נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

מאמר וידאו זה מתאר הליך להשגת פרופילי גליקוזילציה של 20 גליקופרוטאינים שונים בדגימת סרום של חולה קרצינומה של הכבד באמצעות מיקרו-מערך נוגדנים חסום כימית גליקופרוטאין ראשון נוגדנים ספציפיים מודפסים ישירות על שקופיות מיקרו-מערך וגליקנים של נוגדנים נחסמים כדי למנוע קשירת לקטין. כאשר מורחים דגימות סרום של המטופל, גליקופרוטאינים מהדגימה נלכדים על ידי הנוגדנים. לאחר מכן מוסיפים חלבונים קושרים של גליקן ביוטיניל כדי לזהות את הגליקנים ומוסיפים נוי טרוויין מצומד כדי לתייג את הלקטינים הביוטיניים.

לאחר מכן נסרקת שקופית המיקרו-מערך כדי לזהות ניתוח פלואורסצנטי של הנתונים המתקבלים חושף את פרופילי הגליקוזילציה של חלבוני הדגימה. לטכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטה קיימת כמו HPLC. שיטה זו מאפשרת זיהוי של גליקופרוטאינים בודדים במצבם המקורי.

זה מהיר וקל יותר לסנן שינוי גליקוזילציה עבור מספר חלבונים בו זמנית. בסדר, גילינו שסמנים ביולוגיים של מחלות, במיוחד של סרטן וסרטן הכבד, שבדקנו בזהירות רבה, הם לעתים קרובות מגליקוזילטים. והיכולת לזהות צורות גליקו ספציפיות שמצאנו משפרת מאוד את ביצועי הסמנים הביולוגיים ברגישות ובספציפיות שלהם.

אז מדד זה יכול לספק תובנות לגבי שינויים בגליקוזילציה על חלבוני סרום מרובים ב-HCC. ניתן ליישם אותו גם על מחקר הפתולוגיה וגילוי סמנים ביולוגיים בסוגי סרטן ומחלות אחרות כגון סרטן הלבלב, סוכרת ומחלת אלצהיימר. תדגים את ההליך צ'ן לו, טכנאית מהמעבדה שלי.

התחל פרוטוקול זה על ידי הכנת מיקרו-מערך הנוגדנים תחילה בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 0.8 מיליליטר על קרח לדלל את כל הנוגדנים שישמשו להדפסת מיקרו-מערך לריכוז של 0.5 מיליגרם למיליליטר במינימום של 40 מיליליטר PBS כאן, 26 נוגדנים שונים ישמשו כבקרה חיובית. הכינו גם את אותה כמות של 0.5 מיליגרם למיליליטר של BSA ביוטיניל ב-PBS. השתמש בצינור כדי להוציא 40 מיליליטר מכל נוגדן לתוך צלחת מקור הבאר 384 על קרח.

לאחר מכן, בתוכנת בקרת המיקרו-מערך, ציין כל מיקום נוגדנים. לאחר מכן, טען את הצלחת על המיקרו-מערך כמקור. לאחר מכן טען 20 שקופיות מיקרו-מערך נתיב על המיקרו-מערך כמטרה.

הגדר את המיקרו-מערך להדפיס 48 מערכי סובר זהים שבהם 27 נוגדנים וחלבוני בקרה מזוהים בשלוש פעמים בתבנית תשע על תשע. הפעל את המיקרו-מערך כדי להדפיס את שקופיות המיקרו-מערך של הנוגדנים. אסוף את שקופיות המיקרו-מערך של הנוגדנים ואחסן אותן בקלטת שקופיות עם חומר ייבוש.

אטום את הקסטה בשקית ניילון כדי למנוע דנטורציה של חלבון ולחות על המגלשות במהלך האחסון. אחסן את שקופיות המיקרו-מערך האטומות בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. ההיבט הקשה והחשוב ביותר בהליך זה הוא שלב החסימה הכימית.

