Name: ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו לנתח הרכב נפרון ותפקוד כלייתי בדגי זברה מבוגרים באמצעות תיוג פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה. שיטות אלו מאפשרות הערכת אנטומיה כלייתית וחקר מחלות כליה ותהליכי התחדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרס של # הפרס מענק של 5 FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו לי המממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם למסירות היוצאות מן הכלל שלהם בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, דיוניהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנה, יש לנו תארנו שיטות המאפשרות ההדמיה של רכיבי קטע נפרון בדג הזברה המבוגר. ההזרקה של conjugates dextran ניאון מאפשרת תיוג PCT מועדף בשל מאפייני endocytic של תאי אבובית הפרוקסימלי אלה 30,38. שיטה זו יכולה להתבצע עם גמישות רבה בשל קיומו של dextrans שניתן להשיג עם להקה של conjugates ניאון שונה. בנוסף, השימוש בdextrans יזין-ניתן לתקן הוא דרך נוחה במיוחד לתייג PCT מגזרים, כפי שנהלי תיוג משניים אינם נדרשים. זה מאפשר זיהוי אות פשוט יחסית והוא תואם עם הרבה מדבקות אחרות ניאון, immunolabeling, ושימוש בקווי כתב מהונדסים. תיוג phosphatase אלקליין גם מסמן את אבובית הפרוקסימלי, עם תגובתיות חזקה בPCT ותגובתיות מעט חלשה יותר בPST. לבסוף, מכתים DBA מאפשר סימון של קטעי אבובית דיסטלי, המציגים characteristic מסועף מורפולוגיה. מולקולות לקטינים שונות, אשר מחייב חלבוני סוכר ממוצא nonimmune, נעשו שימוש נרחב להבחין מגזרי נפרון היונקים 47. זה מעניין, כי DBA בדג הזברה בקורלציה עם מגזרי אבובית דיסטלי, כפי שהוא מנוצל לציון צינורות איסוף בכליות של יונקים 47. יחדיו, יכולות להיות מנוצלים בשיטות אלה בצירופים שונים כדי לתעד הרכב ובתפקוד כליות. מאחר וכל השיטות הללו ניתן להשתמש בתכשירי כליה שלמים, הם מספקים כלים להערכת מבנה נפרון ותפקוד לאורך האיבר ללא כל הסתמכות על השימוש של יותר זמן רב, שיטות מייגע, למשל, עבודת cryosection וimmunolabeling. עם זאת, הכתמים מתוארים במאמר זה הם שיטות קיימא בcryosection. ניתוח cryosection מייצר דגימות (בהשוואה להר שלם) שהם מתאימים יותר לאימונוהיסטוכימיה כדי לזהות pepti הספציפיdes, אם כי כמובן זה סוג של ניתוח דורש הזמינות של נוגדנים ראשוניים מתאימים. למרבה הצער מגבלה העיקרית אחת בעבודה עם מודל החיה דג הזברה נשארת עניה הזמינות של נוגדנים. כך המאחלים נשאר בשימוש נרחב ביותר, כלומר, &#39;ללכת ל, &quot;הליך לניתוח של ביטוי גנים. מאחל באמצעות תגובות מצע BCIP, NBT, ו / או INT לייצר משקעים סגולים או אדומים אינו תואם עם מכתים ניאון על cryosections. אפשרות אחת תהיה להפעיל את השימוש בזיהוי מאחלי ניאון, הליך שעבר אופטימיזציה עבור דגימות עוברי דג הזברה ויכול להיות מותאם לשימוש עם הכליה הבוגרת. התיאור של השיטות במאמר זה וידאו צריך לאפשר לניסויים נוספים עם טכניקות כמו מאחלי ניאון בשילוב עם קווי דג הזברה מהונדסים שבו קטעים בודדים מסומנים עם כתב כגון eGFP או mCherry. לחלופין, השיטות שתוארו כאן could להיבדק בשילוב עם צבעים אחרים חיוניים, למשל, לקטינים אחרים. לפיכך, הסתגלות והרחבת השיטות שתוארו כאן עוד יכולים להיות מופעלת כדי שיתאימו לצרכימים של החוקר להכנות הר שלמים בכליות וניתוח. ככזה, יש להם שיטות אלה פוטנציאל רחב ליישום עם מודל דג הזברה ללימודי התחדשות מתמשכים וגם בדוגמנות מחלה גנטית. יש צורך דחוף במחקר חדשני וטיפולים לייסורי כליות. מיליוני אנשים סובלים מצורה כלשהי של מחלת כליות בכל שנה כתוצאה מגורמים מולדים, אקוטיים, ו / או כרוניים. יתר על כן, השכיחות של מחלת כליות ממשיכה לעלות ברחבי העולם, מה שהופך את המחלות הללו נושא בריאות הציבור עולמי 14,15. טיפולים כגון המודיאליזה זמינים לפי מכונת דיאליזה חיצונית משמשת ללהיפטר הדם של מטופל של פסולת מטבולית אם הכליות שלהם אינן מסוגלות לבצע את התפקיד הזה. לרוע המזל, יש התערבות זו מגבלות, כטיפול מתמשך הוא הכרחי להישרדות. יתר על כן, חולי סופו של