Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו
15 במרץ 2011
אנו מדגימים את השימוש microarrays DNA עבור פרופיל הביטוי של מערכת העצבים. אנו מתארים לשלוט RNA איכות, תיוג המדגם, הכלאה מערך סריקה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניסוי מיקרו-מערך באמצעות מכשיר מערבל אוטומטי. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של איכות דגימות ה-RNA עם הביו-אנלייזר לאחר הגברה ותיוג RNA. דגימות ה-RNA מוכלאות למיקרו-מערכים.
לבסוף, המיקרו-מערכים ההיברידיים נשטפים ונסרקים. בסופו של דבר, מתקבלות תוצאות המראות את הביטוי הדיפרנציאלי של תעתיקי RNA באמצעות ניתוח תמונות מיקרו-מערך פלואורסצנטיות בצבע כפול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההיברידיזציה של מיקרו-מערך בגלל הציוד המיוחד.
ניתוח בקרת איכות מתחיל בהכנת מכשיר הביו-אנלייזר 2, 100 ותחנת השבב לפי ההוראות בנוהל הכתוב. לאחר מכן מסננים את מטריצת הג'ל על ידי פיפטינג של 550 מיקרוליטר לתוך מסנן ספין המסופק עם צנטריפוגה של ערכת RNA 6, 000 ננו. המסנן ב -1, 500 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן יש להצטט את הג'ל המסונן ל -65 מיקרוליטר אליקוטים, אותם ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד חודש. מערבלים את תרכיז הצבע למשך 10 שניות ומוסיפים מיקרוליטר אחד ל-65 מיקרוליטר. ג'ל מסונן לאחר מערבולת צנטריפוגת התערובת ב-13,000 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפעיל את הדגימות.
ראשית מקם שבב על תחנת ההתחלה. בהדגמה זו משתמשים ב-RNA 6,000 ננו שבבים. טען תשעה מיקרוליטר מתערובת צבע הג'ל בבאר המסומנת ב- G לבן על הרקע השחור.
כאשר קצה הפיפט ממוקם בתחתית הבאר. מקם את בוכנת המזרק במיליליטר אחד וסגור את תחנת ההתחלה. לחץ על הבוכנה כלפי מטה לאט אך בהתמדה עד שהיא מוחזקת על ידי הקליפ.
לאחר 30 שניות, שחרר את הקליפ ואפשר לבוכנה להתרומם מספר שניות. לאחר שהבוכנה נעצרת, משוך את הבוכנה בחזרה למצב מיליליטר אחד ופתח את תחנת ההתחלה. טען תשעה מיקרוליטרים של הג'ל למות.
מערבבים בכל אחת משתי הבארות. סימן G.לאחר מכן לטף חמישה מיקרוליטר של הסמן לבאר הסולם ולכל אחת מ-12 בארות הדגימה. העומס הבא, מיקרוליטר אחד של הסולם המפורק בבאר הסולם ומיקרוליטר אחד מכל דגימה מפוגלת לבארות הדגימה.
לבסוף, הוסף מיקרוליטר אחד של הסמן לכל דגימה שאינה בשימוש. ובכן לאחר הטעינה, מערבב את השבב למשך דקה אחת ב -2, 400 סל"ד. לאחר הפעלת תוכנת 2,100 המומחים, מקם את השבב וסגור את המכסה.
ודא שנבחרה היציאה הנכונה והפעל את הבדיקה תוך חמש דקות מטעינת הדגימות כדי למנוע אידוי. שיטות לביצוע הגברה ותיוג RNA ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. לאחר התווית, טהר את ה-CRNA כדי להסיר נוקלאוטידים לא משולבים באמצעות קוגנים r עמודות מיני קלות, ניתן לכמת את ה-CRNA המסומן עם פוטומטר ספקטרום NanoDrop 2000.
במצב מדידת מיקרו-מערך, רשום, ריכוז דגימה, תשואה ופעילות ספציפית. לצורך הכלאה של מיקרו-מערך, יש צורך להשיג תפוקה של לפחות 825 ננוגרם ופעילות ספציפית של לפחות שמונה פיקומולים למיקרוגרם לפחות שעתיים לפני הכלאת המיקרו-מערך. הפעל את תחנת ההיברידיזציה והגדר ל 65 מעלות צלזיוס.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכי Agilent ארבעה על 40 4K עם מערכת ההכלאה הזריזה של Roche וארבעה תאי מיקסר לאחר פיצול CRNA שבוצע כמתואר בפרוטוקול הכתוב, הכינו את תא ההכלאה. הנח שקופית מיקרו-מערך בצד הברקוד של כלי פירוק ההרכבה. ראשית פתח מערבל A Four וחשוף את הדבק המחזיק את המערך ואת כלי פירוק ההרכבה כדי למנוע כל תנועה.
הנח את מערבל A ארבע על המגלשה החל מהקצה הרחוק. ודא שהוא מיושר כהלכה לכלי והדבק את המיקסר לאורך המערך. החלק משוך מקצה המיקסר כדי להסיר את מכלול מערבל השקופיות.
