הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בשינויים הדינמיים בחלבון FTSZ במהלך חלוקת התאים בחיידקים. זה מושג על ידי יישום תאים עדינים של בצילוס המבטאים את היתוך ה-GFP האמור של FTS על פני השטח של כרית ארוס קטנה. לאחר מכן הופכים את הרפידה ומועברים לצלחת פטרי עם תחתית החלקה של מכסה זכוכית.

השלב השני הוא רכישת תמונות זמן-lapse של החיידקים במהלך חלוקת התא באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה תלת מימד או מערכת הדמיה תלת מימדית SIM. לאחר מכן, מעריכים את איכות הנתונים הגולמיים ונזרקות תמונות עם ירידה של יותר מ -30% בעוצמה עקב פוטוהלבנה. השלב האחרון הוא ניתוח כמותי של השינויים בלוקליזציה של החלבון במהלך חלוקת התא על ידי מדידת התפלגות עוצמת הקרינה של חלבון F-T-S-Z-G-F-P לאורך זמן.

בסופו של דבר נעשה שימוש ב-SIM תלת מימדי מהיר כדי להראות עד כמה חלבוני דיון דינמיים במהלך חלוקת התאים בחיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שאנו מקבלים מידע תלת מימדי על השינויים המתרחשים בחלוקת התאים בתאי חיים. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי ציטוקינזיס חיידקים, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות שבהן אנו רוצים להסתכל על שינויים דינמיים בחלבון כגון תאי יונקים M.

הרעיון לכך עלה לראשונה כאשר ראינו תמונות סים תלת-ממדיות מסורתיות של תאי חיידקים קבועים הראו כי חלבון ה-FDZ אינו מפוזר באופן הומוגני סביב טבעת ה-zed. רצינו לבחון עוד אם התפלגות זו קשורה לשינויים שהתרחשו במהלך התכווצות טבעת Zed. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו בגלל אי התאמת מקדם השבירה של השמן שלהם לדגימה שלהם, וזה יוביל לתמונות באיכות ירודה.

כדי להכין את התאים העדינים ביותר של בצילוס להדמיה, גדל את התאים עד אמצע השלב האקספוננציאלי כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, חבר מסגרת דבק על שקופית מיקרוסקופ זכוכית רגילה על ידי הסרת יריעת הפוליאסטר הדקה. לאחר מכן החל את משטח הדבק החשוף של המסגרת על פני שקופית המיקרוסקופ כדי ליצור ביעילות באר מרובעת על גבי השקופית, השאר את יריעת הפוליאסטר העבה מחוברת למסגרת כדי למנוע הידבקות של החלקת הכיסוי בשלבים הבאים.

לאחר מכן, ממיסים תמיסת ארו במיקרוגל עד לפיפטה רותחת 67 מיקרוליטר של הארוס המומס למסגרת הדבק. מניחים מיד החלקת כיסוי על גבי הארוס ליצירת משטח ישר ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. הסר את תלוש הכיסוי למשך דקה עד שתיים בזמן איסוף הדגימה.

קצרו כמות של מיליליטר אחד מהדגימה לאחר צנטריפוגה ב-8,000 סל"ד למשך השניות ששפכו את הסופרנטנט להשעות את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי. קח 2.5 מיקרוליטר מהדגימה המרוכזת ופיפטה על כרית הארוס שהוכנה מראש. מורחים את הדגימה באופן שווה על המשטח השטוח של כרית הארוס.

לאחר מכן הסר את מסגרת הדבק משקופית המיקרוסקופ באמצעות פינצטה מבלי לגעת בכרית הארוס. העבירו את כרית הארוס מהמיקרוסקופ. החלק לצלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר עם תחתית החלקה של כיסוי זכוכית.

להדמיה ברזולוציה גבוהה. הפוך את כרית הארוס כך שמתלה התא יהיה במגע עם החלקת הכיסוי של צלחת הפטרי. ביום הניסוי, הפעל את מערכת ההדמיה OMX 3D SIM לפחות שעה לפני ההדמיה כדי לאפשר למערכת וללייזרים להתייצב באופן מלא.