דבר דורשים השתלת כליה, אשר יכול לקחת שנים כדי לקבל פעם במטופל שוכבים על waitlist. גם לאחר קבלת להשתלת כליה, חולים רבים סובלים מתופעות לוואי כתוצאה מההליך וחייבים לקרב את ההשפעות הללו לשארית חייהם. קשיים אלה מדגימים את הצורך הרציני לפיתוח טיפולים חדשניים לאו לסייע במניעת מחלת כליות או כדי להגדיל את התחדשות רקמות 8,16,52,53 אולי. בהתחשב במגבלות האתיות הברורה של השימוש במבחן בבני אדם במעבדות ביו, מודלים של בעלי החיים הם חיוניים למחקר של היווצרות מחלה אנושית ועבור הבדיקות של טיפולים חדשים. כתוצאה מהדמיון האנטומי שלה וקרבה אבולוציונית, העכבר הפך המודל הנפוץ ביותר של מחלות בבני אדם 45. עם זאת, יש מגבלות מסוימות עם בעל חיים זה, including חוסר יכולת לחזות התפתחות איבר בגוף חי ומעשיות של השלמת מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. דג הזברה הוא אורגניזם מודל רלוונטי ושימושי ללימוד פיתוח איבר ומודלים למחלות אנושיות 45,46. בכל הקשור למחלות של בני אדם, homologs התפקודי בדג הזברה קיים עבור כמעט 70% מכל הגנים האנושיים 54,55. מחקר שנערך לאחרונה הדגיש את התועלת של דג הזברה לתחומים רבים של 31,37,56 מחקר כליות. מחקרים של התחדשות ותיקון בדג זברה לאחר AKI מצביעים על כך שהתחדשות אפיתל אבובית וneonephrogenesis הם שני תהליכים המתרחשים וחפיפה לאורך כל ההתחדשות timecourse 30,37. השימוש בגנטמיצין נקרא האנטיביוטיקה aminoglycoside נוצל כפרדיגמה פציעה אשר דרך ללמוד את התוצאות של AKI ב29,30,37 דג הזברה מבוגר. במהלך פציעה כשני שבוע תקופה שלאחר מגנטמיצין, טובול פרוקסימליes להתחדש, ובינתיים nephrons החדש להיווצר בכל רחבי האיבר 29,30,37. באופן כללי, המנגנונים המווסתים את התחדשות אפיתל יישארו שנויים במחלוקת. במנגנון מוצע אחד של תהליך התיקון, יש אירוע פציעה אקוטית הראשוני ואחריו השלת תאים מתים לתוך לומן. בשלב הבא, יש סדרה של דה בידול, התפשטות, ואירועי הגירה, לאחר שתאים חדשים לבדל, אכלוס מחדש את הקרום במרתף נפצע ושחזור פונקציה לאתר נפצע. לחלופין, מחקרים אחרים הראו כי תאים חלופיים נובעים מתאי גזע / אב המתגוררים בתוך צינוריות נפרון. באשר לתהליך של neonephrogenesis בדג זברה, אגרגטים הסלולר נצפו AKI הבא על ידי הזרקת גנטמיצין 29,30. אגרגטים אלה מאוחר יותר יבשילו לnephrons החדש שאנך לצינוריות כבר קיימות 29,30. החוט המקשר, המאחד התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis הוא גורם המסתורין המוחלט שלהם: כיום יש באופן אקספוננציאלי יותר שאלות על איך מעללי משובי הללו מתרחשים מאשר יש תובנות זמינות. עד כה, עם זאת, כמה שורות מרגשות של ראיות תומכות ברעיון שמחקר התחדשות כליות באמצעות דג הזברה אכן יכול לספק תובנות השוואתיות רלוונטיות לAKI האנושי שיכול להיות גם 56-58 פוטנציאל translational ישיר. הקרנה כימית לזהות מולקולות קטנות המגבירות את השגשוג של תאי אב כליות בעובר דג הזברה, הביא לאחרונה לזיהוי -butanoate מעכב deacetylase היסטון מתיל-4 (phenylthio) (m4PTB) 56,57. מנהל של תרכובת זו לזחלי דג הזברה עם AKI-Induced גנטמיצין גילה כי הישרדות זחל גדלה ושהשגשוג צינורי הכליות היה משופר 56,58. כאשר עכברים עם AKI-Induced איסכמיה המתון טופלו בm4PTB, ההתאוששות שלהם הואצה בassociation עם ירידה בשני מעצר הניוון ומחזור התא צינורי של תאים מתרבים צינורי כליות 58. ממצאים אלה מראים כי המסלולים אחראים להתפתחות תקינה של דג הזברה כליה ו / או תגובת משובי לאקי יהיו נשמרים עם יונקים 56. וכך, בעוד יש צורך במחקרים נוספים כדי להפריד את מנגנוני התחדשות, כלומר לזהות את מסלולי האיתות כי הם מעורבים ולהבין האינטראקציות-דג הזברה שלהם מספקת השדרה מבטיחה אחד להמשיך מטרה חשובה זו בתחום נפרולוגיה. כלים כגון תוויות תא נפרון המתוארות בפרוטוקול זה מייצגים קבוצה אחת של מבחני שיכולים להיות מנוצל כדי להעריך הרכב ופונקציונליות כליות במודלי AKI. יתר על כן, הם יכולים להיות מיושמים לאפיין מודלים מהונדסים של מחלת כליות ועשויים לספק דרכים לזיהוי תרופות כימיות מסוגלות לקדם שיקום של מבנה נפרון לאחר סכר הכליהגיל.

