Name: הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: חקור את הדינמיקה של חלבון FtsZ במהלך חלוקת תאים בחיידקים באמצעות מיקרוסקופיית f3D-SIM. שיטה זו מספקת תובנות תלת-ממדיות לגבי מבנה טבעת Z הציטוקינטית ומאפשרת ניתוח כמותי של שינויים בחלבון בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לפ' לוין, ס' מוריה, ס' פוסטר ומ' פיניו על מתנת הזנים והנוגדנים. הם גם מודים ל-L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper ו-B. Dougherty על הסיוע הטכני המומחה. CBW נתמך על ידי מלגת מחקר בכירה של המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (571905). LT נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של ראשי UTS. MPS ו-ATFL נתמכו על ידי פרסי התואר השני האוסטרלי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט גילוי של מועצת המחקר האוסטרלית (DP120102010) ל-EJH.

<ol><li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+j%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103(2007).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li>
<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+modulated+excitation+microscopy%3A+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+SPIE+3568%22%5BJournal%5D)">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li>
<li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li>
<li>Urban, N. icolai T., Willig, K. atrin, Hell, S. tefan W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li>
<li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biol%22%5BJournal%5D)">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389(2012).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li>
<li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li>
<li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li>
<li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li>
<li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li>
<li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., & Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
</ol>

פרסום זה ממומן על ידי GE Healthcare.

