ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את הרכב ותפקוד מקטעי הנפרון בכליות דג הזברה הבוגרות. זה מושג על ידי הזרקת דקסטרין עם תווית פלואורסצנטית לקן הקושר דגי זברה. השלב השני הוא הסרה וקיבוע של הכליה כדי להכין רקמה לשיטות התיוג הבאות.

לאחר מכן, הכליה מולבנת כדי להסיר פיגמנטציה ולאחר מכן מוכתמת לסימון פלואורסצנטי של מקטעי הנפרון הרצויים. התוצאות מתקבלות באמצעות אימונופלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה ו/או הדמיית שדה בהיר המאפשרות הדמיה של אנטומיה של הכליה על סמך הכתם או הכתמים שנבחרו. שיטות התיוג הבאות יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכליות בנוגע לאנטומיה של איברים וניתן להשתמש בהן כדי לחקור את הרכב הנפרון ולהעריך את תפקוד הכליות לפני ואחרי אירוע פציעה.

ההשלכות של טכניקות אלה משתרעות על חקר חריגות גנטיות בהיווצרות כליות בוגרות וניתן ליישם אותן גם כדי להעריך את מצב הכליות במהלך מודלים של מחלות כרוניות. כדי להתחיל, שפכו את התמיסה מדג מורדם והניחו בזהירות את החיה על תבנית ספוג רטובה, צד גחון. לאחר מכן, מלאו מזרק אינסולין ב-20 מיקרוליטר של תמיסת דקסטרין הפשרה.

הנח את המחט כך שההחדרה תתרחש בזווית רדודה בקו האמצע הגחוני של הבטן. כדי להימנע מהזרקה קלה של האיברים, הרם את המחט מיד לאחר ההזרקה כדי להרים את דופן הגוף וליצור חלל בו ניתן להזריק את התמיסה. לאחר ההזרקה, החזירו בעדינות את הדג למיכל כדי להתאושש מההרדמה.

כדי להתחיל, יש לשפוך כל תמיסה נוספת מדג מורדם ולהניח אותה על טישו או מגבת נייר. לאחר הסרת הראש והאיברים הפנימיים, השתמש במחטי חיתוך עדינות במיוחד כדי לפתוח את דפנות הגוף. אתר את איבר הכליה הנצמד לדופן הגב של החיה.

השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק את הכליה מדופן הגב. הכניסו בעדינות את הכליה לבקבוקון זכוכית של חמישה מיליליטר המכיל XPBS אחד ושטפו שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת. הסר את הכליה בעזרת פיפטת העברה והנח אותה על זכוכית נקייה שקופית עם טיפה אחת עד שתיים של XPBS אחד.

השתמש במלקחיים עדינים כדי לשטח את הכליה על המגלשה, וודא שאף רקמה לא התכרבלה או התהפכה על עצמה בדרך אחרת. ניתן להשתמש בכלי חוט טונגסטן לביצוע חתכים קטנים ברקמת החיבור כדי להקל על המיקום השטוח של הכליה. לאחר מכן, הניחו חתיכות קטנות של חימר דוגמנות על כל פינה של תלוש כיסוי זכוכית בגודל 18 על 18 מילימטר.

הנח לאט את החלקת הכיסוי על הכליה, תוך שמירה על זווית קלה. כדי למזער את השמנת בועות האוויר, הוסף טיפה נוספת של XPBS אחד כדי למלא את הרווח בין החלקה להחלקה של המכסה במידת הצורך. קבוצה נפרדת של דגי זברה מורדמת ומושרתת בקיבוע למשך הלילה.

כשהוא מוכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק בזהירות את הכליה מדופן הגוף הגבי ולהניח את האיבר בבקבוקון זכוכית. שטפו את הכליה המנותחת שלוש פעמים עם שלושה עד חמישה מיליליטר של XPBS אחד עם 0.05% טווין למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, הסר את תמיסת PBS ושטוף את הכליה בשלושה מיליליטר של תמיסת סוכרוז של 5% למשך 30 דקות.

לאחר זמן זה, החלף את התמיסה בשלושה מיליליטר של 30% סוכרוז ואחסן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. הסר את התמיסה ושטוף את הכליה פעמיים לפני הוספת שלושה עד חמישה מיליליטר תמיסת הלבנה. כדי להסיר את פיגמנטציית המלנוציטים הקיימת על איבר הכליה, הניחו את בקבוקון הזכוכית על מסובב וצפו היטב כיצד הפיגמנטציה נעלמת.

