השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על שאלות חשובות במחקר בסיסי וקליני על ידי התבוננות ביטוי חלבון על פני רקמות שונות ונקודות זמן. כדי לבצע כתמים מערביים כמותיים אמינים, אנו משלבים כתם חלבון כולל פלואורסצנטי עם בקרת טעינה פנימית. זה מתגבר על מגבלות המתעוררות בעת השוואת רקמות שונות על פני תנאים ניסיוניים.

כדי לחלץ חלבונים מדגימות תאים או רקמות קפואות, הפשיר את הדגימות של מינוס 80 מעלות על קרח לפני שטיפת הדגימות לפי הצורך, על פי הטבלה. באמצעות homogenizer חשמלי כף יד עם עלה פוליפרופילן, הומוגניזציה דגימות שטף, לשטוף את העלי במים מזוקקים כפול וייבוש עם רקמה נקייה בין דגימות. השאירו את הדגימות על הקרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה.

לאחר מכן, להעביר את החלבון-מדגם המכיל supernatant לצינור חדש על הקרח מבלי להפריע גלולה. לכמת את ריכוז החלבון, להגדיר תקני אלבומין בסרום חזיר בריכוזים הולכים וגדלים ב- triplicate, ולהוסיף microliter אחד של כל דגימת חלבון כפול ל בארות המתאימות של צלחת אופטית 96-well. דגירה החלבון על בלוק חום 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר אם ריכוז החלבון צפוי להיות נמוך ולמדוד את הספיגה ב 560 ננומטר על קורא צלחת.

יצא את מדידות קורא הלוחות וחשב את ריכוז החלבון על-ידי השוואת ערכי הספיגה הממוצעים של כל דגימה לעקומה סטנדרטית המתקבלת באמצעות תקן החלבון. כדי לנרמל את כמות החלבון, הכינו דילול של דגימות החלבון במאגר הדגימה ומים טהורים במיוחד והדגירה את הדגימות בבלוק חום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות על קרח לפני מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.

עבור אלקטרופורזה, להגדיר מראש ארבעה עד 12% ביס-טריס שיפוע ג'ל במערכת התא אלקטרופורזה ג'ל לטעון 3.5 microliters של תקן חלבון לתוך באר. בעת שימוש בתקן פנימי לנורמליזציה בין קרום, טען כמות השווה לדגימות האחרות לשלוש הבארות הראשונות ליד סולם החלבון וטען 30 מיקרוגרם של כל דגימה לתוך הבאר הנותרת. לאחר מכן, להפעיל את הדגימות דרך ג'ל הערימה ב 80 וולט במשך 10 דקות ואחריו 150 וולט במשך 45 עד 60 דקות נוספות.

בסוף האלקטרופורזה, כדי להרכיב את ערימת ההעברה, מניחים את ג'ל החלבון על הערימה התחתונה המכילה את קרום הפוליווינילידין דיפלואוריד ואחריו נייר המסנן. השתמש בגלגלת סופג כדי להסיר את כל בועות האוויר למקם את הערימה העליונה על החלק העליון של נייר המסנן לפני גלגול הערימה שוב כדי להסיר בועות אוויר. מעבירים את כל הערימה למכשיר ההעברה עם האלקטרודה בצד שמאל של המכשיר ומ מניחים את ספוג הג'ל על גבי הערימה כך שהספוג מיושר עם המגעים החשמליים המתאימים במכשיר.

לאחר סגירת המכסה, בחר והתחל את התוכנית המתאימה. בסוף התוכנית, חותכים את הממברנה לגודל הג'ל ושוטפים את הממברנה החתוכה במהירות במים מזוקקים כפולים לפני שממשימים עם כתם החלבון הכולל. עבור כתמי חלבון כוללים, מגלגלים את הממברנה לתוך צינור 50 מיליליטר כאשר צד החלבון פונה פנימה ומתייגים את הממברנה עם חמישה מיליליטר של תווי כתם חלבון על רולר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של האדים.