הדמיה לחיות תאי ניאון היא כלי רב עוצמה המאפשר תצפית של שינויים דינמיים בתוך תאים לאורך זמן. ההדמיה חיה של ביולוגיה של תא חיידקים הייתה מאתגרת בגלל גודל התא הקטן ומקטינה את היכולת של תאי חיידקיים לעמוד חשיפה חוזרת ונשנית לאור העירור. f3D-SIM הרחיב את הכלים העומדים לרשות לחקור את כל הביולוגיה של התא, אך יש צורך לבצע בזהירות בטכניקה זו כפי שניתן הציגו ממצאים אם ייושמו בצורה גרועה. ישנם מספר שיקולים החשובים לשימוש המוצלח של טכניקה זו. כפי שהוא שיטת דימות פלואורסצנטי רחב בתחום שמסתמכת על השימוש בפונקצית נקודת ההתפשטות של אור הנפלט, חוסר התאמת מקדם שבירה וסטייה כדורית של האור הנפלט יש להימנע כדי לאפשר שחזור תמונה מדויק. השימוש בcoverslips של 0.17 מ&quot;מ עובי של באיכות גבוהה, כדי למנוע וריאציה של עוצמת אות בשל השתנות עובי זכוכית בכיסוייםשפה מומלצת מאוד. זה חשוב באופן קריטי על מנת להעריך בזהירות את האברציה הכדורית של האור הנפלט בשלבים הראשונים של כל הניסויים ולהתאים את מקדם שבירת שמן טבילה לפי צורך. זה עשוי להשתנות מיום ליום כפי שהוא תלוי בשני הטמפרטורה ומדיה / מצע ההרכבה של המדגם. השימוש בשמן לא נכון יגרום לשחזור נחותים של התמונות עם חפצים כגון הילות ואותות הד. בסופו של תהליך שחזור התמונה, לכל שלב ניתן לקבל מדד לאיכות של השיקום על ידי &quot;ההתאמה הטובה ביותר עבור זווית Ko&quot; לכל שלב / זווית של התאורה. אם ערך זה הוא מתחת ל -1 לכל זווית, ולאחר מכן את האיכות של משוחזר תהיה ככל הנראה להיות גבוהה. אם ערך זה הוא מעל 6, שזה סביר להניח כי התמונה המשוחזרת תכיל חפצים. חפצים נפוצים כוללים אני) את המראה של פסים בתמונה שמתאימהלאחד מהזוויות של הרשת. זה יכול לנבוע מאות נמוכה יותר מזווית הרשת ש; ii) אפף סביב מבנים. זה יכול לנבוע מרמות מאוד לא אחידות של אות ממבנים בהירים בהשוואה למבנים שמסביב, חוסר התאמה של מקדם שבירה של הנפט והמדגם או יכול להיות בגלל המבנים בתמונה להיות אמורפי מדי ולא מכיל &quot;מבנה&quot; מספיק כדי להיות מוכר על ידי האלגוריתם; iii) &quot;כוורות&quot; שנובעת מאות נמוכה יחס רעש בתמונה, בדרך כלל עקב אות רקע גבוהה; iv) מבנים שנמתחים / מוארכים בXY שיכולים להיות בגלל חוסר ההתאמה מקדם שבירה של שמן ומדגם. חפץ זה קשה להבחין למשתמש לא מנוסה. מומלץ כי משתמשים חדשים להתייעץ חוקר SIM מנוסה לקבלת ייעוץ על פרשנות תמונה וניתוח כאשר מתחילים להשתמש בטכניקה זו. כמו בכל ניסויי ההדמיה לחיות תאי הניאון, זה יבואנמלה לאזן בזהירות את קלט אנרגיית עירור על מנת למזער את מידת photobleaching וphototoxicity של התאים עם אות פליטה מספיק צריכה לשחזר תמונות עם חפץ מינימאלי. photobleaching מוגזם (יותר מ 30% על פני רכישת z-ערימה אחת) יוביל לדפוס פיזור בתמונה המשוחזרת. עם השימוש במצלמות sCMOS, תמונות ברזולוציה סופר ניתן לשחזר בהצלחה מתמונות גולמית עם אות פליטה נמוכה כמו 1,000 ספירות מעל רקע. זה יכול לאפשר לזמני חשיפה קצרים מאוד ובכך להפחית photobleaching ומאפשרים לכידה מהירה לכל מסגרת. זה גם מגדיל את כמות הזמן בין מסגרות לתאים להתאושש מהשקעת אנרגית עירור. בנוסף, ככל שזמן הלכידה לכל מסגרת בודדת יכול להיות קצר מאוד, התואר של חפץ שהוצג על ידי &#39;תנועה לטשטש&#39; במהלך לכידת פרט מצטמצם עם השימוש בשיטה זו. זה Variני של 3D-SIM מציע מספר יתרונות אחרים על פני טכנולוגיות סופר זמין והדמיה ברזולוציה גבוהה אחרות הדמיה חיה על ידי ביולוגים תא חיידק. העלייה של 2 הקיפול ברזולוציה בכל 3 הממדים ויכולת תמונה עד 30 מיקרומטר למדגם מאפשרים הדמיה של תאי חיידקים (ויונקים) שלמים במהלך ניסוי. טכניקות כגון לוקליזציה מולקולה בודדת המבוצעות בדרך כלל בגל החולף לא יכולות להשיג את עומק החדירה לתוך מדגם ולא מציעות מידע על כל תאים. התקדמות שחל באחרונה, המאפשרות עומקי דגימה גבוהים יותר לטכניקה זו עלולה לגרום לרזולוציה צירית טובה יותר של תאים שלמים. בנוסף, טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת שדורשות אלפי תמונות גולמיים שתירכשנה גם הם מוגבלים במסגרת השיעור שניתן ללכוד ועשויה לדרוש פשרה בין מסגרת שיעור לכידה והרזולוציה מרחבית השיגה האולטימטיבית, כרזולוציה מרחבית תלויה ב מספר ערבNTS נרשם בתוך מרחב מוגדר. הפחתת מספר המסגרות שנתפסו תגרום לרזולוציה מרחבית נמוכה יותר אבל עשוי להיות מספיק כדי להשיג את הרזולוציה של הזמן דרוש לתהליך הביולוגי של עניין. זמן התאוששות בין המסגרות עשוי גם צריך להיות מוגבר על מנת למזער phototoxicity בתאים חיים וכך להגביל את המשך ותדירות שבה ניתן להשיג בזמן סדרה. טכניקות ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) או אלקטרונים cryotomography (ECT) הצעה עלו ברזולוציה מעל 3D-SIM (ושיטות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה הסופר אופטיות) אך חייבת להתבצע על דגימות קבועות. התיקון והעיבוד עשוי להציג את הממצאים וחוסר התיוג עלול להפוך פרשנות קשה. יש ECT ללא תווית ניגוד עני ויכול להשיג מעמקי חדירת מדגם של כ 500-200 ננומטר 24, כך שגם אם החלבון של עניין ניתן לזהות, את המבנה של החלבון בתא חיידק שלם לא יכול להיות שנצפה.גם כאשר תיוג יכול לשמש בEM, כגון עם immunogold, ההדמיה מתבצעת רק ב2D. 3D הוא בר השגה רק עם חתך דק ושחזור ממוחשב של החתכים. חתך הדק דורש טכנאי מנוסה אבל יכול להיות בעייתי ולגרום לחפץ. עם תאי חיים או קבועים, 3D-SIM אינו צריך להיות מוטבע באופן ספציפי ותאים יכולים להיות מוכנים במהירות להדמיה במצב טבעי קרוב. שיטה זו היא קלה יחסית ליישום על ידי חוקרים בעלי ניסיון מינימאלי במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לבצע ניסויים בתקשורת שתומכות בתפקוד תא בריא, כל עוד זה לא לזרוח או ליצור אות רקע שלא לצורך. לתאי חיידקים, זה יכול לאפשר את השימוש בסוגים רבים של מורכבות ותקשורת מינימאלית או השימוש בתקשורת מוצקה או חצי מוצק לשלוט תנועתיות תא חיידק. ביולוגים רבים שכבר מהונדס חלבון פלואורסצנטי (FP) איחודים ובדק את הפונקציונליות שלשילובים אלה יכולים לקחת עד טכנולוגיה זו במהירות ללא הנדסה ואימות עם שילובי FP photoactivatable חדשים נוספות. מצאנו, כהתבוננות כללית, שס aureus היה רגיש יותר לphotobleaching במהלך הדמיה עם שילובי FP מאשר ב &#39; subtilis. תוך שימוש בשיטות שלנו המקוריות 3D-SIM, שבו דפוס הרשת נוצר על ידי צורם פיזי, לא הצליחו לבצע הדמיה תא חי עם מספר של ס &#39; שילובי aureus FP. עם זאת, עם שיטת f3D-SIM מתקדם זה, היינו יכול תמונת איחודי FP אלה ולבצע סדרת זמן קצרה כדי ללכוד את הדינמיקה של חלבונים המתויגים אלה. זוהי ככל הנראה בשל זמני חשיפה המופחתת דרושים להדמיה והגדילו זמן בין מסגרות להתאוששות תא. OMX Blaze 3D-SIM הוא טכנולוגיה זמינה מסחרי שיכול להיות יחסית קלה ליישום במעבדה בודדת או מתקן הדמיה ליבה. יש להקפיד לבצע את הטכניקה כדי למנוע Artiעובדות בשל הכנת מדגם עניה או לכידת תמונה ירודה. ברגע שהטכניקה היא שולטת, מחקרים של מבנה חלבון ודינמיקה באורגניזמים קטנים כגון חיידקים יכולים להתבצע בקרינה בודדת או מרובי צבעים.

