חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting
April 10th, 2014
פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחלץ חלבון מרקמת מוח אנושית ועכברית לניתוח פרוטאומיקה. זה מושג על ידי שימוש במאגר ליזה נפוץ כדי להשיג את אותו מיצוי חלבון המותאם לגישות אלקטרופורזה דו-ממדיות. הבא הפרש פלואורסצנטי דו-ממדי אלקטרופורזה של ג'ל משמש להפרדת חלבונים לזיהוי ספקטרומטריית מסה.
לאחר מכן מתבצעת אלקטרופורזה מיניאטורית של ג'ל דו-ממדי עם ספיגה חיסונית לזיהוי שינויים לאחר תרגום. התוצאות יכולות להראות ביטוי חלבון גלובלי. תרגום מארח משנה את כל הרצועות והתוצרים הקטליטיים בהתבסס על ההבדלים בנקודה האיזואלקטרית ובמשקל המולקולרי.
השילוב של מקף דו-ממדי ומונולו דו-ממדי יכול לעזור לנו לענות על שאלת מפתח בתחום הנוירו-פרוטאומיקה על ידי מתן מידע בו-זמנית על שינויי ביטוי. שינוי דואר וקטבוליזם במוצרים התחל בקציר והומוגניזציה של רקמת המוח. הכן את הרקמה במשקל של 10% לנפח במאגר מיצוי לרקמת מוח אנושית.
עם זאת, הומוגניזציה של הרקמה באמצעות פיפטר זכוכית, השתמש בהומוגנייזר טפלון לרקמת מכרסמים כדי לפרק את כל אחד מההומוגנים. סוניקציה ב-60 הרץ באמצעות פולסים של 30 חצי שנייה. לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד באמצעות BSA כסטנדרט.
כעת אספו את הפתרונות למשקעי מתנול כלורופורם בדלי קרח. תכנן לאסוף כ-125 מיקרוגרם עבור רצועות IPG של 11 סנטימטר או כ-1.25 מיליגרם עבור רצועות IPG של 18 סנטימטר. ברגע שהתמיסות מגיעות לארבע מעלות צלזיוס, בצע את המשקעים לחלוטין על קרח.
ראשית, הוסף שלושה נפחים של מתנול, ואז אחד של כלורופורם. לנער את התערובת הזו. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של מים קרים.
מערבולת, תערובת זו למשך דקה אחת צנטריפוגה את צינור הדגימה ב 12, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף שלושה נפחים של מערבולת מתנול וסובב את החלבונים באותו אופן.
יבש את כדור החלבון שנאסף תחת גז חנקן לפני DIGE דו-ממדי. Re השעו את החלבון במאגר דו-ממדי ב-2.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן סוניקציה של הדגימות כפי שנעשה קודם לכן עד לשימוש בהן.
אחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני תחילת שלב זה ולאחר משקעי חלבון. יש צורך לקבוע את ריכוז החלבון פעם נוספת על ידי מבחן ברדפורד. ביצוע אותו הליך שהוצג קודם לכן לפני תיוג צבע פסיכי.
איכות דגימת החלבון מאומתת על ידי דף SDS למטרה זו. מדללים 15 מיקרוגרם חלבון ב-LDS ואותו ל-37 מעלות צלזיוס באמבט חום או בלוק. לאחר מכן הפעל אותם על ג'ל פולי אקרילאמיד, הכתים את הג'ל בתמיסה כחולה קומאסי למשך שעה לפחות.
לאחר מכן עצרו את הג'ל למשך הלילה בתמיסת 7% חומצה אצטית, 10% אתנול. לאחר קביעת איכות דגימת החלבון, למחרת מתחיל הליך תיוג ה-SD. ראשית יש למדוד את ה-pH של הליזאט, שאמור להיות בסיסי עד ניטרלי.
