בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד קרדיומיוציטים חיים מדגימות של חדרים מהלב האנושי במצב פתולוגי ולאפיין את השינויים התפקודיים שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף מהיר וקיצוץ של דגימות טריות מהחדרים בתמיסת קרדיופלגיה קרה בקרח, וזאת כדי למנוע דגרדציה מופרזת של הרקמה ונזק לתאים. השלב השני הוא ביצוע עיכול מדורג של נתחי השריר הלבבי באמצעות מכשיר עיכול מותאם אישית ותמיסות אנזימטיות.

בשישה מחזורים, התאים המכילים באפר נאספים למבחנה בכל מחזור ומדוללים עם תמיסה לשימור תאים. השלב הסופי הוא ריסוספנסיה של התאים המכילים את שש המבחנות בנפח נמוך יותר של תמיסה פיזיולוגית סטנדרטית עם ריכוזי סידן נורמליים, וזאת על מנת לבצע את האפיון התפקודי. לבסוף, נעשה שימוש בהקלטת patch clamp של פוטנציאלי פעולה ובערכה סימולטנית של סידן בין-תאי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים כדי להראות את השינויים בפוטנציאל הפעולה, במשך הפוטנציאל ובמחזור הסידן התאי בקרדיומיוציטים של מטופלים עם קרדיומיופתיה היפרטרופית.

היתרון המרכזי של שיטת DYS הייחודית על פני שיטה של 16, כמו שיטת ה-chunk digestion הסטנדרטית, הוא שבשילוב עם תמיסת אנזימים, אנו משתמשים במכשיר עיכול מותאם אישית, המאפשר דיסוציאציה משותפת של תאים שונים הודות לגרידות הסיליקון שלו. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הקרדיולוגיה, כגון כיצד השכתוב המולקולרי והמבני הידוע הקשור למחלות לב בא לידי ביטוי בשינויים של קרדיומיוציטים בודדים שניתן לנתח באמצעות השיטה שלנו ולהשפיע עליהם באמצעות תרופות ספציפיות. לפיכך, השלכותיה של טכניקה זו משתרעות עד לטיפול במחלות לב גנטיות, כגון קרדיומיופתיה היפרטרופית.

למעשה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון גישות נוירופתיות חדשניות בתאי שריר לב (cardiomyocytes) פרוזדוריים מחולים עם מחלות לב היפרטרופיות או איסכמיות שעברו ניתוח לב. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בעת השוואת האנלוגיה בין דגימות עורקים אנושיים לבין ביופסיות של פרוזדור שהושגו במהלך ניתוח לב. התחילו את הפרוצדורה על ידי מזיגת 40 milliliters של תמיסת Cardioplegic לשפופרת של 50 milliliter ואחסנו אותה בקרח לצורך הובלת הדגימה מחדר הניתוח למעבדת בידוד התאים; העבירו במהירות את הדגימה לאזור המעבדה והתחילו בעיבוד הדגימה תוך 10 דקות מהוצאתה.

דגימה接 kolejive של שריר הלב הפרוקטוריאלי מחדר הניתוח מיד לאחר הכריתה. יש לשטוף אותה בתמיסת CP קרה מאוד (בקרח) ולאחסנה במבחנה תוך שמירה על הדגימה בבופר CP קר מאוד (בקרח). לאחר מכן, יש להסיר בזהירות את השכבה הפיברוטית האנדוקרדיאלית באמצעות מספריים עדינים.

חתוך את רקמת השריר הלבבי לחתיכות קטנות באורך של שני עד שלושה מילימטרים, כאשר הכמות הכוללת של מיוקרדיום החדר היא בין 100 milligrams לבין גרם אחד לכל בידוד. לאחר העברת החתיכות לתא הגרידה של מכשיר העיכול, החלף את תמיסת ה-CP בתא בתמיסת דיסוציאציה קרה נטולת סידן. לאחר מכן, הנח את מכשיר העיכול באמבט תרמוסטטי.

כוון את האמבט ל-37.5 °C והפעל אותו. לאחר מכן, הפעל את המנוע של מכשיר העיכול וכוון את מהירות הסיבוב לסיבוב אחד לשנייה. בצע שלושה מחזורי שטיפה עם DB והחלף את התמיסה בתא ב-DB נקי בטמפרטורה של 37 °C הרווי בחמצן בכל שמונה דקות.

לאחר מכן, הכין את בופר האנזימים הראשון על ידי הוספת 250 units per milliliter של collagenase type five ו-4 units per milliliter של protease type 24 לתמיסת ה-DB. לאחר מכן, הכין את בופר האנזימים השני על ידי הוספת 250 units per milliliter של collagenase.