כדי להבטיח הצלחה, זה קריטי שכמות מספקת של נוגדנים תודפס על נורית מערך המיקרו. הכינו תמיד נתרן IDE טרי והידרוציט חומצה חקלאית מיד לפני הניסוי. והקפידו לבצע את הליך החמצון בארבע מעלות תוך הימנעות מאור.

הוציאו את מגלשות המיקרו-מערך מהמקרר ואזנו אותן לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הסר שקופית מקופסת האחסון. טבלו בקצרה את המגלשה בכיור המכיל PBS עם 0.1% בין 20.

לאחר מכן טבלו את השקופית במאגר נתרן אצטט 15 מילי-מולרי עם 0.1% טווין למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכינו נתרן טרי של 150 מילי-מולרי ליודאט במאגר נתרן אצטט של 15 מילי-מולרי, והעבירו אותו לכיור כביסה שקופית אחסן במקרר, הימנע מאור עד השימוש. הסר את השקופית ממאגר הנתרן אצטט והכנס אותה לאגן המכיל מטהר נתרן טרי כשצד הנוגדן פונה כלפי מעלה.

מכסים את האגן בנייר אלומיניום כדי למנוע אור. לאחר מכן הניחו את אגן השקופיות בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך שעתיים. הסר את המגלשה מהאגן ושטוף אותה לזמן קצר במאגר נתרן אצטט שלוש פעמים למשך חמש דקות.

דגרו את השקופית ב -300 מיליליטר של תמיסת חסימת חומצה הידרו גלוטמית טרייה של 10 מילי-מולרית בתא דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. הסר את השקופיות מהתא ושטוף אותן עם PBS עם 0.1% טווין למשך שלוש דקות. לאחר מכן, בכיור כביסה שקופיות, דגרו את מגלשת המיקרו-מערך ב-300 מיליליטר של 1% BSA ב-PBS עם 0.5% טווין למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

שטפו את השקופיות ב-PBS עם 0.1% טווין שלוש פעמים למשך שלוש דקות. הנח את השקופית על מתלה שקופיות וסובב ב -1, 200 פעמים G למשך שתי דקות כדי לייבש את שקופית המיקרו-מערך הבאה. כדי להפריד בין כל מערך סובר, רשת שעווה מוטבעת על השקופית.

לאחר חימום מוקדם של מדפיס השעווה ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, טען את שקופית המיקרו-מערך החסומה לתוך מדפיס השעווה כשצד הנוגדן פונה לכיוון השעווה. משוך בעדינות את הידית כדי להטביע שעווה באופן שווה על השקופית. ניתן להשתמש בשיטה זו לביצוע בדיקות פרופיל גליקו עבור דגימה בודדת או למדידת אפיטופ גליקו בודד במספר דגימות.

כאן נדגים מבחני פרופיל גליקו. התחל בדילול של 40 מיקרוליטר סרום ל-360 מיקרוליטר PBS המכילים 0.1% בין 0.1% גשר 35 ו-100 מיקרוגרם למיליליטר, כל אחד של IgG של עכבר, חולדה, ארנב, עז וחמור. נפח זה מספיק למריחת שישה מיקרוליטרים של תמיסת סרום מדוללת על כל תת-מערך.

החל בזהירות שישה מיקרוליטר של הדגימה המדוללת או הבקרה על כל תת-מערך של השקופית. דגרו את השקופית בקלטת לחה עם מגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו את השקופית עם PBS עם 0.1% שלוש פעמים למשך שלוש דקות.