לאחר מכן הפעל את הרכיבים השונים כמפורט בפרוטוקול הטקסט בתחנת העבודה של הבקר הראשי. פתח את תוכנת OMX על ידי לחיצה על הסמל. הגדר את נתיב הקובץ לשמירת נתונים לתיקיית נתונים מתאימה.

לאחר מכן, הפעל את תוכנת העבודה הרכה. הפעל את הלייזרים הנדרשים לניסויים על המסך הראשי בסעיף פרמטרי האור. הפעל את מצלמת FITC מבחירת הערוץ והמשך לבדוק את הפרמטרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

מרחו טיפת שמן על החלק העליון של המטרה. מניחים את צלחת הפטרי לדוגמה המכילה את התאים המוכנים לתוך שיבוץ הבמה ומכסים במכסה החימום העגול. מנמיכים את הבמה עד שהשמן נוגע בתחתית צלחת הפטרי לדוגמה.

אפשר למנה להתייצב בחום למשך 15 דקות ב-stagבאמצעות הגדרת חשיפה נמוכה, התמקד בדגימה באמצעות בקרות שלב מיקום הננו. התמקד למעלה ולמטה דרך הדגימה כדי לקבוע אם האור מתפזר באופן שווה מעל ומתחת למישור המוקד של הדגימה. לאחר מכן השתמש בגדלי צעדים של 0.5 מיקרון וסמן את החלק העליון והתחתון של ערימת התמונות לפני שתחזור לאמצע הדגימה בכרטיסיית הניסוי, לחץ על כפתור קבל עובי כדי להגדיר את עובי רכישת הדגימה.

קבע את ערך העוצמה המקסימלי של תמונת הדגימה עם הגדרות החשיפה הנוכחית ואחוז האור המועבר. ערך זה נמצא מתחת לחלון התמונה. להדמיית זמן-lapse, התאם את החשיפה ואחוז האור המועבר כדי להשיג עוצמה מקסימלית של 1100 עד 1400.

מעל הרקע. עבור התמונה, הפעל את קטע הזמן לשגות בכרטיסיית הניסוי. הגדר את קצב הפריימים הנדרש ואת הזמן הכולל בקובץ הנתונים.

הזן שם קובץ מתאים. לחצו על לחצן ההפעלה כדי להתחיל ברכישת התמונה בתחילת רכישת התמונה. שימו לב לערך העוצמה המקסימלי של התמונה בתחילת רכישת התמונה עבור המסגרת הראשונה של סדרת הזמן.

בתום רכישת המסגרת הראשונה, בדוק שלא חלה ירידה של יותר מ -10% בעוצמת האות דרך הזאק עבור מסגרת ראשונה זו. בתום רכישת סדרת הזמן, פתח את קובץ התמונה הגולמית שהתקבל עם סיומת DV וודא את הירידה בעוצמת האות המקסימלית מתחילת סדרת הזמן ועד לתמונה הסופית. השלך את כל נקודות הזמן שבהן הייתה הלבנת תמונות של יותר מ-30% מתפריט התהליך, הפעל את חלון שחזור SI.

השתמש בהגדרות הקיימות עבור כל הפרמטרים. הפעל את כפתור ה-OTF הספציפי לערוץ המשומש והגדר לערכת המסננים הסטנדרטית. הפעל את כפתור זוויות ה-KO הספציפי לערוץ המשומש והגדר לערכת המסננים הסטנדרטית.

גרור ושחרר את הקובץ הגולמי לתוך שטח קובץ הקלט. לחץ על עשה זאת. בדוק את התפלגות ה-FTSZ סביב טבעת Z כדי ליצור עלילות עוצמה תלת מימדיות.

לאחר מכן פתחו קובץ תמונה תלת-ממדית. להצגת פרוסות z בודדות. השתמש בכלי מציג אמצעי האחסון הממוקם מתחת לכרטיסיית תפריט התצוגה.