בעזרת כלי הבלימה, לחץ לאורך כל אטם הדבק כדי לוודא שהוא מודבק היטב לשקופית. ניתן לראות בועות אוויר קטנות הכלואות בין הדבק למגלשה על הרקע הכהה. קח זמן נוסף כדי להסיר את הבועות הללו עם כלי הקריאה.
המערך מוכן כעת לטעינה. השתמש בביצועי תזוזה חיוביים כדי לטעון 100 מיקרוליטר מדגימת ההכלאה. דחוף את הקצה בחוזקה לתוך האשנב והוציא לאט ובצורה חלקה כדי שהאוויר לא יילכד באזור המערך.
כאשר הדגימה מכסה את כל המערך והנוזל מתחיל לצאת, פתח האוורור הסר במהירות את הפיפטה, שחרר רק את הבוכנה. לאחר שהקצה רחוק מהמגלשה, טפחו בעדינות את עודפי הנוזל בשתי היציאות, והקפידו לא להוציא דגימה מהתא עצמו. לאחר מכן מכסים את האשנבים במדבקות באמצעות פינצטה.
הנח את המגלשה על תחנת ההיברידיזציה ובדוק כי חורי שלפוחית השתן ממוקמים נכון מעל טבעות ה-O. זה יבטיח ערבוב נכון במהלך ההכלאה. סגור את מכסה השקופית ואת מכסה התחנה.
הגדר את התחנה למצב ערבוב B והכלאה של המערך ב-65 מעלות צלזיוס למשך 17 שעות. לאחר סיום צלחת זכוכית מילוי המסומנת A עם מאגר כביסה אחד, המנה צריכה להיות גדולה מספיק כדי להחזיק את כלי פירוק ההרכבה ולאפשר גם תמרון מסוים. כל השטיפות צריכות להיעשות בכלי זכוכית מכיוון שפלסטיק נוטה לדלוף תרכובות וכתוצאה מכך רקע גבוה במערך.
הכניסו מתלה שקופיות ומוט ערבוב לכלי מכתים. מסומן B, ממלאים את הכלי במאגר כביסה אחד המכסה את המדף ומניחים את המנה על צלחת ערבוב בטמפרטורת החדר. כמו כן, הוסיפו מוט ערבוב לכלי מכתים ריק שכותרתו C והניחו על צלחת ערבוב.
הסר את המערך מתחנת ההכלאה והנח אותו בכלי פירוק ההרכבה. טבלו את כל המכלול בצלחת תוך כדי החזקת כלי פירוק ההרכבה והמגלשה מצדדים מנוגדים ביד אחת. מקלפים בזהירות את מערבל A Four תוך הקפדה לא לשרוט את אזור המערך.
הנח במהירות את השקופית על המתלה וצלחת הצביעה B. יש למזער את החשיפה לאוויר מכיוון שצבע SCI five רגיש לאוזון. שוטפים את המחיקה במשך דקה תוך ערבוב במהירות בינונית. מלאו את צלחת הצביעה C במאגר כביסה חם מראש שניים.
מעבירים את השקופיות ושוטפים במשך דקה. לאחר הכביסה לאט מאוד, הסר את מתלה השקופיות מכלי C מכתים כדי למזער טיפות שנותרו מאחור על המגלשה. יבש את השקופית על ידי סיבוב במשך שתי דקות.
לאחר מכן הנח את השקופית לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר ומלא בסריקת גז ארגון מיד באמצעות סורק גנים 4, 000 B ממכשירים מולקולריים כדי למנוע אובדן אות המוצג. להלן דוגמאות לארבע דגימות רנ"א שבודדו ממוח אנושי. איכות דגימת רקמת הגידול הוערכה באמצעות ביואנלייזר 2,100 על שבב RNA 6,000.
ראשי חץ מוצקים ופתוחים מציינים את מיקומם של המינים 18 ו-28 S-R-R-N-A בהתאמה. מספר שלמות ה-RNA או RIN הוא מדידה כמותית של איכות RNA באיכות טובה סה"כ. דגימות RNA צריכות לייצר רק שתי פסגות עיקריות כאשר הן מופעלות בביו-אנלייזר לבקרת איכות המתאימה לשני מיני ה-RNA הריבוזומליים העיקריים.
חלק מהפירוק של ה-RNA יופיע כמריחה לפני שיא ה-RNA הריבוזומלי הראשון ושיא נמוך משמעותית עבור 28 S-R-R-N-A התדרדר קשות. RNA באיכות נמוכה יראה שיא רחב או סדרה של פסגות בזמני שימור נמוכים. בעוד ששתי פסגות ה-RNA הריבוזומלי יהיו בעוצמה נמוכה מאוד או לא ניתנות לזיהוי כלל.
מערכים באיכות טובה אמורים לייצר אות גבוה בערכי PMT נמוכים יחסית. רוב התמלילים צפויים להיות נוכחים ברמות דומות במדגם הניסוי והייחוס. שינויים נרחבים מסיביים בביטוי הגנים כנראה חסרי כל משמעות ביולוגית.