לאחר מכן יבש את השקופית על ידי סיבובה ב -1200 פעמים G למשך שתי דקות. הכן 20 מיקרוליטר של חלבוני קשירת הגליקן הביוטיניים ב-10 מיליגרם למיליליטר ב-PBS טווין בצינור מיקרו-פוגה של 0.8 מיליליטר על קרח. מרחו שישה מיקרוליטרים של הלקטינים הביוטיניליים המדוללים על כל תת-מערך של המגלשה ודגרו בקופסת השקופיות הלחה עם מגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר שטיפת השקופיות עם PBS עם 0.1% שלוש פעמים כמו קודם, יבש את השקופית על ידי סיבובה ב-1200 פעמים G בצנטריפוגה למשך שתי דקות. הכן 400 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר DITE 5 49 מסומן neut travain ב-PBS 0.1% טווין בצינור מיקרו פוגה של 0.8 מיליליטר על קרח. השתמש בצינור חוזר כדי למרוח שישה מיקרוליטרים של DITE 5 49 עם תווית neut travain על כל מערך משנה ולדגור את המגלשה בקלטת השקופיות הלחה בטמפרטורת החדר למשך שעה לאחר הדגירה.

שטפו את השקופית עם PBS 0.1% שלוש פעמים למשך שלוש דקות. יבש את השקופית על ידי סיבובה ב -1200 פעמים G בצנטריפוגה למשך שתי דקות. סרוק את השקופית באמצעות סורק מיקרו-מערך פלואורסצנטי ברזולוציה של 10 מילימטר.

הגדרות הלייזר וה-PMT צריכות להיות חזקות ככל האפשר תוך הקפדה על כך שלא נצפתה רוויה. פתח את התמונה במערך Pro 3.2. הגדר את תבנית המערך בהתאם למפת המערך המציגה את מיקומי נקודות הנוגדנים.

יישר בזהירות כל עיגול תבנית לנקודה המתאימה בתמונה, חלץ את העוצמה של כל נקודה לקובץ Excel להמשך ניתוח. מערך מיקרו נוגדנים המכיל 48 מערכי סובר זהים עם 26 נוגדנים כנגד 20 גליקופרוטאינים בסרום וביוטין. BSA תוכנן ויוצר כמתואר בסרטון זה כדי לבחון את חשיבות הליך החסימה.

בניתוח פרופיל גליקופרוטאין, נוצרו שתי שקופיות מיקרו-מערך זהות. אחד לא נחסם כימית ואילו השני היה דגימת ביקורת הוחלה על מערכי סובר בעמודות 1 ו-3 ודגימת סרום HCC מאוגדת הוחלה על מערכי הסובר. בטורים 2 ו-4 22.

לאחר מכן הוחלו לקטינים ביוטיניים ספציפיים לגליקנים שונים על כל תת-מערך כפי שמוצג בתמונות אלה של מערכי הסובר. לקטינים קשורים ללכוד נוגדנים בעמודות הבקרה ונותנים רקע גבוה שלא ניתן היה להבחין בו מהעמודות הטעונות בסרום במיקרו-מערכים הלא חסומים. עם זאת, כאשר אותו ניסוי נעשה על שקופית מיקרו-מערך נוגדנים חסומה כימית, לא הייתה קשירה נמוכה מאוד ללכידת נוגדנים בעמודות הבקרה וקשירת אנטיגן גבוהה בעמודות הטעונות בסרום.

תוצאות אלו מדגימות כי הליך החסימה הכימית הוא שלב קריטי למדידת גליקנים על גליקופרוטאינים שנלכדו בנוגדנים על ידי ביצוע הפרוטוקול ניתן להשיג פרופילי גליקוזילציה של 22 גליקופרוטאינים בסרום HCC לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי. נוגדנים כאשר הם משתנים עלולים לאבד את זיקתם לאנטיגנים ולתכונות אחרות שלהם.

לכן חשוב לזכור זאת ולהשתמש במספר נוגדנים שונים במקורות שונים של נוגדנים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו זיהוי של כל ריכוז חלבון באמצעות אותה שקופית מיקרו-קרניים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם השינוי בגליקוזילציה נובע משינוי ברמות ביטוי החלבון או אך ורק בגלל שינוי הגליקוזילציה בכל חלבון בודד. אל תשכח שעבודה עם דגימות סרום המכילות פתוגן עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון כפפות מגן בעת ביצוע הליך זה.