חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting
10 באפריל 2014
פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק חלבון מרקמת מוח של בני אדם ועכברים לצורך אנליזה פרוטאומיקה. מטרה זו מושגת באמצעות שימוש בבופר ליזיס נפוץ כדי להשיג הפקה זהה של חלבונים המותאמת לגישες של אלקטרופורזה דו-ממדית. לאחר מכן, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'לים עם הבדלי פלואורסצנציה דו-ממדית (two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis) כדי להפריד חלבונים לצורך זיהוי באמצעות ספקטרומטריית מסות.
לאחר מכן תבוצע אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי (2D) מיניאטורי עם אימונו-בלוטינג (immuno blotting) לזיהוי מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות. התוצאות יכולות להראות ביטוי חלבוני גלובלי. שינויים טרנסלציונליים במארח, כל תוצרי הליגמנטיזציה והתוצרי הקטליים, יופיעו על בסיס ההבדלים בנקודת האיזואלקטרית ובמשקל המולקולרי.
השילוב של 2D dash ו-2D monolo יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-פרוטאומיקה, על ידי אספקת מידע סימולטני על שינויים בביטוי, מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות וקטבוליזם במוצרים. התחילו באיסוף והומוגניזציה של רקמת המוח. הכינו את הרקמה ביחס של 10% משקל לנפח בבופר מיצוי עבור רקמת מוח אנושית.
בצע הומוגנציה לרקמה באמצעות פיפטור זכוכית, עם זאת, השתמש בהומוגניזטור טפלון עבור רקמת מכרסמים כדי לפרק את ההומוגנאט. בצע סוניקציה ב-60 hertz באמצעות 30 פולסים של חצי שנייה. לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת Bradford כאשר BSA משמש כסטנדרט.
כעת יש לרכז את התמיסות להשקעה בכלורופורם-מתנול בתוך דלי קרח. תכננו לאסוף כ-125 micrograms עבור רצועות IPG באורך 11 centimeter או כ-1.25 milligrams עבור רצועות IPG באורך 18 centimeter. לאחר שהתמיסות יגיעו לטמפרטורה של 4 °C, בצעו את ההשקעה באופן מלא על קרח.
ראשית, הוסיפו שלושה נפחים של methanol, ולאחר מכן נפח אחד של chloroform. נערבבו תערובת זו. לאחר מכן, הוסיפו שלושה נפחים של מים קרים.
ערבבו את התערובת במערבל Vortex למשך דקה אחת, ואז צנטריפגו את מבחנת הדגימה ב-12,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שאבו והשליכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו שלושה נפחים של methanol, ערבבו ב-Vortex וצנטריפגו את החלבונים באופן דומה.
ייבשו את משקע החלבון שנאסף תחת גז חנקן לפני ביצוע 2D DIGE. השעיקו מחדש את החלבון בבופר 2D בריכוז 2.5 milligrams per milliliter. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לדגימות כפי שנעשה בעבר עד למועד השימוש בהן.
אחסן אותם במינוס 80 מעלות Celsius לפני תחילת שלב זה ואחרי שקיעת החלבון. יש לקבוע שוב את ריכוז החלבון באמצעות Bradford Assay. פעל לפי אותו הליך כפי שהוצג קודם לכן, לפני סימון ב-psy dye.
איכות דגימת החלבון מאומתת למטרה זו באמצעות SDS PAGE. דללו 15 micrograms של חלבון ב-LDS וחממו אותם ל-37 °C באמבט חימום או בבלוק חימום. לאחר מכן, הריצו אותם על ג'ל פוליאקרילאמיד וצבעו את הג'ל בתמיסת Coomassie Blue למשך שעה אחת לפחות.
לאחר מכן, השאירו את הג'ל למשך לילה בתמיסה של 7% acetic acid ו-10% ethanol. לאחר שאיכות דגימת החלבון נקבעה, ביום הבא יחל הליך סימון ה-SD. ראשית, מדדו את ה-pH של הליזאט, אשר צריך להיות בסיסי עד ניטרלי.