מספר טכנולוגיות הדמיה שונות שימש במשך השנים ללמוד חיידקים כוללים אלקטרונים שונים וטכניקות מיקרוסקופיה אופטיות. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מציע רזולוציה גבוהה ביותר, עד לננומטר, את הצורך בואקום ושימוש בחומרי ניגוד מוגבל בטכניקה זו כדי דגימות קבועות ומוטבעות. יכולים גם להיות הציגו חפצים בשל הכנת מדגם ארוכה ויש צורך ברופא מיומן כדי להכין את הדגימות, וכדי לנתח ולפרש את התמונות וכתוצאה מכך. מיקרוסקופיה אופטית מציעה את היתרונות של הכנת מדגם פשוט והיישום של תוויות מרובות בקלות יחסית בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים. שימוש בחלבוני ניאון וconjugates צבע, היכולת ללמוד תאי חיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא גם אפשרי. עם שיפורים ביציבות בfluorophore וגודל / מבנה חלבון פלואורסצנטי המוביל לירידה ברעילות תאים, כמו גם התקדמות בtechn זיהוי מצלמהology, מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות שדה רחב ומערכות הדמיה confocal הרחיב באופן משמעותי את ההבנה של הדינמיקה המרחבית של תאים שלנו. שימוש בשיטות אלה, הידע שלנו על תא חיידק -20 השנים האחרונות התקדם מאוד להשקפה הרבה יותר מפורטת שמגלה רמה גבוהה של ארגון מבני וחלבונים בתוך תא חיידק 1. עם זאת, בשיטות מקובלות של מיקרוסקופיה אופטית הן עקיפה מוגבל, מה שאומר שהרזולוציה הטבועה היא כמחצית מאורך הגל של אור העירור משמש. כתוצאה מכך, אפילו עם מערכת מיקרוסקופיה אופטית הקונבנציונלית האופטימלית ביותר, ברזולוציה הרוחב הטובה ביותר הוא על 220-250 ננומטר והרזולוציה הצירית היא כ -500 ננומטר (לסקירה ראה Schermelleh et al. 2). לביולוגים של תא חיידקים בפרט, זה עדיין מגביל את ההבנה של הארגון המרחבי של תאים הזעירים אלה שלנו; להיות 1-2 מיקרומטר רק בקוטרeter ו1-10 מיקרומטר באורך. יש גם צורך בטכניקות ברזולוציה גבוהה יותר שניתן לבצע על תאי חיים שבו התנהגות מרחבית דינמית של חלבון יכולה להיות מנותחת על מנת להשלים בנתונים חוץ גופית. במהלך העשור האחרון, מספר טכניקות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה הסופר פותחו. מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מתארת ​​טכניקות הדמיה שכפולות לפחות הרזולוציה לרוחב השגה עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית, ובכך להתגבר על המחסום העקיפה. טכניקות אלו לתפעל את התאורה ו / או ניתוח של האור הנפלט כדי ליצור עליות ריאליות ברזולוציה הנראית לעין. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - i) מגורה מיקרוסקופיה דלדול פליטה 3 (STED); ii) מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, כולל טכניקות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation 4,5 (PALM), מיקרוסקופיה שיקום האופטית סטוכסטיים <sדלדול מדינה עד&gt; 6 (STORM), STORM הישיר 7 (dSTORM), והקרקע עם תשואת מולקולה בודדת 8 (GDSIM); וiii) מיקרוסקופיה תאורה מובנה 9-12 (SIM). טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת להציע העליות הגדולות ביותר ברזולוציה לרוחב, עד שבין 10-40 ננומטר בדגימות ביולוגיות. ביישומים רבים של מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, עומק הדגימה מוגבל לגל החולף וההטמעות הראשוניות של STED גם היו מוגבלים בעומק הדגימה. שיפורים עם זאת, ההתקדמות האחרונה כגון שימוש באופטיקה מסתגלת, ניצול של אסטיגמציה בפונקצית נקודת התפשטות במוקדים שונים, זיהוי רב מטוס ושימוש בשתי מטרות להסיק העמדה הצירית של האור הנפלט ראו בשני הצירי מעמקי רזולוציה ודגימה בשני לוקליזציה מולקולת STED ואחת 13,14. שיעורי רכישת נתונים לSTED וטכניקות לוקליזציה מולקולה בודדתגם איטיים יחסית בשל המספר הגדול של תמונות שצריכות להיות שנרכשו עבור רזולוציה מקסימלי (עד 50,000 לטכניקות לוקליזציה). רכישת נתונים איטית זה לא להשאיל את עצמה להדמיה של דגימות חיות בלי שינויים מותאמים אישית, כי הם לעתים קרובות יקרים למדי. שתי טכניקות אלה כיום בצורה אופטימלית מתאימות לדגימות קבועות (לסקירה ראה 2,15), לעומת זאת, הרבה עבודה נעשית כדי לטפל במגבלה זו. שלוש מיקרוסקופיה תאורה המובנה ממדית (3D-SIM) היא טכניקת שדה רחב המשפרת את שניהם ברזולוציה לרוחב וצירית וכתוצאה מכך החלטות של כ 110 ו280 ננומטר, בהתאמה. עומק של דגימה הוא עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשר הדמיה של כל תאים. הווריאציה של 3D-SIM שפותחה על ידי Sedat, Agard, וGustaffsson על הפלטפורמה אופטית מיקרוסקופ הניסיוני (OMX) כרוכה מאירה את המדגם עם דפוס רשת ידוע אשר עבר ל15 שוניםעמדות בכל מטוס z 9-11. השוליים בדפוסי moire וכתוצאה מכך שנוצרים בחלל תדר מחוץ לאזור הנצפה נמדדים. המידע משטח התדירות הוא המחשוב משוחזר כדי ליצור תמונה ברזולוציה סופר גלויה 10,11. המהירות היחסית שבה ניתן לרכוש התמונות גולמי באמצעות טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאי חיים. עם זאת, חשוב לשים לב כי לתהליכים ביולוגיים המתרחשים בזמן בקנה מידה של שניות, שיעור הרכישה של התמונות הגולמיים הוא עדיין איטי מדי כדי ללכוד שינויים דינמיים. זמן סדרה עם קצב לכידה של שניות ל, רכישה החוזרת ונשנית ללא זמן התאוששות מספיק יכולה להוביל לphototoxicity וphotobleaching, במיוחד במהלך ההדמיה חיה של תאי חיידקים קטנים. כדי להתגבר על בעיות אלה, ההתקדמות האחרונה ל3D-SIM המהיר (f3D-SIM) פותחו. כאן אנו מתארים אחד הידוע בשם OMX Blaze 16 שהיה אניntroduced בסוף 2011. טכנולוגיה זו יוצרת תאורה בדוגמת ללא שימוש ברשת פיזית כפי שמשמש במערכות קודמות. השימוש בהתערבות קרן אור וטכנולוגיה תריס חדש מאפשר יצירה של האור בדוגמת על המדגם באופן מהיר מאוד. המהירות של רכישת תמונה הייתה עוד יותר משופרת עם ההקדמה של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימים מדעי מצלמות (sCMOS), במיוחד בהשוואה למצלמות הקיימות EMCCD. שינויים אלה הביאו לשיעור רכישת תמונה אפשרי של מסגרת אחת לשנייה לעומק דגימה של 1 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים, 9 z-פרוסות), המאפשר ניטור של שינויים דינמיים בתוך תאים המתרחשים בתוך שניות 16. הירידה בפעמים לכאורה חשיפה (עירור) לחיות תאי שימוש בשיטה זו מאפשרת גם סדרה מורחבת זמן להיות בשבי או עלייה בשיעור הלכידה. כאן אנו מתארים את היישום של מיקרוסקופיה f3D-SIM לexaminדואר המבנה ותנועה דינמית של טבעת cytokinetic Z בתאים של שני מיני חיידקים: subtilis Bacillus אורגניזם מודל בצורת המוט והפתוגן האנושי coccoid Staphylococcus aureus. FtsZ הוא חלבון cytoskeletal כמו טובולין-שממלא תפקיד מרכזי בחלוקת תא בחיידקים 17,18. זה localizes לאתר החטיבה לגייס לפחות 20 חלבוני חטיבה אחרים, ויצר מנגנון חלוקת 17,18, והוא האמין כדי לספק הכוח לתא התכווצות 19-23. שיטה זו מגלה כי FtsZ מופץ הטרוגני סביב טבעת Z בשני אורגניזמים בהסדר כמו חרוז; פתרון השאלה האם טבעת Z היא החגורה אחידה רציפה סביב התא, כמו דמיין ידי מיקרוסקופ הקונבנציונלי רחב בתחום הקרינה, או מבנה רציף כפי שהוצע על ידי cryo-טומוגרפיה של אלקטרון (ECT) 24 הארוכה שנערך. אנו מראים כיצד היכולת של 3D-SIM בהרבה יכולה לשפר את הבחינה המרחבית של זעיר (1קוטר מיקרומטר) תאים עגולים כמו ס &#39; aureus שמחלק בשלושה מישורים ברציפות בניצב (x, y, z). מחקרי זמן לשגות תוך שימוש בטכניקות אלה מראים כי המבנה של טבעת Z הוא דינמי, עם ברוטו ארגון שינויים בתוך הטבעת, ולא מולקולות FtsZ נעו פנימה וחוצה של פיגום קבוע 24.

