חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחלץ חלבון מרקמת מוח אנושית ועכברית לניתוח פרוטאומיקה. זה מושג על ידי שימוש במאגר ליזה נפוץ כדי להשיג את אותו מיצוי חלבון המותאם לגישות אלקטרופורזה דו-ממדיות. הבא הפרש פלואורסצנטי דו-ממדי אלקטרופורזה של ג'ל משמש להפרדת חלבונים לזיהוי ספקטרומטריית מסה.

לאחר מכן מתבצעת אלקטרופורזה מיניאטורית של ג'ל דו-ממדי עם ספיגה חיסונית לזיהוי שינויים לאחר תרגום. התוצאות יכולות להראות ביטוי חלבון גלובלי. תרגום מארח משנה את כל הרצועות והתוצרים הקטליטיים בהתבסס על ההבדלים בנקודה האיזואלקטרית ובמשקל המולקולרי.

השילוב של מקף דו-ממדי ומונולו דו-ממדי יכול לעזור לנו לענות על שאלת מפתח בתחום הנוירו-פרוטאומיקה על ידי מתן מידע בו-זמנית על שינויי ביטוי. שינוי דואר וקטבוליזם במוצרים התחל בקציר והומוגניזציה של רקמת המוח. הכן את הרקמה במשקל של 10% לנפח במאגר מיצוי לרקמת מוח אנושית.

עם זאת, הומוגניזציה של הרקמה באמצעות פיפטר זכוכית, השתמש בהומוגנייזר טפלון לרקמת מכרסמים כדי לפרק את כל אחד מההומוגנים. סוניקציה ב-60 הרץ באמצעות פולסים של 30 חצי שנייה. לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד באמצעות BSA כסטנדרט.

כעת אספו את הפתרונות למשקעי מתנול כלורופורם בדלי קרח. תכנן לאסוף כ-125 מיקרוגרם עבור רצועות IPG של 11 סנטימטר או כ-1.25 מיליגרם עבור רצועות IPG של 18 סנטימטר. ברגע שהתמיסות מגיעות לארבע מעלות צלזיוס, בצע את המשקעים לחלוטין על קרח.

ראשית, הוסף שלושה נפחים של מתנול, ואז אחד של כלורופורם. לנער את התערובת הזו. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של מים קרים.

מערבולת, תערובת זו למשך דקה אחת צנטריפוגה את צינור הדגימה ב 12, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף שלושה נפחים של מערבולת מתנול וסובב את החלבונים באותו אופן.

יבש את כדור החלבון שנאסף תחת גז חנקן לפני DIGE דו-ממדי. Re השעו את החלבון במאגר דו-ממדי ב-2.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן סוניקציה של הדגימות כפי שנעשה קודם לכן עד לשימוש בהן.

אחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני תחילת שלב זה ולאחר משקעי חלבון. יש צורך לקבוע את ריכוז החלבון פעם נוספת על ידי מבחן ברדפורד. ביצוע אותו הליך שהוצג קודם לכן לפני תיוג צבע פסיכי.

איכות דגימת החלבון מאומתת על ידי דף SDS למטרה זו. מדללים 15 מיקרוגרם חלבון ב-LDS ואותו ל-37 מעלות צלזיוס באמבט חום או בלוק. לאחר מכן הפעל אותם על ג'ל פולי אקרילאמיד, הכתים את הג'ל בתמיסה כחולה קומאסי למשך שעה לפחות.

לאחר מכן עצרו את הג'ל למשך הלילה בתמיסת 7% חומצה אצטית, 10% אתנול. לאחר קביעת איכות דגימת החלבון, למחרת מתחיל הליך תיוג ה-SD. ראשית יש למדוד את ה-pH של הליזאט, שאמור להיות בסיסי עד ניטרלי.

ה-pH האופטימלי הוא 8.6 לתגובות הבאות. לאחר מכן, הגדר את תגובות צימוד הצבע עבור כל דגימת חלבון. מערבבים 50 מיקרוגרם עם 400 פיקומולים של צבע S3 ו-50 מיקרוגרם עם 400 פיקומולים של צבע S five.

עשה זאת ב-quadruplex בסך הכל שמונה תגובות צימוד D לכל דגימה. עבור כל דגימה שנבדקה, הכינו קבוצה משלימה של תגובות צימוד DI באמצעות חלבון מהביקורת כגון ממוח חולה. לאחר מכן, עבור כל זוג תגובות, הגדר תגובת בקרה פנימית עם 400 פיקומולים של CY שניים וייצוג זוגי של כל החלבונים בסך הכל 250 מיקרוגרם.

תיוג SAI מושג על ידי דגירה של כל תערובות התגובה בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה. לאחר הדגירה, שלב את כל הקבוצות של שלוש תגובות ציאן שונות לנפחים של 150 מיקרוליטר לכל קבוצת תגובות ב-200 מיקרוליטר של מאגר דו-ממדי. לאחר מכן המשך בשלבי האלקטרופורזה הדו-ממדית.