ה-pH האופטימלי לתגובות הבאות הוא 8.6. לאחר מכן, הכינו את תגובות הצמידת צבע לכל דגימת חלבון. ערבבו 50 micrograms עם 400 picomoles של צבע S3 ו-50 micrograms עם 400 picomoles של צבע S5.
בצעו זאת בארבעה כפילויות, לסך של שמונה תגובות צימוד D לכל דגימה. עבור כל דגימה שנבדקה, הכינו סט משלים של תגובות צימוד DI תוך שימוש בחלבון מהבקרה, כגון ממוח חולה. לאחר מכן, עבור כל זוג תגובות, הכינו תגובת בקרה פנימית עם 400 picomoles של CY two וייצוג שווה של כל החלבונים בסך כולל של 250 micrograms.
סימון SAI מתבצע על ידי דגירה של כל תערובות התגובה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחשיכה למשך שעה. לאחר הדגירה, יש לאחד את כל סדרות התגובות השונות של הציאן לנפחים של 150 microliter לכל סדרת תגובות עם 200 microliter של 2D buffer. לאחר מכן, יש להמשיך לשלבי האלקטרופורזה הדו-ממדית (2D electrophoresis).
התחילו בהכנת תמיסות חלבון לא מסומנות עבור הג'ל הפרפרטיבי, ממנו יגזרו את נקודות החלבון עבור כל דגימה ועבור הביקורת החיובית. חלקו 300 עד 350 מיקרוגרם של חלבון לא מסומן לתוך באפר 2D ואפשרו להם לעבור רהידרציה במגע עם פס ה-IPG. לאחר מכן, טענו את פסי ה-IPG והעבירו את החלבון המסומן והחלבון הלא מסומן לרהידרציה.
כעת, כסו כל באער באמצעות סרט תגובה IPG. לאחר מכן, הוסיפו שכבת שמן מינרלי והניחו לסרטים לעבור רהידרציה פסיבית עם תמיסת החלבון למשך הלילה, בטמפרטורה של עד 25 °C. למחרת, בצעו מיקוד איזואלקטרי של סרטי ה-IPG.
לאחר מכן הסירו את השמן ואחסנו את רצועות ה-IPG בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס כדי להביא את רצועות ה-IPG לשיווי משקל. טבלו אותן בבופר שיווי משקל (equilibration buffer) למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו את הרצועות ל-4.7% IDO acetamide בבופר שיווי משקל, ללא DTT, תוך כדי השריה של הרצועות.
השתמשו במערכת ג'ל דו-ממדית גדולה כדי למסוק ארבעה ג'לי SDS-PAGE בריכוז 12% עבור כל דגימה, בלוחיות זכוכית בעלות פלואורסצנציה נמוכה עבור החלבונים המסומנים. כמו כן, מסקו ג'ל SDS-PAGE אחד בריכוז 12% בלוחיות זכוכית סטנדרטיות בעובי 1.5 מילימטר עבור כל אחד מהחלבונים שאינם מסומנים. אלו הם הג'לים להכנה (preparative gels).
לאחר שהג'לים התקררו, העבירו את הרצועות לחלק העליון של הג'לים וכסו אותן ב-0.5% Aros לאחר הקירור; הרייצו את הג'לים בהספק של 2.5 watts בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה ובדקו אותם למחרת. תגובות 2D רבות ניתן לבצע באמצעות דגימות חלבון ששימשו לג'לים להכנה (preparative gels). מדדו פחות מ-100 micrograms של דגימה לתוך 200 microliters של בופר 2D.
לאחר מכן, ערבבו את תערובות הדגימות בעוצמה באמצעות וורטקס והעבירו אותן לסבב צנטריפוגה קצר. העמיסו את הדגימות על רצועות IPG באורך 11 סנטימטרים והניחו להן לעבור רהידרציה פסיבית במהלך הלילה, כשהן מכוסות בשמן מינרלי, וביום למחרת בצעו את המיקוד האיזואלקטרי.
לאחר מכן, העבירו את הרצועות דרך שלושה רחשי תמיסת שיווי משקל למשך 15 דקות בכל רחץ. לאחר מכן, הריצו את הרצועות על ג'לים של SDS-PAGE דו-ממדיים. הניחו כל רצועה על ג'ל מוכן מראש (precast gel) בעל המשקל המולקולרי המתאים.