<table><tbody><tr><td>אגרוז I (דרגת ביוטכנולוגיה)</td> <td>AMRESCO</td><td>0710-500G</td><td>משמש לבניית רפידות אגרוז 2%. השתמש במיקרוגל כדי להמיס אגרוז במצעי גידול.</td></tr><tr><td>N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64)</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>צבע ליפופילי המשמש לצביעה של קרומי תאים.</td></tr><tr><td>מיקרו-שפופרת 1.5 מ"ל, בוגר Natural</td><td>Scientific Specialties Inc.</td><td>1210-00</td><td>עשוי מפוליפרופילן הומופולימר, המשמש לקצירת תאי חיידקים לפני הנחתם על רפידות אגרוז להדמיה.</td></tr><tr><td>בסיס מרק לוריא, מילר</td><td>BD</td><td>241420</td><td>מוכן לפי הוראות היצרן. יש להוסיף 2% אגרוז לאחר חיטוי.</td></tr><tr><td>מרק בדיקת אנטיביוטיקה BBL, מדיום אנטיביוטי 3</td><td>BD</td><td>210932</td><td>מוכן לפי הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>מסגרת דבק</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ABGAB-0577</td><td>הידועה בשם Gene Frame עם חברה זו. משמש להכנת רפידות אגרוז 2% (מידות: 15 על 16 מ"מ).</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>111512-9</td><td>22 x 22 No. 1 עובי</td></tr><tr><td>צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תחתית כיסוי זכוכית</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>FD35-100</td><td>הידוע בשם FluoroDish עם חברה זו. מנה: ואוסלאש; 35 מ"מ, זכוכית: ואוסלאש; 23 מ"מ, עובי זכוכית: 0.17 מ"מ,</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0378-25G</td> לא פירוגני <td>הכינו מלאי של 10 מ"ג/מ"ל באתנול 95%.</td></tr><tr><td>לינקומיצין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>L6004-5MU</td><td>הכינו מלאי של 25 מ"ג/מ"ל ב-50% אתנול.</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Boehringer Mannheim GmbH</td><td>12390120-14</td><td>הכינו מלאי של 10 מ"ג/מ"ל באתנול 95%.</td></tr><tr><td>אמבט מים רועד מסלולי / ליניארי משולב</td><td>Grant Scientific Instruments</td><td>OLS-200</td><td>מהירות טלטול המשמשת לתרביות: ספקטרופוטומטר UV גלוי 215 סל"</td></tr><tr><td>ד</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1601</td><td>אורך גל של 600 ננומטר שימש למדידת צפיפות אופטית של תרביות חיידקים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>כדורי תרבית חיידקים הושגו על ידי סיבוב תרביות גידול אקספוננציאלי באמצע 8,000 סל"ד למשך 30 שניות.</td></tr><tr><td>איזופרופיל &בטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td>הכן 1 M ציר ומסנן לעקר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>תוכנת softWoRx</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td>גרסה 5.0</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים Imaris</td><td>Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td><td>גרסה 7.0.0</td><td>Matlab XTensions כללה</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה DeltaVision OMX 3D-SIM המצוידת במודול Blaze.</td>מודול <td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td></td><td>Blaze מותקן על</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף</td><td>OMX V3 Zeiss Axioplan 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה ברזולוציה סופר של cytokinetic z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-structured 3d מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3d-sim)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