התחל בהכנת תמיסות חלבון ללא תווית לג'ל ההכנה שממנו ייכרתו כתמי חלבון עבור כל דגימה ועבור הבקרה החיובית. הכניסו 300 עד 350 מיקרוגרם של חלבון ללא תווית למאגר דו-ממדי ואפשרו להם להתייבש במגע עם רצועת ה-IPG. לאחר מכן, רצועות ה-IPG מעבירות את החלבון המסומן ואת החלבון הלא מסומן להתייבשות.

ובכן, כסו כל באר ברצועת תגובה IPG. המשיכו עם שכבת שמן מינרלי ואפשרו לרצועות להתייבש באופן פסיבי עם תמיסת החלבון למשך הלילה בטמפרטורה של לא יותר מ-25 מעלות צלזיוס. למחרת, בצע מיקוד איזואלקטרי של רצועות ה- IPG.

לאחר מכן הסר את השמן ואחסן את רצועות ה-IPG במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לאזן את רצועות ה-IPG. טבלו אותם במאגר שיווי משקל למשך 15 דקות. לאחר מכן העבירו את הרצועות ל-4.7% IDO אצטמיד במאגר שיווי משקל, חסר DTT בזמן רחיצת הרצועות.

השתמש במערכת ג'ל דו-ממדית גדולה כדי לשפוך ארבעה ג'לים של 12% SDS לדגימה בלוחות זכוכית פלואורסצנטיים נמוכים עבור החלבונים המסומנים כמו כן, שפכו ג'ל אחד של 12% SDS בלוחות זכוכית סטנדרטיים בעובי 1.5 מילימטר עבור כל אחד מהחלבונים הלא מסומנים. אלה הם הג'לים המכינים אותם.

כאשר הג'לים מתקררים, העבירו את הרצועות לחלק העליון של הג'לים וכסו את הרצועות ב-0.5%Aros לאחר שהתקררו, הפעילו את הג'לים ב-2.5 וואט בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה ונתחו אותם למחרת. תגובות דו-ממדיות רבות יכולות להתבצע עם דגימות חלבון המשמשות לג'לים המכינים מדוד פחות מ-100 מיקרוגרם של דגימה ל-200 מיקרוליטר של מאגר דו-ממדי.

לאחר מכן מערבבים את תערובות הדגימה במרץ ונותנים להן סיבוב מהיר. טען את הדגימות על רצועות IPG של 11 סנטימטר ואפשר להן להתייבש באופן פסיבי למשך הלילה מכוסה בשמן מינרלי למחרת. בצע את המיקוד האיזואלקטרי.

לאחר מכן העבירו את הרצועות דרך שלוש אמבטיות של חיץ שיווי משקל למשך 15 דקות לכל אמבטיה. לאחר מכן הרצועות מופעלות על ג'לים של עמודי SDS דו-ממדיים. שכבו כל רצועה על ג'ל טרומי במשקל המולקולרי המתאים.

פולי אקרילאמיד לחלבון המעניין. מאוחר יותר, העבירו את הג'לים לקרום NITROCELLULOSE PVDF ונתחו אותם עם נוגדנים בפיתוח פרוטוקול זה. שלושה ליזיס שונים.

בלמי רתיעה נבדקו. ראשית, מאגר ביוכימי וביולוגיה מולקולרית משותף. Tris SDS נבדק.

ל-Tris SDS הייתה רזולוציה גרועה בהשוואה ל-UTS מאגר אחר שנבדק. המאגר השלישי ל-de נשלל מכיוון שלא ניתן היה להכין איתו דגימות הניתנות לבדיקה. לאחר מכן, נחקרו פרוטאומים במוח של בני אדם ועכברים.

הושוו דגימות קליפת המוח של בקרה אנושית ודגימות אד קורטקס. חלבוני מוח של עכברים מעכברים עם פתולוגיה כמו טאו נצפו גם הם מהדגימה האנושית. SCI 2 נבדק באופן עצמאי וכך גם S SI 3 ו-sci 5 עבור כל D. רזולוציית הנקודה הגבוהה הפכה את היישור לקל.

ניתוח מיני דו-ממדי איכותי שימש לחקירת שינויים לאחר התרגום ונמצא כי לרצועה, אלפא סינוקלאין ברקמת המודעה, יש פרופיל תקין, אך נמצא גם כדימר המסומן בכוכבית. חיצים סימנו היכן נמצא אלפא סינוקלאין. חלבון מבשר עמילואיד Ubiquitinated נצפה גם על ידי mini 2D.

מודעה ספורדית הושוותה למודעה משפחתית. במשפחה ad בטא עמילואיד 1 עד 42 ושונות ISO נמוכים יותר בריכוז מכיוון שצורות ליגה נמצאו בשמונה קילודלטון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את הפרוטאום על מנת להשוות דגימות מורכבות על ידי מדידת שינויים בביטוי חלבון.