פוליאקרילמיד עבור החלבון הנחקר. לאחר מכן, העבירו את הג'לים לממברנת NITROCELLULOSE PVDF ונתחו אותם באמצעות נוגדנים כפי שמתואר בפיתוח של פרוטוקול זה. שלושה סוגי ליזיס שונים.
בצקים נבחנו. ראשית, נבחן בצק נפוץ לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית: Tris SDS.
ל-Tris SDS הייתה רזולוציה נמוכה בהשוואה לבאפר UTS אחר שנבדק. הבאפר השלישי נפסל מאחר שלא ניתן היה להכין עימו את הדגימות לבדיקה. לאחר מכן, נבחנו הפרוטאומיקה של מוח אדם ועכבר.
דגימות של קורטקס בקרת אדם ודגימות של קורטקס עם AD הושוו. חלבוני מוח של עכברים עם פתולוגיית tau דמוית AD נבחנו גם הם ביחס לדגימה האנושית. SCI two נבחן באופן עצמאי, וכך גם S SI three ו-sci five עבור כל D. רזולוציית הנקודות הגבוהה הקלה על היישור.
ניתוח mini 2D איכותני שימש לבדיקת מודיפיקציות לאחר תרגום, ונמצא כי ל-alpha synuclein שעבר ליגמנטיזציה ברקמת שומן יש פרופיל תקין, אך הוא נמצא גם כדִימר המסומן בכוכבית. חצים סימנו את המקומות שבהם נמצא alpha synuclein. חלבון amyloid precursor protein שעבר יוביקיטינציה נבחן אף הוא באמצעות mini 2D.
השוואה בין מחלה של אלצהיימר ספורדית למחלה של אלצהיימר משפחתית. במחלה של אלצהיימר משפחתית, ריכוזי beta amyloid 1-42 ו-ISO variance נמוכים יותר, מכיוון שנמצאו צורות liga במשקל של 8 kDa. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של אופן חקר הפרוטאום במטרה להשוות דגימות מורכבות על ידי מדידת שינויים בביטוי חלבונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד במיצוי חלבונים מרקמת מוח של בני אדם ועכברים באמצעות באפר ליזיס (lysis buffer) נפוץ לצורך אנליזה פרוטאומית. השיטה מאפשרת זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות טכניקות מתקדמות של אלקטרופורזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פרוטאומיקה
- מדעי המוח
- ביוכימיה
רקע
- מיצוי חלבונים הוא קריטי להבנת תפקוד המוח.
- טכניקות של אלקטרופורזה דו-ממדית משפרות את הפרדת החלבונים.
- מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות עשויות להשפיע באופן משמעותי על תפקוד החלבון.
- דרושות שיטות מהימנות להשגת תוצאות הניתנות לשחזור בביופסיות ובמודלים.
מטרת המחקר
- לחילוץ חלבונים מרקמות מוח לצורך אנליזה.
- לשימוש באלקטרופורזה של ג'ל בממדים שניים עם הבדלי פלואורסצנציה.
- לזיהוי מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות באמצעות אימונובלוטינג.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- מיצוי חלבונים באמצעות בופר urea/thiourea/SDS.
- אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדית עם הבדלי פלואורסצנציה (2D-DIGE).
- אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדית בגרסת מיני עבור אימונובלוטינג.
- ספקטרומטריית מסות לזיהוי חלבונים.
תוצאות עיקריות
- מיצוי מוצלח של חלבונים מרקמות מוח של בני אדם ועכברים.
- זיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסות.
- אפיון של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות.
- שיפור השחזוריות של תוצאות מביופסיות וממודלים.
מסקנות
- השיטה מספקת תוצאות מהימנות לניתוח פרוטאומיקה.
- היא מקלה על חקר ביטוי חלבונים ושינויים פוסט-טרנסלציונליים.