כדי לחתוך אזור עניין, הזן את מספר החלון של תמונה תלת-ממדית זו בחלון הקלט והזן מספר חלון חדש שאינו בשימוש בחלון הפלט. כפתור בחירת האזור יהפוך לזמין לחיתוך טבעת Z בודדת מעניין משדה הראייה המקורי של 40 על 40 מיקרון. התאם את הציר הרצוי ואת מידת הסיבוב בלשונית הסיבוב

לחץ על כפתור עשה זאת. גלול דרך עוצמת הקול כדי לקבל את הפרספקטיבה הרצויה, טבעת Z. השתמש בכלי מפקח הנתונים כדי להתאים את מידות שורת העמודה כדי ליצור אזור עניין חדש סביב טבעת Z בודדת.

לחץ על מרכז התמונה כדי למקם את אזור העניין החדש הזה. נתוני תמונת הטקסט הם טבלה שנוצרה אוטומטית המציגה את עוצמת הקרינה של כל פיקסל באזור העניין. לחצו על הלחצן 'תרשים תלת-ממדי' כדי להציג תחילה את תרשים העוצמה.

לחלופין, ניתן לייצא את נתוני תמונת הטקסט על ידי לחיצה על לחצן שמירת נתוני טבלה. בתפריט קובץ, העתק את נתוני התמונה מקובץ הטקסט שנשמר לגיליון אלקטרוני חדש. בחר את כל התאים בגיליון האלקטרוני וצור תרשים פני שטח תלת-ממדי חדש.

עצב את גרף התוויית העוצמה התלת-ממדית לפרסום עבור נתוני קיטועי זמן. חזרו על שלבים אלה בכל אחת מנקודות הזמן השונות מקובץ התמונה התלת-ממדית. כאשר היא מדומיינת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית של שדה רחב, טבעת Z מופיעה כפס רוחבי יחיד של פלואורסצנציה בעדינות.

עוצמת הקרינה בכל הרצועה הזו אחידה. דפוס הלוקליזציה מציע מעט תובנה לגבי הארגון המבני וההתפלגות של פולימרים האמורים FTS בתוך הטבעת כאן, אותם תאים נבדקים. שימוש בשיטת הסים FAST 3D.

סיבוב תמונת ה-SIM התלת-ממדית סביב ציר Z מאפשר הדמיה של טבעת Z כמבנה טבעת אמיתי במרחב תלת מימדי. השיפור ברזולוציה מאפשר הדמיה של ההתפלגות ההטרוגנית של FTSZ בתוך הטבעת. דוגמאות נוספות של טבעות Bacillus Z המוצגות בטכניקה זו ממחישות כיצד עוצמת הקרינה סביב טבעת Z לעולם אינה זהה.

יתר על כן, נצפים אזורים בעלי עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה מאוד או פערים. כדי לכמת את התצפיות הללו, נוצרו תרשימי עוצמה תלת מימדיים של טבעת Z. תרשימי העוצמה מראים שכמות הקרינה יכולה להשתנות עד פי ארבעה באזורים שונים של טבעת Z העדינה ביותר של החיידק.

תרשימי העוצמה התלת-ממדיים מראים שהפערים כמעט קוראים את רמות הבסיס של הקרינה ברקע כדי לנתח את השינויים הדינמיים המתרחשים בתוך טבעת Z. עם הזמן, מתבצע קיטועי זמן של סים תלת-ממדי. סרט זה מראה כיצד FTSZ בתוך טבעת ה-Z העדינה של החיידק משתנה כל הזמן ונמדד עם עלילת עוצמה שנוצרת עבור כל תמונה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל ולהכין תאי חיידקים, כיצד לדמיין אותם באמצעות סים תלת מימדי, כיצד לנתח אותם כדי להשיג נתונים כמותיים, ולבסוף, כיצד לספק תמונות באיכות מצגת. חשוב מאוד במהלך רכישת התמונה לעקוב אחר בריאות התאים שלך וגם לעקוב אחר רמת הביטוי של החלבון הפלואורסצנטי במהלך הרכישה לאחר התפתחותו. השיטה הזו סללה את הדרך לאנשים אחרים בתחום הביולוגיה של תאי החיידקים להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה ולמקם חלבונים חיידקיים אחרים באורגניזמים שונים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע צורות אחרות של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופ לוקליזציה המופעל בתמונה כדי להסתכל על שינויים דינמיים בחלבון האמור FDS לאורך זמן.