בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד קרדיומיוציטים ברי קיימא מדגימות חדריות אנושיות ולאפיין את השינויים התפקודיים שלהם. זה מושג על ידי איסוף וטחינה מהירה של דגימות חדרים טריות בתמיסה קרדיופלגית קרה כקרח על מנת למנוע פירוק מוגזם של רקמות ונזק לתאים. השלב השני הוא ביצוע עיכול מדורג של נתחי שריר הלב באמצעות מכשיר עיכול מותאם אישית ופתרונות אנזימטיים.

בשישה מחזורים, התא המכיל מאגר נאסף בצינור בכל מחזור ומדולל בתמיסה לשימור תאים. השלב האחרון הוא השעיית התאים הכלולים בששת הצינורות בנפח נמוך יותר של תמיסה פיזיולוגית סטנדרטית עם ריכוזי סידן תקינים על מנת לבצע את האפיון התפקודי. בסופו של דבר, הקלטת מהדק תיקון של פוטנציאל הפעולה והערכה בו זמנית של סידן בין-תאי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים משמשת להצגת השינויים בפעולה, משך הפוטנציאל ומחזור הסידן התוך תאי בקרדיומיוציטים מחולים עם קרדיומיופתיה היפרטרופית.

היתרון העיקרי של DYS ייחודי על פני שיטת 16, כמו שיטת דכדוך הנתחים הסטנדרטית הוא שבאסוציאציה עם תמיסת אנזים, אנו משתמשים במכשיר עיכול בהתאמה אישית, המאפשר שיוך משותף של ציטים משתנים הודות לשריטות הסיליקון שלו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקרדיולוגיה, כגון כיצד השיפוץ המולקולרי והמבני הידוע הקשור למחלות לב משתקף לשינוי של קרדיומיוציטים בודדים שניתן לנתח בשיטה שלנו ולמקד אותם על ידי תרופות ספציפיות. אז ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות לב גנטיות כמו קרדיומיופתיה היפרטרופית.

למעשה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון גישות נוירופתיות חדשות על קרדיומיוציטים חדריים מחולים עם מחלות לב היפרטרופיות או איסכמיות שעברו ניתוח לב. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר השווינו את האנלוגיה בין דגימות עורקים אנושיים לביופסיות חדריות שהתקבלו במהלך ניתוח לב. התחל הליך זה על ידי יציקת 40 מיליליטר של תמיסה קרדיופלגית בצינור של 50 מיליליטר ואחסן אותה בקרח להובלת דגימה מחדר הניתוח למעבדת בידוד התאים, העביר במהירות את הדגימה לאזור המעבדה והתחל בעיבוד הדגימה תוך 10 דקות מכריתת הדגימה.

דגימת שריר הלב הקולקטיבית הבאה מחדר הניתוח מיד לאחר הכריתה. שטפו אותו בתמיסת CP קרה כקרח ואחסנו אותו בצינור תוך שמירה על הדגימה במאגר CP קר כקרח. הסר בזהירות את השכבה הפיברוטית האנדוקרדיאלית בעזרת מספריים עדינים לאחר מכן.

חותכים את רקמת שריר הלב לחתיכות קטנות באורך שניים עד שלושה מילימטרים, כאשר הכמות הכוללת של שריר הלב החדר נע בין 100 מיליגרם לגרם אחד לכל בידוד. לאחר העברת הנתחים לתא הגירוד של מכשיר העיכול, החלף את מאגר ה-CP בתא עם מאגר דיסוציאציה קר ללא סידן. לאחר מכן הניחו את מכשיר העיכול באמבטיה תרמוסטטית.

כוונו את האמבטיה ל-37.5 מעלות צלזיוס והפעילו אותה. לאחר מכן, הפעל את המנוע של מכשיר העיכול והגדר את מהירות הסיבוב לסיבוב אחד לשנייה. בצע שלושה מחזורי כביסה עם DB והחלף את התמיסה בתא עם DB נקי רווי חמצן של 37 מעלות צלזיוס כל שמונה דקות.

לאחר מכן, הכינו את מאגר האנזים הראשון על ידי הוספת 250 יחידות למיליליטר של קולגנאז מסוג חמש וארבע יחידות למיליליטר פרוטאז. הקלד 24 לפתרון מסד הנתונים. לאחר מכן הכינו את מאגר האנזים השני על ידי הוספת 250 יחידות למיליליטר קולגנאז.