הדמיה של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי התקדמה באופן משמעותי בטכנולוגיות חדשות כדי להתגבר על מחסום הרזולוציה של דיפרקציה של אור המאפשר רזולוציה סופר של דגימות חיות. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - דלדול פליטה מאולץ (STED), מיקרוסקופיה מולקולה בודדת לוקליזציה (כולל טכניקות כגון PALM, STORM, וGDSIM), ומיקרוסקופיה המובנה תאורה (SIM). בעוד טכניקות לוקליזציה-מולקולה בודדת STED ולהראות העליות הגדולות ביותר ברזולוציה, הם היו איטיים יותר מה להציע מהירויות מוגברות של רכישת תמונה. SIM תלת ממדי (3D-SIM) הוא טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב שמציעה מספר היתרונות על פני שתי לוקליזציה מולקולה בודדת וSTED. רזולוציה משופרת, עם רזולוציות טיפוסיות לרוחב והצירי של 110 ו280 ננומטר, בהתאמה ובעומק של דגימה של עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשרתהדמיה של תאים שלמים. הפיתוחים אחרונים (מהיר 3D-SIM) בטכנולוגיה להגדיל את שיעור הלכידה של תמונות גולמיים מאפשרים לכידה מהירה של תהליכים ביולוגיים המתרחשים בשניות, תוך צמצום צילום רעילות וphotobleaching משמעותי. כאן אנו מתארים את השימוש בשיטה אחת כזו לתמונת תאי חיידקיים מחסה חלבון fluorescently שכותרת cytokinetic FtsZ להראות כיצד תאים מנותחים והסוג של מידע ייחודי שטכניקה זו יכולה לספק.

