה-staurosporin שנעשה בו שימוש כאן היה בנקודות ה-P 38.כאן מוצגים נקודות מייצגות של מערך מיקרו-מערך (microarray) מסוג BP P 30 8:00 AM, אשר עליהן הונחו ריכוזים שונים של stor sporin. כפי שצוין, ה-IC 50 של מולקולה זו נקבע כ-one micromolar והוא מוצג בגרף מימין. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי על פי פרוטוקול זה.ניתן לבצע גם שיטות אחרות, כגון בדיקות אימונו-אסיי (immunoassays) או בדיקות אינטראקציה של חלבונים, כדי להשיב על שאלות נוספות הקשורות לאבחון או לגילוי מולקולות קטנות.

a-guided-materials-screening-approach-for-developing-quantitative-sol

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

בעבר פותחה מערכת לניתוח אוטומטי ומהיר של גליקנים על חלבונים. מאמר זה מציג את הפרוטוקול ל"ניתוח גליקו-איכותני", המותאם למגוון רחב של משתמשים, כגון אלה העוסקים בניתוח מבנים גליקניים בביו-פרמצבטיקה ובחומרים גליקוקו-מצומדים אחרים.

הערכה גליקולית-איכותית מהירה של חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכת אוטומטית לחלוטין

למד גישת סינון חומרים מודרכת לפיתוח מיקרואריי חלבון מסול-ג'ל באמצעות שיטת הדפסת פין. שיטה זו מאפשרת סינון מערכי אנזימים כמו אצטילכולינאסטרז ומולטי-קינאז לזיהוי מולקולות קטנות ביעילות גבוהה.

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

גלה סרטונים נוספים