ה-pH האופטימלי הוא 8.6 לתגובות הבאות. לאחר מכן, הגדר את תגובות צימוד הצבע עבור כל דגימת חלבון. מערבבים 50 מיקרוגרם עם 400 פיקומולים של צבע S3 ו-50 מיקרוגרם עם 400 פיקומולים של צבע S five.
עשה זאת ב-quadruplex בסך הכל שמונה תגובות צימוד D לכל דגימה. עבור כל דגימה שנבדקה, הכינו קבוצה משלימה של תגובות צימוד DI באמצעות חלבון מהביקורת כגון ממוח חולה. לאחר מכן, עבור כל זוג תגובות, הגדר תגובת בקרה פנימית עם 400 פיקומולים של CY שניים וייצוג זוגי של כל החלבונים בסך הכל 250 מיקרוגרם.
תיוג SAI מושג על ידי דגירה של כל תערובות התגובה בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה. לאחר הדגירה, שלב את כל הקבוצות של שלוש תגובות ציאן שונות לנפחים של 150 מיקרוליטר לכל קבוצת תגובות ב-200 מיקרוליטר של מאגר דו-ממדי. לאחר מכן המשך בשלבי האלקטרופורזה הדו-ממדית.
התחל בהכנת תמיסות חלבון ללא תווית לג'ל ההכנה שממנו ייכרתו כתמי חלבון עבור כל דגימה ועבור הבקרה החיובית. הכניסו 300 עד 350 מיקרוגרם של חלבון ללא תווית למאגר דו-ממדי ואפשרו להם להתייבש במגע עם רצועת ה-IPG. לאחר מכן, רצועות ה-IPG מעבירות את החלבון המסומן ואת החלבון הלא מסומן להתייבשות.
ובכן, כסו כל באר ברצועת תגובה IPG. המשיכו עם שכבת שמן מינרלי ואפשרו לרצועות להתייבש באופן פסיבי עם תמיסת החלבון למשך הלילה בטמפרטורה של לא יותר מ-25 מעלות צלזיוס. למחרת, בצע מיקוד איזואלקטרי של רצועות ה- IPG.
לאחר מכן הסר את השמן ואחסן את רצועות ה-IPG במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לאזן את רצועות ה-IPG. טבלו אותם במאגר שיווי משקל למשך 15 דקות. לאחר מכן העבירו את הרצועות ל-4.7% IDO אצטמיד במאגר שיווי משקל, חסר DTT בזמן רחיצת הרצועות.
השתמש במערכת ג'ל דו-ממדית גדולה כדי לשפוך ארבעה ג'לים של 12% SDS לדגימה בלוחות זכוכית פלואורסצנטיים נמוכים עבור החלבונים המסומנים כמו כן, שפכו ג'ל אחד של 12% SDS בלוחות זכוכית סטנדרטיים בעובי 1.5 מילימטר עבור כל אחד מהחלבונים הלא מסומנים. אלה הם הג'לים המכינים אותם.
כאשר הג'לים מתקררים, העבירו את הרצועות לחלק העליון של הג'לים וכסו את הרצועות ב-0.5%Aros לאחר שהתקררו, הפעילו את הג'לים ב-2.5 וואט בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה ונתחו אותם למחרת. תגובות דו-ממדיות רבות יכולות להתבצע עם דגימות חלבון המשמשות לג'לים המכינים מדוד פחות מ-100 מיקרוגרם של דגימה ל-200 מיקרוליטר של מאגר דו-ממדי.
לאחר מכן מערבבים את תערובות הדגימה במרץ ונותנים להן סיבוב מהיר. טען את הדגימות על רצועות IPG של 11 סנטימטר ואפשר להן להתייבש באופן פסיבי למשך הלילה מכוסה בשמן מינרלי למחרת. בצע את המיקוד האיזואלקטרי.
לאחר מכן העבירו את הרצועות דרך שלוש אמבטיות של חיץ שיווי משקל למשך 15 דקות לכל אמבטיה. לאחר מכן הרצועות מופעלות על ג'לים של עמודי SDS דו-ממדיים. שכבו כל רצועה על ג'ל טרומי במשקל המולקולרי המתאים.
