הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור בדיקת תפקוד כליות כמותית בדגי זברה. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה של עוברי דגי זברה ב-72 HPF. לאחר מכן, העוברים מועברים לתבנית הזרקה ומכוונים כך שליבם נמצא משמאל לשדה הראייה.

לאחר מכן מוזרקים לחלל קרום הלב צבע פלואורסצנטי דקסטר רומין ונדרשות תמונות פלואורסצנטיות של אזור הלב באמצעות מיקרוסקופ ניתוח אפי פלואורסצנטי. בסופו של דבר, פינוי הכליות של צבע פלואורסצנטי מוערך באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת קריאה כמותית של תפקוד הכליות של דגי הזברה ללא צורך בבדיקות דם או שתן, שאינן אפשריות בדגי זברה.

שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה להערכת תפקוד הכליות במודלים של מחלות דג הזברה. לאחר משיכת מחטים והכנת תבנית לפי פרוטוקול הטקסט, יצקו את התבנית על ידי יציקת תמיסת 2% ארו העשויה במי דגים לתוך צלחת פטרי של 90 מילימטר. מניחים את התבנית על צלחת הפטרי, ומאפשרים לקצוות השקופיות המוערמים לשקוע בזווית מתחת למשטח האגרו.

הניחו לו להתייצב למשך 30 דקות. הסר את יציקת השקופיות והשתמש במי דגים טריים המכילים חומר הרדמה טריקה ביחס של אחד ל-25. כדי לכסות את השקופית הוטבע ארוס לביצוע הזרקות דגי זברה של צבע פלואורסצנטי.

השתמש במערך מיקרו-הזרקה סטנדרטי המורכב ממדחס אוויר המחובר למערכת ויסות לחץ המוזן למחזיק פיפטה ישר לשימוש עם נימים בקוטר 1.0 חיצוני. מחזיק הפיפטה צריך להיות ממוקם בתוך קומפקט MN 33. מיקרו מניפולטור בקרת שלושה צירים המאובטח ללוחית בסיס פלדה על ידי משתמש מעמד מגנטי מנתח מיקרוסקופ כדי לדמיין, לתפעל ולהזריק עוברים תוך שמירה על דגי זברה בתנאים סטנדרטיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

השתמש בחוטי דגי זברה מסוג בר או טרנסגני בהתאם לניסוי. שמירה על צפיפות גרב של 15 זכרים עד 15 נקבות לכל מיכל של שמונה ליטר כדי להבטיח איסוף מקסימלי של ביצים מבלי להפריע לדגים. טבלו מיכלי רבייה במיכלי מלאי מסוג בר בערב שלפני האיסוף.

ביום האיסוף, אפשר 30 עד 40 דקות לדג להשריץ. לאחר מכן השתמש במסננת רשת ובמי אקווריום טריים כדי לאסוף ולשטוף את הביצים. הפקידו את הביצים הנקיות בצלחת פטרי בגודל 90 מילימטר המכילה עובר, מדיום ודגירה בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לעכב מיוגנזה.

בשמונה שעות. לאחר הפריה או HPF. העבירו את העוברים ברי הקיימא בנוזל מינימלי לצלחות פטרי טריות המכילות 1 עד 100 PTU למדיום העובר ודגרו עוד יותר על 28.5 מעלות צלזיוס.

השתמש במלקחיים עדינים כדי לשבור את קצה המחט. לאחר מכן העבר את ה-RD לקצה המחט על ידי מקסום משך הדופק להגדרת הדקה. כאשר התמיסה מגיעה לקצה, חזור לאלפיות השנייה.

הניחו מיקרומטר על שלב המיקרוסקופ ועם ווסת הלחץ והחידודים לקצה המחט, התאימו את גודל טיפת ההוצאה לקוטר 100 מיקרון או לנפח של 0.5 ננוליטר לפני ההזרקה. הגדר 2 צלחות פטרי 35 מילימטר. כל אחד מהם מכיל חמישה מיליליטר של מדיום עוברי תווית טריקה אחת והשני התאוששות.

הוסף 200 מיקרוליטר טריקה ציר לכלי המסומן בטריקה. לאחר שיהיה מוכן להזרקה, בחר עובר בודד ב-72 HPF. העבירו מעט נוזלים לצלחת הטריקה ועקבו אחר פעילות העובר.

לאחר שהעובר מורדם, העבירו אותו לתבנית ההזרקה וכוונו אותו בשוקת כך שהצד השמאלי פונה כלפי מעלה. מיקום הלב לצד שמאל של שדה הראייה. כדי להזריק את ה-RD ללב, השתמש במחט כדי לנקב את קרום הלב ולהזריק ננו-ליטר אחד של RD לחלל קרום הלב.

לאחר משיכת המחט, העבירו את העובר המוזרק בנוזל מינימלי לצלחת ההתאוששות ועקבו במשך דקה. לאחר מכן העבירו את העובר הבודד לצלחת של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום עוברי טרי המכיל PTU ותווית כראוי. לאחר הזרקת לפחות 10 עוברים לכל קבוצת ניסוי דוגרים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

שלוש שעות לאחר ההזרקה או HPI עוברים מורדמים כפי שתואר קודם לכן. ומעבירים לצלחת פטרי 35 מילימטר המכילה 3% מתיל תאית. דחף בעדינות עוברים לתוך המתיל צלולוז והתמצא כך שניתן יהיה לדמות את הצד הרוחבי.

באמצעות מסנן פליטה של 570 ננומטר לאור UV, רכשו תמונה של העובר. אפשר לעובר להתאושש לפני החלפתו בבאר המיועדת לרכוש תמונות עבור כל העוברים המוזרקים, ולאחר מכן להמשיך לדגור ב-28.5 מעלות צלזיוס. לאחר שרכשתי סבב שני של תמונות ב-24 HP, אני משתמש בתוכנת תמונה J כדי לכמת את עוצמת הקרינה של כל עובר מוזרק על ידי פתיחת תמונה וציון אזור עניין או החזר ROI.

על-ידי בחירה באפשרות עריכת בחירה, ציין והגדר את הערך על 100 פיקסלים מרובעים. מקם את הלב במרכז ההחזר על ההשקעה ובחר ניתוח, הגדר מדידות והגדר את המדידות כך שיכללו גווני אפור ושטח ממוצעים. לאחר מכן בצע את המדידה, כמת את הקרינה עבור כל סט תמונות בשלושה HPI ו-24 HPI לעובר והעביר את ערכי הסולם האפור הממוצע לגיליון אלקטרוני להמשך עיבוד.

השתמש בתוכנה מתאימה כדי לבצע ניתוח סטטיסטי ולהשוות קבוצות למובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן ה-T של התלמיד כפי שמוצג כאן. הזרקת RD ל-bbbs תשעה דגים שהוזרקו מורפו הביאה לכך ש-40% מהעוברים פיתחו ציסטות פריקיות מועדות עד חמישה ימים לאחר ההפריה. בנוסף, דגי המורפין הראו ירידה ביכולת לנקות את הצבע הפלואורסצנטי לאחר 24 HPI בהשוואה לביקורת.

פעם אחת ניתן להזריק קבוצה של 10 דגים תוך 15 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנצל את השקיפות האופטית של דג הזברה כדי לנטר כמותית את הפינוי הזמני של צבע פלואורסצנטי מוזרק מיקרו כקריאה יעילה של תפקוד הכליות של דג הזברה.