בסוף הדגירה, לשטוף את הממברנה במהירות עם חמישה מיליליטר של פתרון לשטוף, החזרת הצינור בקצרה רולר בין שטיפות, ואחריו שטיפה קצרה עם מים טהורים במיוחד. מוסיפים שלושה מיליליטר של חיץ חסימה לממברנה ומחזירים את הממברנה לגלגלת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את חיץ החסימה בנוגדן העניין העיקרי בריכוז האופטימי המתאים והידגר את הממברנה על הגליל במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, לשטוף את הממברנה שש פעמים במשך חמש דקות עם חמישה מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף על רולר בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, להדק את הממברנה עם פתרון נוגדנים משני המתאים על רולר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות במשך 30 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, ייבשו את הממברנה ולהשתמש בנייר אלומיניום כדי לשמור על הממברנה מוגנת מפני אור.

לרכישת תמונה, מקם את הממברנה בסורק כשיד החלבון פונה כלפי מטה ובחר את אזור הסריקה בתוכנה. לאחר מכן, לרכוש תמונות בשני הערוצים ולייצא את התמונות לתוכנית ניתוח תמונה מתאימה. הצג את ערוץ 700 הננומטר כדי להציג את תוצאת הכתמת החלבון הכוללת ובחר ניתוח וצייר מלבן כדי להגדיר את אזור העניין לנורמליזציה.

לאחר מכן, העתק והדבק את אזור המלבן הראשון על כל דגימה בודדת כדי להבטיח שהאזור המוגדר יהיה באותו גודל עבור כל הנתיבים שנותחו. כדי לכמת את ריכוז החלבון בכל נתיב, העתק את התוצאות הן מכתם החלבון הכולל והן מחלבון המעניין לתוכנית גיליון אלקטרוני וקבע את אות הכתם הכולל הגבוה ביותר של חלבון. לאחר מכן, חלקו כל ערך אות כתמי חלבון לפי ערך זה כדי לקבל את ערך טעינת החלבון המנורמל ולחלק את ערך האות של 800 ננומטר מכל מדגם בגוף לפי ערך החלבון המנורמל המתאים לו כדי לחשב את יחס ביטוי החלבון היחסי בדגימות שונות.

בתנומות מערביות מייצגות אלה, חלבונים המופקים מרקמות המתקבלות מיום לידה חמישה עכברים מושווים לחלבונים המופקים מעכברים בוגרים בני 10 שבועות. כימות עוצמת הפלואורסצנטיות של כתם החלבון הכולל הושג על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך תיבת המלבן בכל נתיב. כאשר נתיבים שלמים מנותחים, עוצמת הפלואורסצנטיות נשארת דומה יחסית בין דגימות, מה שמצביע על כך שהשימוש בכתם החלבון הכולל לנורמליזציה מתאים למטרה זו.

ניתן להשתמש בכתם החלבון הכולל הפלואורסצנטי גם כדי להשוות את רמות החלבון בנקודות זמן התפתחותיות שונות. לדוגמה, למרות שרמות החלבון של נוירון מוטורי הישרדות יורדות בבירור עם הגיל בעכברים, כימות החלבון המוכתם הכולל נשאר קבוע. השימוש בתקנים פנימיים, נורמליזציה מבוססת פלואורסצנטיות וסטטיסטיקה נאותה מגביר את החוסן של ניתוח ביטוי חלבון מורכב בתנאים שונים.

פרוטוקול זה מוסיף לטכניקות כתם מערביות מסורתיות, מתגבר על הבעיות של בקרות טעינה והשוואות מתאימות על פני אצוות ניסיוניות, ומספק גמישות לניתוח ביטוי חלבון. גישה זו יכולה להיות מורחבת להשוואת ביטוי חלבון בתנאים ניסיוניים אחרים.