לכן, רוב המערך צריך להיראות צהוב ולא ירוק או אדום. אותות באיכות טובה צריכים להיות גם בטווח דינמי כך שהיסטוגרמות האות חופפות לחלוטין כפי שניתן לראות בתרשים הפיזור של תמונת המערך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסוי מיקרו-מערך באמצעות מנגנון הכלאה אוטומטי.
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את השימוש במערכי DNA לפרופיל ביטוי במערכת העצבים. הוא מפרט את התהליכים של בקרת איכות RNA, תיוג דגימות, ואת ההכלאה והסריקה של מערכים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנומיקה
- טכנולוגיית מערכים
רקע
- מערכים הם כלים רבי עוצמה לניתוח ביטוי גנים.
- בקרת איכות RNA חיונית לתוצאות אמינות.
- הדמיית פלואורסצנטית משמשת להערכת ביטוי שונה של תעתיק RNA.
- ציוד מיוחד נדרש להכלאה ולסריקה.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לביצוע ניסויי מערכים.
- להדגיש את חשיבות איכות ה-RNA בניתוח מערכים.
- להדגים את תהליך ההכלאה באמצעות ציוד אוטומטי.
שיטות ששימשו
- הערכת איכות RNA באמצעות ביו-אנליזר.
- פרוטוקולים לתיוג והגברת דגימות.
- הכלאה של דגימות RNA למערכים.
- סריקה וניתוח של תמונות פלואורסצנטיות דו-צבעוניות.
תוצאות עיקריות
- הכלאה וסריקה מוצלחות של מערכים הושגו.
- התוצאות הצביעו על ביטוי שונה של תעתיק RNA.
- אמצעי בקרת איכות הבטיחו רכישת נתונים אמינה.
- הדגמות ויזואליות סייעו בהבנת נהלים מורכבים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק מדריך מקיף לניסויי מערכי RNA.
- בקרת איכות חיונית לפרופיל ביטוי גנים מדויק.
- מערכות אוטומטיות משפרות את יעילות ניתוח המערכים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
DNA microarray expression profiling enables biopharma R&D teams to interrogate transcriptional responses in disease-relevant neural systems, supporting target validation and mechanistic de-risking. Quantitative dual-color hybridization provides predictive confidence in gene expression changes, informing go/no-go decisions in early discovery. This workflow positions RNA quality control and hybridization as foundational steps for scalable, reproducible screening assays in neuroscience-focused drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional pathways in brain tumor tissue to clarify disease mechanisms and prioritize targets.
- Operational Value: RNA integrity number (RIN) from Bioanalyzer QC ensures sample suitability, reducing false negatives in downstream profiling.
- Predictive Value: Dual-color Cy3/Cy5 ratio measurements detect small expression changes, increasing confidence in target engagement signals.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Labeled cRNA yield (≥825 ng) and specific activity (≥8 pmol/µg) thresholds ensure assay readiness for hybridization.
- Operational Value: Automated mixer apparatus and standardized wash buffers improve reproducibility across runs.
- Scalability: Agilent 4x44 K arrays allow parallel interrogation of thousands of genes per sample, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Differential expression profiling in human brain tumor tissue aligns with preclinical models of glioma.
- Mechanistic De-risking: Identifies co-regulated gene networks that may indicate off-target effects or pathway compensation.
- Biomarker Alignment: Stable reference sample (Cy5) enables intra-experiment normalization, supporting longitudinal biomarker tracking.
Pipeline & Workflow Integration
The microarray workflow fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, where transcriptional profiling informs target selectivity and pathway modulation.
- Discovery Biology: Bioanalyzer QC and RIN measurement support hypothesis testing by ensuring RNA quality before labeling.
- Screening: Hybridization to Agilent arrays with dual-color detection enables quantitative comparison of experimental vs. reference samples.
- Analytics: Signal histograms and scatterplots from GenePix 4000B scanner provide overlapping dynamic ranges for accurate fold-change calculation.
- Translational Research: Differential expression in tumor tissue supports preclinical validation of target relevance in neoplastic pathways.
- Enterprise Reuse: Standardized QC, labeling, and hybridization protocols allow reuse across CNS disease models (e.g., Alzheimer’s, Parkinson’s).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reproducible, quantitative expression profiling.
- Operational Value: Standardized RNA QC (RIN), labeling yield thresholds, and hybridization conditions reduce variability.
- Strategic Value: Enables early de-risking of targets by revealing transcriptional consequences of modulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets with coherent pathway-level effects.
Implementation Considerations
- Expertise in RNA handling, labeling, and microarray hybridization is required.
- Instrumentation includes Agilent 2100 Bioanalyzer, NanoDrop 2000, hybridization station, and GenePix 4000B scanner.
- Cross-team standardization requires adherence to RNA yield (≥825 ng), specific activity (≥8 pmol/µg), and wash buffer protocols.
- Adaptation to other model systems necessitates re-validation of RNA integrity and labeling efficiency.
- Ozone sensitivity of Cy5 dye requires minimized air exposure during washing and scanning.