הקלד חמש לתמיסת DB מחמצן EB אחד, ומחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בצע שני מחזורי עיכול של 12 דקות במכשיר העיכול המסתובב עם שלושה מיליליטר של 100% EB מחומצן, אחד ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את התמיסה על ידי שאיבת פיפטה והשליך אותה לאחר כל מחזור.

לאחר מכן, הכינו שישה צינורות של 15 מיליליטר לאיסוף תאים ו-80 מיליליטר של תמיסת חליטה מלאכה של ארבע מעלות צלזיוס להתחמקות מהבלמים, מחמצנים את EB 2 ועובדים עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע מחזור עיכול ראשון של 15 דקות עם שלושה מיליליטר של 100% EB מחומצן שניים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מחזור העיכול, אספו את התמיסה המכילה את המיוציטים הקשורים הראשונים בצינור של 15 מיליליטר ודללו את תרחיף התאים ב-12 מיליליטר תמיסת KB קרה.

אחסן את הצינור שטוח בטמפרטורת החדר, בצע חמישה מחזורי עיכול נוספים של 12 דקות עם שלושה מיליליטר EB שניים ב-37 מעלות צלזיוס ואסוף את המאגר המכיל מיוציטים בכל מחזור בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. זכור גם לדלל את המאגר שנאסף בשלושה מיליליטר עם 12 מיליליטר של תמיסת KB בכל מחזור. בסוף, אחסן את ששת התאים המכילים צינורות בטמפרטורת החדר.

בשלב זה, הוסף מיליגרם אחד לכל אלבומין בסרום בקר ל-20 מיליליטר של מאגר טירו נטול סידן. לאחר מכן מסננים את התמיסה הבאה צנטריפוגה את ששת הצינורות החרוטיים המכילים 100 גבינה למשך חמש דקות. כדי לאלץ את המיוציטים להתייצב, הסירו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בכל צינור עם כמות משתנה של BSA שמכיל שחפת בטמפרטורת החדר.

הגדל בהדרגה את ריכוז הסידן בתא המכיל בופר על ידי הוספת OTTs קטנים של 100 מילימולר לליטר תמיסת סידן כלוריד בשלב הראשון והשני. ריכוז הסידן עולה ל-50 מיקרו טוחנות לליטר ו-100 מיקרו טוחנות לליטר בהתאמה. שלבי הוספת הסידן הבאים מבוצעים כל חמש דקות, והריכוז עולה ב-100 מיקרו-מולרי לליטר בכל שלב לריכוז סופי של 0.9 מילי-מולרי לליטר.

כדי להעריך את התפוקה של הליך הבידוד, העבירו 0.5 מיליליטר של תמיסה המכילה מיוציטים לתא תחתון הזכוכית של מיקרוסקופ. הערך 15 שדות מיקרוסקופ בהגדלה אובייקטיבית של פי 10 וחשב את אחוז המיוציטים הבריאים כגון התאים בצורת מוט עם פסים ברורים וללא תכלילים משמעותיים. התשואות הצפויות צריכות להיות בסביבות 20% כדי להדגים הערכה תפקודית של קרדיומיוציטים אנושיים, כולל הקלטות בו זמנית של פוטנציאל פעולה ושטפי סידן תוך תאיים.

ראשית, הכינו את תמיסת הפיפטה לניסויי מהדק תיקון בתצורת תיקון מחוררת. לאחר מכן הוסף 1.8 מילימולר של סידן כלורי לשחפת נטולת סידן. השתמש בתמיסה לאיחוי על של קרדיומיוציטים במהלך ניסויי פלואורסצנטיות של מהדק תיקון.

לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תרחיף תאים לצינור של 1.5 מיליליטר והוסיפו 10 מיקרומולר לליטר פורט שפעת ו-10 מיקרוליטר עומס כוח. תרכיז מודגר למשך 30 דקות בהגדרת טמפרטורת החדר במצב אופקי. לאחר מכן, הגדר את הצינור במצב אנכי והשאיר את התאים להתייצב למשך חמש דקות.