העבירו חמישה לפתרון ה-DB oxygenate EB one, וחממו אותו ל-37 °C. לאחר מכן, בצעו שני מחזורי עיכול של 12 דקות במכשיר העיכול המסתובב עם 3 mL של EB one מחמצן ב-100% ב-37 °C. הסירו את הפתרון באמצעות שאיבה בפיפטה והשליכו אותו לאחר כל מחזור.

בשלב הבא, הכינו שש מבחנות של 15 מיליליטר לאיסוף תאים ו-80 מיליליטר של תמיסת craft brew בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להשקיה. חמצנו את EB two וחממו אותה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצעו מחזור עיכול ראשון של 15 דקות עם 3 מיליליטר של EB two מחומצן ב-100% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עם סיום מחזור העיכול, אספו את התמיסה המכילה את המיוציטים הראשונים למבחנה של 15 מיליליטר ודללו את תרחיף התאים עם 12 מיליליטר של תמיסת KB קרה.

אחסן את המבחנה במצב שכיבה בטמפרטורת החדר, בצע חמישה מחזורי עיכול נוספים של 12 דקות עם 3 mL של EB ב-37 °C, ואסוף את התמיסה המכילה את המיוציטים מכל מחזור למבחנה קונית של 15 mL. זכור לדלל בכל מחזור את 3 mL של התמיסה שנאספה עם 12 mL של תמיסת KB. בסיום, אחסן את ששת המבחנות המכילות תאים בטמפרטורת החדר.

בשלב זה, הוסיפו אלבמין סרום בקר (bovine serum albumin) בריכוז של 1 mg/mL ל-20 mL של באפר טירו (tyro buffer) נטול סידן. לאחר מכן סננו את התמיסה, ואז סובבו במערך צנטריפוגה את שש המבחנות הקוניות המכילות מיוציטים במהירות של 100 ×g למשך חמש דקות. כדי לגרום למיוציטים לשקוע, הסירו את supernatant והחזירו את התאים בכל מבחנה לריCוף בנפח משתנה של TB המכיל BSA בטמפרטורת החדר.

העלה בהדרגה את ריכוז הסידן בתא המכיל את הבאפר על ידי הוספה של כמויות קטנות של תמיסת סידן כלוריד בריכוז 100 millimolar per liter בשלבים הראשון והשני. ריכוז הסידן מועלה ל-50 micro molars per liter ו-100 micro molars per liter בהתאמה. שלבי הוספת הסידן הבאים מבוצעים מדי חמש דקות, והריכוז מועלה ב-100 micromolar per liter בכל שלב, עד לריכוז סופי של 0.9 millimolar per liter.

כדי להעריך את תנובת הליך הבידוד, העבר 0.5 milliliters של תמיסה המכילה מיוציטים לתא בעל תחתית זכוכית של מיקרוסקופ. בחן 15 שדות ראייה במיקרוסקופ בהגדלה של 10 x וחשב את אחוז המיוציטים הבריאים, כגון תאים בצורת מוט עם פסיים ברורים וללא הכלות משמעותיות. התנובות הצפויות צריכות להיות סביב 20% כדי להדגים הערכה תפקודית של קרדיומיוציטים אנושיים, כולל רישומים סימולטניים של פוטנציאלי פעולה וזרימות סידן תוך-תאיות.

ראשית, הכין את תמיסת הפפיטה לניסויי patch clamp בתצורת perforated patch. לאחר מכן, הוסף 1.8 millimolar של calcium chloride ל-tb נטול סידן. השתמש בתמיסה לביצוע superfusion של cardiomyocytes במהלך ניסויי patch clamp עם פלואורסצנציה.

בשלב הבא, העבירו 1 ml של תרחיף תאים לשפופרת של 1.5 ml והוסיפו 10 µM flu fort ו-10 µL של power load. דגמו את התערובת להדגרה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במצב אופקי. לאחר מכן, הניחו את השפופרת במצב אנכי והמתינו חמש דקות לשקיעת התאים.

לאחר מכן, שאבו את העלייה (supernatant) והשביו מחדש את משקע התאים ב-tb המכיל סידן. העבירו 25 מיליליטר של ת сусפנזיית תאים לתא הקלטה קטן המותקן על מיקרוסקופ ומבוקר טמפרטורה. בצעו פרפוזיה באמצעות כבידה באמצעות מערכת מיקרו-פרפוזיה מחוממת בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה ב-37 °C.