הכליות היא איבר מורכב המקיים מספר רב של פונקציות פיסיולוגיות בגוף. הפונקציה החשובה ביותר של הכליות היא הפרשת פסולת המטבולית, ומשימה זו כרוכה באופן הדוק עם השמירה על הומאוסטזיס נוזל. הכליות מבצעת עבודות אלה על ידי סינון הדם ויצירת שתן, ואילו במקביל ויסות לחץ דם, רמות אלקטרוליטים, ואיזון חומצה בסיס. צינוריות אפיתל מאוד מיוחדות הנקראות נפרונים לשמש כיחידה תפקודית הבסיסית של הכליות 1,2. בבעלי חוליות מבוגרות, nephrons מאורגן בדרך כלל בהסדר מותח ביותר המקיף את מערכת ניקוז מרכזית, ובכך מאפשר לצינוריות רבות לארוז לתוך האיבר קטן למדי. לדוגמא, כל כליה אנושית יכולה להכיל מעל 1 מיליון nephrons 3. יונקים אחרים כמו העכבר להחזיק על סדר 8-10,000 nephrons לכליות 4. מידת המורכבות של כליות שונות בין יונקים אלה וvert האחרebrates בשל שינויים במספר כולל נפרון והפריסה האדריכלית שלהם בתוך הכליות. מינים של בעלי חוליות בצורה רבות כמו שלושה מבנים רצופים בכליות במהלך פיתוח, וכל אחד מציג טופס הגדלת מורכבות בכל קשור לתרומת נפרון והסדר: pronephros, כליה בינים, וmetanephros. מבנה הכליות האחרון להישמר משמש ככליה מבוגרת איבר בדרך כלל כליה בינים או metanephros 2. כל טופס בכליות, לעומת זאת, יש לו הרכב מבוסס נפרון 2. נפרון הוא סוס העבודה של הכליות והוא אחראי על סינון דם יחד עם הפרשת המטבוליט וספיגה. Nephrons הם מבנים צינוריים פשוטים מורכבים מתאי אפיתל ויש לי ארגון מגזרי, שבו תחומים דיסקרטיים, מאוד מיוחדים האפיתלים מובחנים לבצע משימות ספציפיות. בצו של זרימת תסנין דרך נפרון, יש בדרך כלל שלושה חלקים עיקריים שcomprisדואר כל יחידה: (1) גופיף הכליה, (2) אבובית עם הפרוקסימלי, ביניים, ומגזרי דיסטלי, ו (3) צינור איסוף 1. אבובית הפרוקסימלי היא אחראית לספיגה החוזרת של מומסים אורגניים, בעיקר חומצות אמינו וגלוקוז 1. אבובית ביניים (או הלולאה של הנלה) היא אתר מרכזי של רגולציה מלח ומים 1. לבסוף, כוונון עדין של מלח ויונים אחרים מתרחש באבובית דיסטלי וצינור איסוף ומוסדר מאוד על ידי המערכת האנדוקרינית 1. משם, התסנין עובר דרך השופכן ושלפוחית ​​השתן, סופו של דבר לצאת מהגוף כתוצר פסולת 1. אובדן התפקוד הכלייתי יכול לנבוע ממספר רב של גורמים המונעים פעילות נפרון נורמלית. גורמים אלה יכולים להתרחש במהלך התפתחות כליות, למשל, מומים מולדים הגורמים לעיוות של nephrons 5, או גורמים מסוגים שונים של פציעה (שנובעים משני גנטי וenvironmeמקורות פתיחות opening סגירות closures). פציעות שנרכשו מסווגות רחב כפגיעה אקוטית בכליות (AKI) או פגיעה כרונית בכליות (CKD). AKI כרוך אובדן פתאומי של תפקוד הכלייתי, לעתים קרובות כתוצאה מאיסכמיה או רעלן החשיפה 6,7. ביונקים, תיקון אפיתל נפרון הוא אפשרי לאחר פציעות כגון 8, ואנשים רבים להציג שיקום מלא של תפקוד הכלייתי לאחר AKI. עם זאת, AKI קשור גם גבוהה תחלואה ותמותה שדווחו ברחבי 30 רחב - טווח שכיחות 70% 6,7. מחלת כליות כרונית, לעומת זאת, קשורה לאובדן הדרגתי של תפקוד כליות כתוצאה משנים של נזק ממושך, בדרך כלל קשור עם סיסטיק 8,9. יתר על כן, יחסי גומלין קיים בין AKI וCKD, כמו גם אחד יכול להטות מראש פרט ל10-12 האחר. לדוגמא, אלה שסבלו מAKI רגישים יותר למחלת כליות כרונית ואף למוות 13. השכיחות של מחלת כליות, גם בארה&quot;ב ובעולם, הגיעה epideפרופורציות ומיקרופון צפויים לעלות כאוכלוסייה בגילים מתרחבת-לכן יש צורך הולך וגדל לזהות התערבויות רפואת רגנרטיבית לכליות 14,15. למרות הידיעה שחולי AKI יכולים לשחזר, זה כבר זמן רב חשב כי הכליות הוא איבר ללא סמכויות משובי מולדים. השקפה מסורתית זו תוקן באופן דרמטי בשנים האחרונות 16. מחקרים חוקרים נזק כלייתי בעכברים וחולדות לאחר AKI הראו כי תאי אפיתל אבובית נפרון יכולים להתרבות ולבנות מחדש nephrons הפונקציונלי 17-20. למרות יונקים בעלי יכולת הסתגלות זה להתחדש nephrons, יש מגבלות בולטות ותגובות הסתגלות יכולה להיות מופעלות על אשר תוביל לסיסטיק כליות ומחלת הכליות כרוני 21. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי אבלציה תאי אפיתל החוזרת ונשנית בnephrons העכברי הייתה קשורה עם התחדשות מצומצמת וnephrons מרמז-סיסטיק כליות havea מוגבל סף התחדשות 22. אין ראיות לכך שהכליות של יונקים הבוגרים מהוות nephrons החדש כדי להחליף את אלה שאבדו או ניזוקו, ובכך ההרס שלהם מוביל לגירעון נפרון 8,9 קבוע. מעניין, כמה בעלי חוליות מגיבות לאקי על ידי התחדשות epithelia נפרון וגם על ידי הפקת nephrons החדש, תהליך המכונה neonephrogenesis או נפרון neogenesis 23. Neonephrogenesis מתרחש בדגים לאחר חשיפת רעלן או כריתה חלקית, ומודלי פציעה באופן הסטורי כללו את דג הזהב 24,25, אמנון 26, להחליק 27, medaka 28, ולאחרונה, דג הזברה 29,30. מתוכם, דג הזברה לספק מודל מחקר גנטי קיימא לגלות מסלולים התאיים ומולקולריים אחראים להתחדשות כליות. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים כיצד לתייג מגזרי נפרון בדג זברה מבוגרת. ידע של האנטומיה נפרון, תכונות מולקולריות,ומאפיינים פונקציונליים חיוניים למחקרי כליות עתיד מוצלחים באמצעות דג הזברה. כליות דג הזברה מבוגרת היא מבנה כליה בינים והוא מטבעו פחות מורכב במונחים של מספר נפרון וארגון מאשר מבנה metanephros מצא ביונקים בוגרים, avians, וזוחלים ביום 31 ב. עם זאת, ארגון קטע נפרון דג הזברה הוא דומה ליונקים, ותועד לראשונה בכליה העוברית מבוססת על מחקרי ביטוי גני 31-35. nephrons עובר דג הזברה מכיל מקטעים ליניארי אבובית הכוללים הפרוקסימלי אבובית המפותלת (PCT), אבובית הפרוקסימלי ישרה (PST), דיסטלי המוקדם (DE), ודיסטלי מאוחר (DL) 31-35 (איור 1). nephrons המבוגר דג הזברה יש מגזרים צינורי דומים 30,31,36,37 (איור 1). PCT יכול גם להיות מזוהה על ידי פנוטיפ פונקציונלי: תאי האפיתל בPCT ישלבו תרכובות שכותרתו fluorescently dextran (10-70 KDA בגודל) נוכחת בבמחזור, אשר שימוש בו בשתי כליות דג הזברה העוברית ובוגרות להעריך ספיגת endocytic על ידי התאים אלה אבובית הפרוקסימלי 38-41 (איור 1). הבדל אחד במגזרי נפרון בין דג הזברה ויונקים הוא שדג זברה חסר אבובית ביניים, או לולאה של Henle 30-37; מאז פונקציות מגזר זה ביונקים כדי לחסוך במים, ודג זברה הן מיני מים מתוקים בלי דחיפות להתרכז השתן שלהם, אין זה מפתיע שדג זברה חסר מגזר זה 32,33. לפיכך, הרכב נפרון הכולל נשמרת במידה רבה בין דג הזברה והכליות של יונקים 32,33. קווי דמיון אלה אפשרו דג הזברה להיות כלי מחקר יעילים כדי לחקור את הפונקציות של גנים הביעו כליות במהלך nephrogenesis התפתחותית 32-35,42 ולהדגים מחלות כליה רבות 43,44, ובכך מוסיף לרשימה המשמעותית של תנאים אנושיים שיכול להיות נחקר באמצעותדג הזברה 45,46. היום, בכליות דג הזברה מבוגרת היא מודל אטרקטיבי ללימודים השוואתיים של התחדשות כליות עקב tractability הגנטי שלו וחיך הרחבת של משאבים טכנולוגיים העומד לרשות לחקור את תפקוד גן ומסלולי איתות במין זה. מספר מחקרים השתמשו בכליה ביני דג הזברה כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות לאחר AKI 29,30,37. למחקר AKI המשיך באמצעות כליות דג הזברה מבוגרת, זה הכרחי יש שיטות מעודנות לתייג אזורי נפרון שונים ושיטות סקר פונקציונלי נפרון. מספר שיטות לניתוח בכליות מבוגר הותאמו מפרוטוקולי כליה עובריים. זריקת intraperitoneal של dextran שכותרתו fluorescently בדג הזברה המבוגר תוויות האפיתל PCT בnephrons כליה בינים באמצעות אנדוציטוזה 30, כמו בעוברי דג הזברה 38-41 (איור 1). שיטה זו נעשתה שימוש כדי visualizדואר כאשר צינוריות הפרוקסימלי חזרה את רכושם reabsorbing הבאות AKI, המאפשר הערכה אחת של פונקציה פיזיולוגית המשוחזר 30 (איור 1). תכונה נוספת של אבובית הפרוקסימלי נפרון היא שתאי האפיתל במגזר זה יש גבול מברשת 37 שמראה רמות גבוהות של פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני. לפיכך, האפיתל הפרוקסימלי יכול להיות מקומי חזותי בכליות דג הזברה מבוגרות תוך שימוש בטכניקת הקרינה מבוססת הידוע בשם (הקרינה אנזים שכותרתו) ELF- -97 47. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע מבחני ספיגת dextran ניאון 30,48 בכליות דג הזברה מבוגרות, כדי להשיג הערכה תפקודית של אבובית הפרוקסימלית ולמפות את הגודל וקווי מתאר של קטע אבובית זה. בשלב הבא, אנו מתארים טכניקות לתייג אזורי אבובית הפרוקסימלי של נפרון המבוגר עם phosphatase אלקליין תווית הניאון. שלישית, אנו מציגים בפעם הראשונה שRhodאמין מתויג הקטינים Dolichos biflorus agglutinin (DBA), אשר שימש כסמן כללי של צינורות האיסוף בכליות של היונקים 49, מסמן את המבנים צינוריים של הכליה דג הזברה מבוגרת. כDBA הוא מוציאים לצביעת phosphatase אלקליין, תוויות אלה מספקים דרך להבחין מחבת-הפרוקסימלי לעומת מתיחות מחבת-הדיסטלי של נפרון דג הזברה המבוגר באופן רחב. אורך יישום כתמי ניאון אלה בשני הר שלם וסעיפים היסטולוגית cryostat, אנו לתאם תוויות אלה עם תחומים ביטוי של גני טרנספורטר המומס כי לזהות כל מגזר נפרון. לכן פרוטוקול זה מכיל גם מדריך לנהלים שונה רקמת עיבוד להר שלם רקמות בוגרות בכלאה באתר ניתוח (לוואי) המבוססים על פרוטוקול מאחלי העובר שלנו 50. נהלים אלה יכולים להיות o משמשים בשילובים שונים (איור 2) לתיעוד תכונות מורפולוגיות ותפקודיותnephrons הכליה דג הזברה המבוגר f. כך, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים אלה ללימודי התחדשות, האפיון פנוטיפי של מודלים מחלת כליות אחרים, ואפילו בשימוש ללמוד היווצרות של הכליה מבוגרת.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>מיוצר על ידי דילול 10 X PBS במים מזוקקים.</td></tr><tr><td>1X חומר ניקוי PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 ב-1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS עם 0.05% Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% חומר ניקוי Tween-20 ב-1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>ממיסים 4% PFA (w/v) (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, Cat # 19210) ב-1 X PBS, מביאים לרתיחה על פלטה חמה במכסה אדים. מצננים ומקפיאים את המנות לאחסון במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>דפוס פינצטה דומונט #55&nbsp;</td></tr><tr><td>מגלשת זכוכית</td><td>תרמו-פישר</td><td>4445</td><td>כפור לבן&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 מ"מ</td></tr><tr><td>חימר דוגמנות</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>ניתן להחליף חימר דוגמנות אחר ולעבוד באופן דומה</td></tr><tr><td>מחזיק שקופיות</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>אופציונלי: מגש קרטון לאחסון שקופיות שטוחות</td></tr><tr><td>פתרון</td><td></td><td></td> <td>הלבנהנוסחת תערובת אקונומיקה (לתמיסה של 20 מ"ל): 1.6 מ"ל של תמיסת אשלגן הידרוקסיד 10% 0.6 מ"ל של תמיסת מי חמצן 30% 100 &mu; l של 20% Tween למלא עד 20 מ"ל במים מזוקקים</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td>חסימה (לתמיסה של 10 מ"ל): 8 מ"ל של 1X PBS עם 0.05% Tween 2 מ"ל סרום עגל עוברי 150 &mu; l של DMSO</td></tr><tr><td>אלקליין זיהוי פעילות פוספטאז</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>אנו משתמשים בערכת זיהוי פוספטאז אנדוגני ELF 97. להכנת תמיסת המצע העובד, יש לדלל את המצע פי 20 במאגר הזיהוי, בהתאם להוראות היצרן.</td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>שטיפת פוספטאז אלקליין</td><td>מתכון לתמיסת חיץ כביסה (לתמיסה של 100 מ"ל): 5 מ"ל של 0.5 M EDTA 120 מ"ג של Levamisole 95 מ"ל של 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, פלואורסצאין, 40,000 מגה-וואט</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>לדלל במים מזוקקים ליצירת תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל, ואחסן את הכמות במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Dextran, מפל כחול, 10,000 מגה-וואט</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>מדללים במים מזוקקים ליצירת תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל, ומאחסנים את הכמות במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>דקסטרן, צהוב לוציפר, 10,000 מגה-וואט</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>מדללים במים מזוקקים ליצירת תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל, ומאחסנים את הכמות במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>דקסטרן, טטרמתילרודמין (פלואורו-רובי), 10,000 מגה-וואט</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>יש לדלל במים מזוקקים ליצירת תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל, ולאחסן את הכמות במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA תמיסת צביעה (עבור 100 &mu; l פתרון): 1 &mu; l של DBA 99 &mu; l של 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield סט קשיח הרכבה בינונית</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית מיקרו כיסוי</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד, DMSO</td><td>ביואנליטי אמריקאי</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, תמיסה 0.5 M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הקפאת רקמות</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold ביופסיה, 10 x 10x 5 מ"מ</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 שקופיות מיקרוסקופ דבק</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>חוסם נוזלים &ndash; עט סופר PAP</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>תא לחות כתמים חיסוני</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&Trade; HM 525 קריוסטט</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-כחול GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 ערכת מסנני P-TRITC</td><td>ששימשה הייתה כדלקמן: מסנן Hoechst/DAPI שימש לזיהוי DAPI, פרופידיום יודיד, כחול מפל דקסטרן ופוספטאז אלקליין. מסנן GFP/FITC שימש לזיהוי דקסטרן-FITC, דקסטרן לוציפר צהוב ואנטי-GFP. מסנן TRITC שימש לזיהוי דקסטרן-פלואורו-רובי, PI ו-DBA.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מורכב</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter היה כדלקמן: מסנן Hoechst/DAPI שימש לזיהוי DAPI, פרופידיום יודיד, דקסטרן-מפל כחול ופוספטאז אלקליין. מסנן GFP/FITC שימש לזיהוי דקסטרן-FITC, דקסטרן לוציפר צהוב ואנטי-GFP. המסנן האדום של טקסס שימש לזיהוי דקסטרן-פלואורו-רובי, PI ו-DBA. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

מודל דג הזברה התפתח כמערכת רלוונטית ללימודי פיתוח בכליות, התחדשות ומחלה. שני כליות דג הזברה העוברית ובוגרות מורכבות מיחידות פונקציונליות הידוע בשם nephrons, אשר שמורות ביותר עם חוליות אחרות, לרבות יונקים. מחקר בדג הזברה הוכיח לאחרונה כי שתי תופעות ייחודיות להתרחש לאחר nephrons המבוגר להיגרם נזק: ראשון, יש התחדשות חזקה בתוך nephrons הקיים המחליף את תאי האפיתל אבובית נהרסו; שני, nephrons החדש לחלוטין המיוצר מאבות כליות בתהליך המכונה neonephrogenesis. בניגוד לכך, נראה שבני אדם ויונקים אחרים יש יכולת מוגבלת בלבד להתחדשות אפיתל נפרון. נכון להיום, את המנגנונים אחראים לתופעות התחדשות כליות אלה יישארו הבינו היטב. מאז כליות דג הזברה מבוגרות לעבור שתי התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis, הם מספקים סעיף ניסיוני מצטייןdigm ללמוד את האירועים הללו. יתר על כן, יש מגוון רחב של כלים גנטיים ותרופתיים זמינים במודל דג הזברה, שניתן להשתמש כדי להתוות מנגנונים התאיים ומולקולריים המווסתים את התחדשות כליות. היבט חיוני אחת של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר קבוצה של טכניקות תיוג כי ניתן להשתמש כדי לאמוד את הרכב כליות ופונקציונליות נפרון המבחן בכליות דג הזברה המבוגר. לפיכך, שיטות אלה הן נרחב החלים על האפיון פנוטיפי העתיד של פרדיגמות מבוגרות דג הזברה פגיעה בכליות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, למשטרי חשיפת nephrotoxicant או שיטות גנטיות של מוות של תאים ממוקדים כגון טכניקת אבלציה תא nitroreductase בתיווך. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הפרעות גנטיות בהיווצרות כליה מבוגרת ויכולות להיות מיושמות גם כדי להעריך את מצב כליות במהלך דוגמנות מחלה כרונית.