הסרת פיגמנטים אורכת בדרך כלל כ-20 דקות, אך לפעמים יכולה להימשך עד 60 דקות. אם תמיסת ההלבנה נשארת זמן רב מדי, עלולה להתרחש התפוררות ולכן מומלץ לעקוב אחר הדגימה כל 10 עד 15 דקות כדי לבדוק את תקינות כאשר הפיגמנטציה הוסרה משטיפת הכליות פעמיים ולדגור עם תמיסת 4% PFA למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את תמיסת ה-4% PFA ושטוף את הכליה שלוש פעמים לאחר השטיפה האחרונה בשלושה עד חמישה מיליליטר של תמיסת חסימה ודגר את הכליה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר השלמת החסימה, המשך ישירות לפרוטוקול הצביעה שנבחר. הסר את תמיסת החסימה ושטוף את הכליה שלוש פעמים לפני שנותנים לכליה להיספג ב-XPBS אחד למשך 10 דקות לפחות. במהלך תקופה זו, העבירו את הכליה לכלי תרבית של 12 בארות או 24 בארות.

החלף את ה-XPBS בתמיסת מצע פוספטאז אלקליין עובדת מספקת כדי לכסות את הדגימה ולהניח את הדגימה על מסובב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, עצור את התגובה על ידי שטיפת הכליה בתמיסת חיץ שטיפת פוספטאז אלקליין. שטפו את הכליה בשלושה החלפות של תמיסת חיץ כביסה במשך 10 עד 15 דקות.

לאחר מכן, הסר את תמיסת חיץ הכביסה והרכיב את הכליה על נקייה. החלק פנימה את אמצעי ההרכבה של הפוספטאז הכלול בערכת התיוג. דמיין את הכליה המוכתמת בפוספטאז אלקליין באמצעות מיקרוסקופ סטריאו או מיקרוסקופ מורכב עם סט מסננים מחובר לדבי.

ראשית, הכינו תמיסת DBA עובדת של 200 מיקרוליטר על ידי דילול DBA ב-XPBS אחד. החלף את תמיסת PBS ב-200 מיקרוליטר של תמיסת DBA והנח את הדגימה על מסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, הסר את תמיסת ה-DBA ושטוף את הכליה שלוש פעמים עם שלושה עד חמישה מיליליטר של XPBS אחד למשך חמש דקות כל אחד.

הסר את ה-XPBS האחד והרכיב את הכליה על מגלשת זכוכית נקייה. כפי שהודגם קודם לכן, דמיין את המקטעים הדיסטליים המוכתמים ב-DBA של הכליה באמצעות מסנן טריקסי או טקסס אדום סטנדרטי המוגדר על מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי או מיקרוסקופ מורכב. בתמונת השדה הבהיר הזו של כליה לא מולבנת, הפיגמנטציה השחורה תואמת את האוכלוסייה המפוזרת של מלנוציטים.

כאן מקטעי PCT של נפרון נראים שלושה ימים לאחר הזרקת דקסטרין. הכניסה מכילה תמונה של נפרון בודד עם מלנוציטים. תמונה זו מציגה כליה בוגרת לאחר הסרת פיגמנטציה של מלנוציטים.

תמונות מייצגות אלה מתארות שינויים מורפולוגיים קלים בין מקטעי PCT, בעוד ש-PCT נפרון רבים מפותלים היטב. נפרונים אחרים מכילים אזורי PCT בעלי דקסטרין מתפתל מינימלי, דקסטרין כחול מפל, צהוב לוציפר ודקסטרין פלואורו רובי כולם מסמנים את מקטעי ה-PCT בנפרונים כליות, גם דקסטרין Cascade Blue וגם Lucifer Yellow מראים תיוג לא ספציפי עם רקע הרבה יותר גבוה שנצפה בכליות שטופלו בצהוב לוציפר. לעומת זאת, דקסטרין פלואורו רובי הראה רקע מופחת באופן דרמטי עם תיוג PCT אינטנסיבי.

כליה בוגרת המוכתמת על ידי רצון לזהות סמן ספציפי של סוג תא טרנספורטר PCT מראה דפוס ביטוי האופייני לספיגת דקסטרין עם התפלגות של תחומי PCT שונים מפותלים היטב, כמו גם מתיחות PCT מוארכות יותר המראות קוטר רחב עקבי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג בהצלחה מקטעי נפרון בתוך כליית דג הזברה הבוגר, כגון הצינורית הפרוקסימלית עם פוספטאז אלקליין וצינורית דיסטלית רפואית עם DBA. אל תשכח שעבודה עם 4% פרלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת מעיל, כפפות ומשקפיים בעת ביצוע הליך זה.