באמצעות מכשיר למשיכת פפטים (micro pipette puller), הכין פפטים ל-patch clamp בעלי קוטר קצה של 3 עד 5 מיקרומטרים והתנגדות של 3 עד 4.5 מגה-אוהם כאשר הם מלאים ב-ps. לאחר מכן, הוסף amphotericin B ל-PS בריכוז של 250 מיקרוגרם למילליליטר והשתמש בתמיסה למילוי האלקטרודות, ולאחר מכן התקן את האלקטרודה על תושבת הפפטה. לאחר מכן, בחר תא בעל צורה של Ron עם פסים ברורים וללא הכללות (inclusions).

צרו giga seal והמתינו חמש עד 10 דקות עד שהתנגדות הגישה תרד מתחת ל-20 ohm. לאחר מכן, עוררו פוטנציאלי פעולה במצב current clamp באמצעות פולסים קצרים בתדרים שונים של גרייה. במהלך שלב ההקלטה, הדליקו תאורה של שדה בהיר באורך גל של 492 nanometers וגלו פלואורסצנציה של Fluor fort באורך גל של 505 עד 520 nanometers.

לאחר מכן, רכשו את אותות הפלואורסצנציה ופוטנציאל הממברנה. איור זה מציג את השינויים בפוטנציאלי הפעולה בתאי שריר לב (cardiomyocytes) פרוזדוריים מדגימות HCM. להלן פוטנציאלי פעולה מייצגים שהסופרו זה על זה, אשר עוררו בתדרי 0.2 hertz, 0.5 hertz ו-one hertz, מתא שריר לב של ביקורת ומתא שריר לב של HCM.

פוטנציאלי הפעולה החופפים בתדר של 0.5 hertz ממיוציט ביקורת. מוצגים המצבים בהיעדר ובנוכחות של 10 to seven molar isoproterenol, וכאן מוצג עקבה מייצגת של פוטנציאל הממברנה של קרדיומיוציט מחולה עם HCM, אשר הראה מספר דפולריזציות ספונטניות (דפולריזציות מוקדמות לאחר דפולריזציה). האיור מראה את השינויים בטרנזיאנט הסידן בקרדיומיוציטים ונטריקולריים מדגימות HCM.

להלן נתוני ייצוג של חולפי סידן (calcium transients) חופפים שהופעלו במהלך גרייה בתדר של 0.2 hertz באמצעות פיפט הפאץ' (patch pipette) במיוציט בקרה ובמיוציט של HCM. מוצגת הקינטיקה של חולפי הסידן בקרדיומיוציטים של HCM ובביקורת בנקודות זמן שונות, ולהלן עקבות (traces) ארוכים מייצגים המראים את רמות הסידן התוך-תאי במהלך גרייה בשלושה תדרים שונים, אשר מדגישים את עליית הסידן הדיאסטולי בקצבי קוצביות גבוהים במיוציט של HCM. דמות זו מציגה יישומים ניסויים נוספים באמצעות מיוציטים ונטריקולריים אנושיים.

העקבות הממוצעים המעלים זה על זה המייצגים את זרם הסידן מסוג L שנרשם במתחי ממברנה שונים מוצגים משמאל, וצפיפות שיא ממוצעת של זרם סידן מסוג L מ-18 תאים שבודדו מדגימות HCM במתחי ממברנה שונים מוצגת מימין; כאן מוצג עקב הסידן התו-תאי שנרשם ממיוציט ונטריקולרי במהלך גירוי שדה חשמלי בתדר של one hertz. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להתחיל את הפרוצדורה זמן קצר לאחר איסוף הדגימה מחדר הניתוח כדי להבטיח את החיוניות. לאחר ביצוע הליך זה לבידוד קרדיומיוציטים ונטריקולריים אנושיים, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה או אימונוכימיה, ודבר זה יהיה מכריע למתן מענה לשאלות יסודיות, כגון, למשל, כיצד משתנה הלוקליזציה התת-תאית של מבני ממברנה ויחידות שחרור סידן במחלות לב לאחר פיתוחן.

טכניקה זו סללה את הדרך בקרדיולוגיה תאית לחקר חריגות תפקודיות בתאי שריר לב פרוזדוריים (ventricular cardiomyocytes) ולבדיקת התועלת הפוטנציאלית של אפשרויות טיפוליות חדשניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידודם של תאי שריר לב בודדים ובריאים מדגימות אנושיות, וכיצד לאפיין את תפקוד התא בתנאים שונים.