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את הרכב ותפקוד מקטעי הנפרון בכליות דג הזברה הבוגרות. זה מושג על ידי הזרקת דקסטרין עם תווית פלואורסצנטית לקן הקושר דגי זברה. השלב השני הוא הסרה וקיבוע של הכליה כדי להכין רקמה לשיטות התיוג הבאות.לאחר מכן, הכליה מולבנת כדי להסיר פיגמנטציה ולאחר מכן מוכתמת לסימון פלואורסצנטי של מקטעי הנפרון הרצויים. התוצאות מתקבלות באמצעות אימונופלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה ו/או הדמיית שדה בהיר המאפשרות הדמיה של אנטומיה של הכליה על סמך הכתם או הכתמים שנבחרו. שיטות התיוג הבאות יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכליות בנוגע לאנטומיה של איברים וניתן להשתמש בהן כדי לחקור את הרכב הנפרון ולהעריך את תפקוד הכליות לפני ואחרי אירוע פציעה.ההשלכות של טכניקות אלה משתרעות על חקר חריגות גנטיות בהיווצרות כליות בוגרות וניתן ליישם אותן גם כדי להעריך את מצב הכליות במהלך מודלים של מחלות כרוניות. כדי להתחיל, שפכו את התמיסה מדג מורדם והניחו בזהירות את החיה על תבנית ספוג רטובה, צד גחון. לאחר מכן, מלאו מזרק אינסולין ב-20 מיקרוליטר של תמיסת דקסטרין הפשרה.הנח את המחט כך שההחדרה תתרחש בזווית רדודה בקו האמצע הגחוני של הבטן. כדי להימנע מהזרקה קלה של האיברים, הרם את המחט מיד לאחר ההזרקה כדי להרים את דופן הגוף וליצור חלל בו ניתן להזריק את התמיסה. לאחר ההזרקה, החזירו בעדינות את הדג למיכל כדי להתאושש מההרדמה.כדי להתחיל, יש לשפוך כל תמיסה נוספת מדג מורדם ולהניח אותה על טישו או מגבת נייר. לאחר הסרת הראש והאיברים הפנימיים, השתמש במחטי חיתוך עדינות במיוחד כדי לפתוח את דפנות הגוף. אתר את איבר הכליה הנצמד לדופן הגב של החיה.השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק את הכליה מדופן הגב. הכניסו בעדינות את הכליה לבקבוקון זכוכית של חמישה מיליליטר המכיל XPBS אחד ושטפו שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת. הסר את הכליה בעזרת פיפטת העברה והנח אותה על זכוכית נקייה שקופית עם טיפה אחת עד שתיים של XPBS אחד.השתמש במלקחיים עדינים כדי לשטח את הכליה על המגלשה, וודא שאף רקמה לא התכרבלה או התהפכה על עצמה בדרך אחרת. ניתן להשתמש בכלי חוט טונגסטן לביצוע חתכים קטנים ברקמת החיבור כדי להקל על המיקום השטוח של הכליה. לאחר מכן, הניחו חתיכות קטנות של חימר דוגמנות על כל פינה של תלוש כיסוי זכוכית בגודל 18 על 18 מילימטר.הנח לאט את החלקת הכיסוי על הכליה, תוך שמירה על זווית קלה. כדי למזער את השמנת בועות האוויר, הוסף טיפה נוספת של XPBS אחד כדי למלא את הרווח בין החלקה להחלקה של המכסה במידת הצורך. קבוצה נפרדת של דגי זברה מורדמת ומושרתת בקיבוע למשך הלילה.כשהוא מוכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק בזהירות את הכליה מדופן הגוף הגבי ולהניח את האיבר בבקבוקון זכוכית. שטפו את הכליה המנותחת שלוש פעמים עם שלושה עד חמישה מיליליטר של XPBS אחד עם 0.05% טווין למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, הסר את תמיסת PBS ושטוף את הכליה בשלושה מיליליטר של תמיסת סוכרוז של 5% למשך 30 דקות.לאחר זמן זה, החלף את התמיסה בשלושה מיליליטר של 30% סוכרוז ואחסן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. הסר את התמיסה ושטוף את הכליה פעמיים לפני הוספת שלושה עד חמישה מיליליטר תמיסת הלבנה. כדי להסיר את פיגמנטציית המלנוציטים הקיימת על איבר הכליה, הניחו את בקבוקון הזכוכית על מסובב וצפו היטב כיצד הפיגמנטציה נעלמת.הסרת פיגמנטים אורכת בדרך כלל כ-20 דקות, אך לפעמים יכולה להימשך עד 60 דקות. אם תמיסת ההלבנה נשארת זמן רב מדי, עלולה להתרחש התפוררות ולכן מומלץ לעקוב אחר הדגימה כל 10 עד 15 דקות כדי לבדוק את תקינות כאשר הפיגמנטציה הוסרה משטיפת הכליות פעמיים ולדגור עם תמיסת 4% PFA למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את תמיסת ה-4% PFA ושטוף את הכליה שלוש פעמים לאחר השטיפה האחרונה בשלושה עד חמישה מיליליטר של תמיסת חסימה ודגר את הכליה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר השלמת החסימה, המשך ישירות לפרוטוקול הצביעה שנבחר. הסר את תמיסת החסימה ושטוף את הכליה שלוש פעמים לפני שנותנים לכליה להיספג ב-XPBS אחד למשך 10 דקות לפחות. במהלך תקופה זו, העבירו את הכליה לכלי תרבית של 12 בארות או 24 בארות.