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לצפות בשינויים הדינמיים בחלבון FTSZ במהלך חלוקת תאים בחיידקים. דבר זה מושג על ידי הנחת תאי bacillus subtles המבטאים את היתוך FTS GFP על פניו של פד אגרוס (aros pad) קטן. לאחר מכן הפד נהפך ומועבר לצלחת פטרי בעלת תחתית של לבישת זכוכית.השלב השני הוא רכישת תמונות time-lapse של החיידקים במהלך חלוקת התא באמצעות מערכת דימוי 3D structured illumination microscopy או 3D SIM. לאחר מכן, נבחנת איכות הנתונים הגולמיים ותמונות עם ירידה בעוצמה של יותר מ-30% עקב photobleaching נפסלות. השלב הסופי הוא ניתוח כמותי של השינויים בלוקליזציה של החלבון במהלך חלוקת התא על ידי מדידת התפלגות עוצמת הפלואורסצנציה של חלבון F-T-S-Z-G-F-P לאורך זמן.בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-3D SIM מהיר כדי להראות עד כמה חלבוני ה-dione דינמיים במהלך חלוקת תאים בחיידקים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שמתקבל מידע תלת-ממדי על השינויים המתרחשים בחלוקת תאים בתאים חיים. אף ששיטה זו מספקת תובנות לגבי ציטוקינזיס חיידקי, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות שבהן נרצה לבחון שינויים דינמיים בחלבונים, כגון תאים של יונקים (M mammalian cells).הרעיון הראשוני לפרוטוקול זה עלה כאשר ראינו שבתמונות סימולציית תלת-ממד מסורתיות של תאי חיידקים מקובעים, חלבון ה-FDZ לא היה מפוזר באופן הומוגני סביב טבעת ה-Zed. רצינו לבחון לעומק האם התפלגות זו קשורה לשינויים המתרחשים במהלך התכווצות טבעת ה-Zed. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה הזו עלולים להיתקל בקשיים עקב אי-התאמה בין מקדם השבירה של השמן לדגימה, דבר שיוביל לתמונות באיכות נמוכה.כדי להכין תאי bacillus subtilis לדימוג, גדלו את התאים עד לשלב האקספוננציאלי המוקדם כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הצמידו מסגרת דביקה לעלית זכוכית סטנדרטית של מיקרוסקופ על ידי הסרה תחילה של יריעת הפוליאסטר הדקה. לאחר מכן, הצמידו את משטח הדבק החשוף של המסגרת לפני השטח של עלית המיקרוסקופ כדי ליצור למעשה באר ריבועית על גבי העלית; השאירו את יריעת הפוליאסטר העבה מחוברת למסגרת כדי למנוע הידבקות של זכוכית הכיסוי בשלבים הבאים.בשלב הבא, המיסו תמיסת aro במיקרוגל עד לרתיחה, והעבירו בעזרת פיפט 67 µL מה-aros המומס אל תוך המסגרת הדביקה. הניחו מיד זכוכית כיסוי מעל ה-aros כדי ליצור משטח שטוח, והשאירו בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. הסירו את זכוכית הכיסוי למשך דקה עד שתיים בזמן איסוף הדגימה.אספו מנת עבודה של 1 mL מהדגימה לאחר סבוב בצנטריפוגה ב-8,000 RPM למשך מספר שניות, שפכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-200 µL של מצע טרי. קחו 2.5 µL מהדגימה המרוכזת וטפטפו בעזרת פיפטה על פד aros שהוכן מראש. פזרו את הדגימה באופן שווה לאורך השטח השטוח של פד ה-aros.לאחר מכן, הסר את מסגרת הדבק מהזכוכית של המיקרוסקופ באמצעות פינצטה, ללא מגע עם פד ה-aros. העבר את פד ה-aros מהזכוכית של המיקרוסקופ אל צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר בעלת תחתית של זכוכית כיסוי.לצילום ברזולוציה גבוהה. הפוך את ה-aros pad כך שת сусפנזיית התאים תהיה במגע עם הזכוכית של צלחת הפטרי. ביום הניסוי, הפעל את מערכת הדימוג OMX 3D SIM לפחות שעה אחת לפני הצילום כדי לאפשר למערכת וללייזרים להתייצב באופן מלא.לאחר מכן, הפעל את הרכיבים השונים כפי שמופיע בפרוטוקול הטקסט בתחנת העבודה של בקר המערכת (master controller workstation). פתח את תוכנת ה-OMX על ידי לחיצה על האייקון. הגדר את נתיב השמירה של הקבצים לתיקיית נתונים מתאימה.בשלב הבא, הפעילו את תוכנת soft work. הדליקו במסך הראשי, במדור פרמטרי האור (light parameters), את הלייזרים הדרושים לניסויים. הפעילו את מצלמת ה-FITC מבחירת הערוצים (channel selection) והמשיכו בבדיקת הפרמטרים כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב.יש להניח טיפה של שמן על קצה העדשה של העדשה אובייקטיבית. יש להניח את צלחת הפטרי של הדגימה המכילה את התאים שהוכנו בתוך תושבת הבמה ולכסות במכסה החימום העגול. יש להוריד את הבמה עד שהשמן נוגע בתחתית צלחת הפטרי של הדגימה.אפשרו לצלחת להגיע לשיווי משקל תרמי למשך 15 דקות. בשלב השימוש בהגדרת חשיפה נמוכה, התמקדו בדגימה באמצעות בקרים של במה למיקום ננומטרי. בצעו פוקוס למעלה ולמטה דרך הדגימה כדי לקבוע אם האור מפוזר באופן שווה מעל ומתחת למישור המוקד של הדגימה. לאחר מכן, השתמשו בגדלי צעד של 0.5 מיקרון וסמנו את החלק העליון והתחתון של ערימת התמונות לפני החזרה למרכז הדגימה. בלשונית הניסוי, לחצו על כפתור קבלת העובי (get thickness) כדי להגדיר את עובי הרכישה של הדגימה.קבעו את ערך העוצמה המקסימלי של תמונת הדגימה בהגדרות החשיפה ואחוז אור המעבר הנוכחיות. ערך זה מופיע מתחת לחלון התמונה. עבור דימוי time-lapse, התאימו את החשיפה ואת אחוז אור המעבר כדי להגיע לעוצמה מקסימלית של 1100 עד 1400.