פולי אקרילאמיד לחלבון המעניין. מאוחר יותר, העבירו את הג'לים לקרום NITROCELLULOSE PVDF ונתחו אותם עם נוגדנים בפיתוח פרוטוקול זה. שלושה ליזיס שונים.
בלמי רתיעה נבדקו. ראשית, מאגר ביוכימי וביולוגיה מולקולרית משותף. Tris SDS נבדק.
ל-Tris SDS הייתה רזולוציה גרועה בהשוואה ל-UTS מאגר אחר שנבדק. המאגר השלישי ל-de נשלל מכיוון שלא ניתן היה להכין איתו דגימות הניתנות לבדיקה. לאחר מכן, נחקרו פרוטאומים במוח של בני אדם ועכברים.
הושוו דגימות קליפת המוח של בקרה אנושית ודגימות אד קורטקס. חלבוני מוח של עכברים מעכברים עם פתולוגיה כמו טאו נצפו גם הם מהדגימה האנושית. SCI 2 נבדק באופן עצמאי וכך גם S SI 3 ו-sci 5 עבור כל D. רזולוציית הנקודה הגבוהה הפכה את היישור לקל.
ניתוח מיני דו-ממדי איכותי שימש לחקירת שינויים לאחר התרגום ונמצא כי לרצועה, אלפא סינוקלאין ברקמת המודעה, יש פרופיל תקין, אך נמצא גם כדימר המסומן בכוכבית. חיצים סימנו היכן נמצא אלפא סינוקלאין. חלבון מבשר עמילואיד Ubiquitinated נצפה גם על ידי mini 2D.
מודעה ספורדית הושוותה למודעה משפחתית. במשפחה ad בטא עמילואיד 1 עד 42 ושונות ISO נמוכים יותר בריכוז מכיוון שצורות ליגה נמצאו בשמונה קילודלטון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את הפרוטאום על מנת להשוות דגימות מורכבות על ידי מדידת שינויים בביטוי חלבון.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
המחקר הזה מתמקד בהפקת חלבונים מרקמת מוח אנושית ועכברית באמצעות מאגר פירוק נפוץ לניתוח פרוטאומיקה. השיטה מאפשרת זיהוי ואפיון חלבונים באמצעות טכניקות אלקטרופורזה מתקדמות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- פרוטאומיקה
- מדעי המוח
- ביוכימיה
רקע
- הפקת חלבונים חיונית להבנת תפקוד המוח.
- טכניקות אלקטרופורזה דו-ממדיות משפרות את הפרדת החלבונים.
- שינויים פוסט-תרגומיים יכולים להשפיע באופן משמעותי על תפקוד החלבון.
- יש צורך בשיטות אמינות לתוצאות ניתנות לשחזור בביופסיות ובמודלים.
מטרת המחקר
- להפיק חלבונים מרקמות מוח לצורך ניתוח.
- לנצל אלקטרופורזה דו-ממדית של הבדלי פלואורסצנציה בג'ל.
- לזהות שינויים פוסט-תרגומיים באמצעות אימונובלוטינג.
שיטות ששימשו
- הפקת חלבונים באמצעות מאגר אוריאה/תיואוראה/SDS.
- אלקטרופורזה דו-ממדית של הבדלי פלואורסצנציה בג'ל (2D-DIGE).
- אלקטרופורזה דו-ממדית מיני בג'ל לאימונובלוטינג.
- ספקטרומטריית מסה לזיהוי חלבונים.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של חלבונים מרקמות מוח אנושיות ועכבריות.
- זיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסה.
- אפיון של שינויים פוסט-תרגומיים.
- שיפור הנתינות של תוצאות מביופסיות ומודלים.
מסקנות
- השיטה מספקת תוצאות אמינות לניתוח פרוטאומיקה.
- היא מאפשרת מחקר של ביטוי חלבונים ושינויים בהם.
- גישה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים נוירולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