החלף את ה-XPBS בתמיסת מצע פוספטאז אלקליין עובדת מספקת כדי לכסות את הדגימה ולהניח את הדגימה על מסובב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, עצור את התגובה על ידי שטיפת הכליה בתמיסת חיץ שטיפת פוספטאז אלקליין. שטפו את הכליה בשלושה החלפות של תמיסת חיץ כביסה במשך 10 עד 15 דקות.לאחר מכן, הסר את תמיסת חיץ הכביסה והרכיב את הכליה על נקייה. החלק פנימה את אמצעי ההרכבה של הפוספטאז הכלול בערכת התיוג. דמיין את הכליה המוכתמת בפוספטאז אלקליין באמצעות מיקרוסקופ סטריאו או מיקרוסקופ מורכב עם סט מסננים מחובר לדבי.ראשית, הכינו תמיסת DBA עובדת של 200 מיקרוליטר על ידי דילול DBA ב-XPBS אחד. החלף את תמיסת PBS ב-200 מיקרוליטר של תמיסת DBA והנח את הדגימה על מסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, הסר את תמיסת ה-DBA ושטוף את הכליה שלוש פעמים עם שלושה עד חמישה מיליליטר של XPBS אחד למשך חמש דקות כל אחד.הסר את ה-XPBS האחד והרכיב את הכליה על מגלשת זכוכית נקייה. כפי שהודגם קודם לכן, דמיין את המקטעים הדיסטליים המוכתמים ב-DBA של הכליה באמצעות מסנן טריקסי או טקסס אדום סטנדרטי המוגדר על מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי או מיקרוסקופ מורכב. בתמונת השדה הבהיר הזו של כליה לא מולבנת, הפיגמנטציה השחורה תואמת את האוכלוסייה המפוזרת של מלנוציטים.כאן מקטעי PCT של נפרון נראים שלושה ימים לאחר הזרקת דקסטרין. הכניסה מכילה תמונה של נפרון בודד עם מלנוציטים. תמונה זו מציגה כליה בוגרת לאחר הסרת פיגמנטציה של מלנוציטים.תמונות מייצגות אלה מתארות שינויים מורפולוגיים קלים בין מקטעי PCT, בעוד ש-PCT נפרון רבים מפותלים היטב. נפרונים אחרים מכילים אזורי PCT בעלי דקסטרין מתפתל מינימלי, דקסטרין כחול מפל, צהוב לוציפר ודקסטרין פלואורו רובי כולם מסמנים את מקטעי ה-PCT בנפרונים כליות, גם דקסטרין Cascade Blue וגם Lucifer Yellow מראים תיוג לא ספציפי עם רקע הרבה יותר גבוה שנצפה בכליות שטופלו בצהוב לוציפר. לעומת זאת, דקסטרין פלואורו רובי הראה רקע מופחת באופן דרמטי עם תיוג PCT אינטנסיבי.כליה בוגרת המוכתמת על ידי רצון לזהות סמן ספציפי של סוג תא טרנספורטר PCT מראה דפוס ביטוי האופייני לספיגת דקסטרין עם התפלגות של תחומי PCT שונים מפותלים היטב, כמו גם מתיחות PCT מוארכות יותר המראות קוטר רחב עקבי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג בהצלחה מקטעי נפרון בתוך כליית דג הזברה הבוגר, כגון הצינורית הפרוקסימלית עם פוספטאז אלקליין וצינורית דיסטלית רפואית עם DBA. אל תשכח שעבודה עם 4% פרלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת מעיל, כפפות ומשקפיים בעת ביצוע הליך זה.

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את הליך זיהוי ביתור איברים דג הזברה הבוגרת.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

כליות דג הזברה הוא ביתם של שני גזע / ובתאים כליות hematopoietic מבוגרים, מהווה הזדמנות מעולה ללמוד סוגי תאים אלה וצאצאיהם באורגניזם מודל החולייתנים. הנה, אנחנו מדגימים הליך לנתיחה מפורט המאפשר חוקר לזהות בניתוח להסרת הכליה דג הזברה למבוגרים, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון בידוד התא, השתלה, ומחקרים ביטוי וכליות / או אוכלוסיות תאים דם.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

סרטון זה מדגים את הנתיחה וההכנה של תושבת שטוחה של הכליה של דג הזברה הבוגר. ניתן לדמיין את ההרכבה השטוחה שהוכנה תחת המיקרוסקופ לניתוח דגימה.

הכנת הרכבה שטוחה לכליה: הליך לנתח ולהכין תושבת שטוחה לאנליזה מיקרוסקופית של כליה של דגי זברה בוגרים

בסרטון זה אנו מדגימים את הפיגמנטציה של כליה של דג זברה בוגר ואת הכנתה לאחר מכן להליכי צביעה. לאחר הצביעה, הכליה של דג הזברה הבוגר יכולה לשמש לחקר התחדשות כליות, אפיון פנוטיפי של מודלים של מחלות כליות, ופונקציונליות נפרון.

דה-פיגמנטציה ושימור של כליה של דג זברה: טכניקה להכנת כליה של דג זברה בוגר להכתמה

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

למדו לנתח הרכב נפרון ותפקוד כלייתי בדגי זברה מבוגרים באמצעות תיוג פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה. שיטות אלו מאפשרות הערכת אנטומיה כלייתית וחקר מחלות כליה ותהליכי התחדשות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

גלה סרטונים נוספים