מעל לרקע. עבור התמונה, הפעילו את סעיף הצילום במרווחי זמן (time lapse) בלשונית הניסוי. הגדירו את קצב הפריימים הנדרש ואת הזמן הכולל בקובץ הנתונים.הזינו שם קובץ מתאים. לחצו על כפתור ההפעלה (run) כדי להתחיל ברכישת התמונה בתחילת תהליך רכישת התמונה. רשמו את ערך העוצמה המקסימלית של התמונה בתחילת רכישת התמונה עבור הפריים הראשון של סדרת הזמן.בסיום רכישת הפריים הראשון, ודא שלא חלה ירידה של יותר מ-10% בעוצמת האות דרך ה-Zack עבור פריים ראשון זה. בסיום רכישת סדרת הזמנים, פתח את קובץ התמונה הגולמי שהתקבל עם סיומת DV ובדוק את הירידה בעוצמת האות המקסימלית מתחילת סדרת הזמנים ועד לתמונה האחרונה. הסר כל נקודת זמן שבה חלה פוטו-דהייה (photo bleaching) של יותר מ-30% מתפריט התהליך (process menu), והפעל את חלון שחזור ה-SI.השתמש בהגדרות הקיימות עבור כל הפרמטרים. הפעל את כפתור ה-OTF הספציפי לערוץ שבו נעשה שימוש והגדר אותו למערכת המסננים הסטנדרטית. הפעל את כפתור זוויות ה-KO הספציפי לערוץ שבו נעשה שימוש והגדר אותו למערכת המסננים הסטנדרטית.גררו ושחררו את הקובץ הגולמי אל מרחב קובץ הקלט. לחצו על "בצע". בחנו את ההתפלגות של FTSZ סביב טבעת ה-Z כדי ליצור תרשימי עוצמה בתלת-ממד.לאחר מכן פתח קובץ תמונה תלת-ממדית. כדי לצפות בחתכי z בודדים, השתמש בכלי צפייה בנפח (volume viewer) הנמצא תחת לשונית תפריט התצוגה.כדי לחתוך אזור עניין, הזינו את מספר החלון עבור תמונת תלת-ממד זו לחלון הקלט (input) והזינו מספר חלון חדש שאינו בשימוש לחלון הפלט (output). כפתור בחירת האזור (select region) יהיה זמין לחיתוך טבעת Z בודדת של עניין משדה הראייה המקורי בגודל 40 על 40 מיקרון. התאימו את הציר הרצוי ואת דרגת הסיבוב בלשונית הסיבוב (rotation).לחצו על כפתור do it. גללו דרך הנפח כדי להגיע לנקודת המבט הרצויה, טבעת ה-Z. השתמשו בכלי ה-data inspector כדי להתאים את ממדי השורות והעמודות ליצירת אזור עניין (ROI) חדש סביב טבעת Z בודדת.לחצו על מרכז התמונה כדי למקם את אזור העניין (region of interest) החדש. נתוני תמונת הטקסט הם טבלה הנוצרת באופן אוטומטי ומציגה את עוצמת הפלואורסצנציה של כל פיקסל בתוך אזור העניין. לחצו על כפתור הגרף התלת-ממדי (3D graph) כדי לצפות תחילה בגרף העוצמה.לחלופין, ניתן לייצא את נתוני תמונת הטקסט על ידי לחיצה על כפתור שמירת נתוני הטבלה. בתפריט הקבצים, העתיקו את נתוני התמונה מקובץ הטקסט שנשמר אל גיליון אלקטרוני חדש. בחרו את כל התאים בגיליון וצרו גרף משטח בתלת-ממד (3D surface graph) חדש.עצב את גרף תצוגת העוצמה בתלת-ממד לצורך פרסום עבור נתוני צילום רצף (time-lapse). חזור על שלבים אלו עבור כל אחת מנקודות הזמן השונות מקובץ תמונת התלת-ממד. כאשר טבעת ה-Z מוצגת באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה רחבת שדה (widefield) קונבנציונלית, היא נראית כפס פלואורסצנציה רוחבי יחיד ב-bacillus subtles.עוצמת הפלואורסצנציה לאורך פס זה היא אחידה. תבנית הלוקליזציה מספקת תובנה מועטה לגבי הארגון המבני וההפצה של פולימרי FTS בתוך הטבעת; כאן נבחנו אותם תאים. נעשה שימוש בשיטת FAST 3D sim.סיבוב של תמונת ה-sim התלת-ממדית סביב ציר Z מאפשר ויזואליזציה של טבעת Z כמבנה טבעתי אמיתי במרחב תלת-ממדי. השיפור ברזולוציה מאפשר ויזואליזציה של ההתפלגות ההטרוגנית של FTSZ בתוך הטבעת. דוגמאות נוספות של טבעות Z ב-Bacillus שדומיינו בטכניקה זו ממחישות כיצד עוצמת הפלואורסצנציה מסביב לטבעת Z אינה אחידה לעולם.יתרה מכך, נצפו אזורים בעלי עוצמת פלואורסצנציה נמוכה מאוד או פערים. כדי לכמת תצפיות אלו, נוצרו תרשימי עוצמה תלת-ממדיים של טבעת Z. תרשימי העוצמה מראים כי כמות הפלואורסצנציה עשויה להשתנות עד פי ארבעה באזורים שונים של טבעת Z ב-bacillus subtlest.תרשימי העוצמה התלת-ממדיים מראים שהמרווחים קרובים לרמות קו הבסיס של פלואורסצנציית הרקע, וזאת כדי לנתח את השינויים הדינמיים המתרחשים בתוך טבעת ה-Z. לאורך זמן, מבוצע צילום time-lapse ב-3D sim. סרטון זה מראה כיצד FTSZ בתוך טבעת ה-Z של bacillus subtle משתנה ללא הרף, והדבר נמדד באמצעות תרשים עוצמה שנוצר עבור כל תמונה.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מגדלים ומכינים תאי חיידקים, כיצד לצלם אותם באמצעות 3D Sim, כיצד לנתח אותם כדי להפיק נתונים כמותיים, ולבסוף, כיצד לספק תמונות באיכות המיועדת למצגות. במהלך רכישת התמונות, חשוב מאוד לעקוב אחר בריאות התאים וכן לנטר את רמת הביטוי של החלבון הפלורסצנטי במהלך הרכישה לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים אחרים בתחום הביולוגיה של תאי חיידקים להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה גבוהה (super resolution) ולממקם חלבונים בקטריאליים אחרים באורגניזמים שונים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע סוגים אחרים של מיקרוסקופיית רזולוציה-על, כגון מיקרוסקופיית לוקליזציה מופעלת-פוטונית (PALM), כדי לבחון שינויים דינמיים בחלבון ה-FDS לאורך זמן.