- ניתן להחיל גישה זו על מחקרים נוירולוגיים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר מיצוי חלבונים סטנדרטי מרקמות מוגבלות של מוח אנושי לאחר המוות ומוח עכבר, ובכך הוא תומך בפרופיל פרוטאומי הדיר במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. באמצעות שילוב של 2D-DIGE לניתוח ביטוי כמותי ו-mini 2DE immunoblotting לתיקוף של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות, השיטה מחזקת את הביטחון בתיקוף המטרות ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מקלה על השוואה בין מינים שונים ועל גילוי ביומרקרים הרלוונטיים למסלולים של מחלת אלצהיימר ודמנציה של גופי לוויי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות פרופילי ביטוי חלבונים גלובליים ברקמות מוח הרלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי זיהוי מודיפיקציות לאחר תרגום, כגון יוביקוויטינציה ודימריזציה של חלבונים הקשורים למחלה, כגון alpha-synuclein וחלבון amyloid precursor.
- ערך ניבוי: משפר את מיון הפורטפוליו על ידי אספקת השוואה איכותית של מודיפיקציות חלבונים בין מצבים שונים, ובכך מסייע בתעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף עבור זרימות עבודה המשך, על ידי הפקת תמריתי חלבון התואמים לפלטפורמות של 2D-DIGE ו-immunoblotting.
- שחזוריות: מטפלת בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות באפר ליזיס סטנדרטי ושקיעה של כלורופורם-מתנול, מה שמשפר את העקביות בין דגימות אנושיות ועכבריות.
- פלט כמותי: מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל עם הבדלי פלואורסצנציה, ובכך תומכת בסריקה של ביטוי דיפרנציאלי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בחקר מסלולים מולקולריים במחלות נוירודגנרטיביות על ידי מתן אפשרות לניתוח של אגרגטים חלבוניים כגון amyloid-beta ו-alpha-synuclein.
- המשכיות תרגומית: מספק המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות להשוואה מקבילית של פרוטאומי מוח אנושי ועכברי.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות זיהוי שינויים בביטוי ובמודיפיקציות של חלבונים הקשורים למחלה במודלים של פתולוגיית tau.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מהבדיקה של השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד בתוכניות למחלות ניווניות של מערכת העצבים הדורשות תובנה מכניסטית והורדת סיכונים של מטרות (target de-risking).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי זיהוי שינויים בביטוי חלבונים ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות באמצעות הפרדה לפי נקודת איזואלקטרית ומשקל מולקולרי.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה ופלטים כמותיים באמצעות 2D-DIGE, המאפשרים השוואה של ביטוי חלבונים בין דגימות מורכבות.
- אנליטיקה: מייצר מדדים מדידים הכוללים עוצמת נקודה, הסטות בנדידה ותבניות מודיפיקציה, המסייעים לצומי מחקר להשוות בין תנאים ולתעדף מטרות.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי אפשור אנליזה של רקמת מוח אנושית ועכברית תחת תנאים דומים, ובכך תומך בהתאמת ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת פרוטאומיקה הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, וניתן להחלה על מטרות רבות ומודלים שונים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות תצפית ישירה על מודיפיקציות של חלבונים ושינויים בביטוי.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של בופר ליזיס והשקעת חלבונים, תוך מזעור השונות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות באמצעות תובנות מכניסטיות, ובכך מקטין את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים על ביומרקרים חלבוניים ומצבי מודיפיקציה הרלוונטיים להתקדמות המחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטאומיקה, ביוכימיה של חלבונים ובטכניקות אלקטרופורזה, כולל 2D-DIGE ו-immunoblotting.
- תלוי במכשור כגון מערכות אלקטרופורזה, סוניקטורים, צנטריפוגות ופלטפורמות התואמות למספקטרומטריית מסות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות, כימות חלבונים ונהלי סימון כדי להבטיח הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול לאזורי מוח שונים, למודלים של מחלות או לכמויות דגימה משתנות.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך בטיפול זהיר בדגימות למניעת דגרדציה והסתמכות על תנובת חלבון מספקת מכמויות רקמה מוגבלות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Extracting Total Protein
3:07
Quality Control and Dye Conjugation
5:28
Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2D-DIGE)
7:36
Mini-2DE for Quantitative Analysis
8:53
Proteomics of Human and Mouse Tissue with Alzheimer Disease
10:26
Conclusion