לאחר מכן פיפטה החוצה את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בסידן המכיל שחפת. נקודת העברה 25 מיליליטר של מתלה תאים לתא הקלטה קטן המותקן במיקרוסקופ מבוקר טמפרטורה. סופר התמזג על ידי כוח הכבידה עם מערכת מיקרו פואר מחוממת בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה ב-37 מעלות צלזיוס.

בעזרת חולץ מיקרו פיפטה, הכינו פיפטות מהדק תיקון בקוטר קצה של שלושה עד חמישה מיקרומטר והתנגדות של שלושה עד 4.5 מגה אוהם כאשר הם מלאים ב- ps. לאחר מכן, הוסף אמפוטריצין B ל-PS ב-250 מיקרוגרם למיליליטר והשתמש בו למילוי האלקטרודות, ולאחר מכן הרכיב את האלקטרודה על מחזיק הפיפטה. לאחר מכן, בחר את התא בצורת רון עם פסים ברורים וללא תכלילים.

צרו את אטם הג'יגה והמתינו חמש עד 10 דקות עד שהתנגדות הגישה יורדת מתחת ל-20 אוהם. לאחר מכן לעורר פוטנציאל פעולה במצב מהדק זרם באמצעות פולסים קצרים בתדרים שונים של גירוי. במהלך שלב ההקלטה, הפעל תאורת שדה בהיר ב-492 ננומטר וזהה פלואורסצנטיות של פלואור-פורט ב-505 עד 520 ננומטר.

לאחר מכן רכוש את אותות הקרינה והממברנה הפוטנציאליים. איור זה מציג את השינויים בפוטנציאל הפעולה בקרדיומיוציטים חדריים מדגימות HCM. להלן פוטנציאלי הפעולה המייצגים המופקים ב-0.2 הרץ, 0.5 הרץ והרץ אחד מיוציט בקרה ומיוציט HCM.

פוטנציאל הפעולה המונח על גבי 0.5 הרץ מיוציט בקרה. בהיעדר ונוכחות של 10 עד שבעה איזופרוטרנול מולארי מוצגים, והנה העקבות המייצגים של פוטנציאל הממברנה של קרדיומיוציט מחולה HCM, שהציג מספר דפולריזציות ספונטניות מוקדם לאחר דפולריזציה. האיור מציג את השינויים של סידן חולף בקרדיומיוציטים חדריים מדגימות HCM.

להלן הסידן החולף המייצג שנוצר במהלך גירוי ב-0.2 הרץ דרך פיפטת התיקון במיוציטים בקרה ותא HCM. הקינטיקה של מעברי סידן ב-HCM וקרדיומיוציטים בקרה בזמנים שונים מוצגת, והנה העקבות הארוכים המייצגים המראים סידן תוך תאי במהלך גירוי בשלושה תדרים שונים, מה שמדגיש את הסידן הדיאסטולי המוגבר בשיעורי קצב גבוהים במיוציטים HCM. איור זה מציג את היישומים הניסויים הנוספים המשתמשים במיוציטים חדריים אנושיים.

העקבות המייצגים המראים זרם סידן מסוג L שנרשם במתחי ממברנה שונים מוצגים משמאל, וצפיפות השיא הממוצעת של זרם הסידן מסוג L מ-18 תאים שבודדו מדגימות HCM במתחי ממברנה שונים מוצגת מימין ומוצגת כאן עקבות הסידן התוך-תאיים שנרשמו מיוציט חדר במהלך גירוי שדה חשמלי בהרץ אחד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתחיל את ההליך זמן קצר לאחר איסוף הדגימה מחדר הניתוח על מנת להבטיח ses בעקבות הליך זה לבודד קרדיומיוציטים חדריים אנושיים. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית של אורח חיים או אימונוכימיה, וזה יהיה חיוני כדי לענות על שאלות בסיסיות כגון, למשל, כיצד לוקליזציה תת-תאית של מבני ממברנה ויחידות שחרור סידן עוברת במחלות לב לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך בקרדיולוגיה התאית לחקור את החריגות התפקודיות בקרדיומיוציטים חדריים ולבחון את התועלת הפוטנציאלית של אפשרויות טיפוליות חדשות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד קרדיומיוציטים בודדים ברי קיימא מדגימות אנושיות וכיצד לאפיין את תפקוד התא בתנאים שונים.