super-resolution-imaging-cytokinetic-z-ring-live-bacteria-using-fast

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים מרחביים, המאפשרת ההדמיה של קוצים הדנדריטים בודדים עם פירוט משופר.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

מאמר זה מספק מדריך מעמיק להרכבה ותפעול של מיקרוסקופ תאורה מובנה הפועל עם תאורה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF-SIM) כדי לדמות תהליכים ביולוגיים דינמיים עם רזולוציית על אופטית במספר צבעים.

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

כאן נתאר שיטת photobleaching כדי להפחית את autofluorescence של כחוליות. לאחר photobleaching, שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ משמשת כדי לקבל תמונות סופר-ברזולוציה תלת מימדי של הטבעת FtsZ cyanobacterial.

Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לדמיין ולמדוד טבעות אקטין ורכיבים אחרים של השלד התקופתי של הממברנה של המקטע הראשוני של האקסון באמצעות נוירונים היפוקמפליים חולדה מתורבתת ומיקרוסקופיית תאורה מובנית 3D (3D-SIM).

תכונות מדידה של השלד התקופתי של הממברנה של המקטע ההתחלתי של אקסון באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית בתלת-ממד (3D-SIM)

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

חקור את הדינמיקה של חלבון FtsZ במהלך חלוקת תאים בחיידקים באמצעות מיקרוסקופיית f3D-SIM. שיטה זו מספקת תובנות תלת-ממדיות לגבי מבנה טבעת Z הציטוקינטית ומאפשרת ניתוח כמותי של שינויים בחלבון בזמן אמת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

גלה סרטונים נוספים