הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור בדיקה כמותית לתפקוד הכליות בדגי זהב (zebra fish). הדבר מושג תחילה על ידי הרדמת עוברים של דג זהב בגיל 72 HPF. לאחר מכן, העוברים מועברים לתבנית הזרקה ומכוונים כך שלבם יהיה משמאל לשדה הראייה.

לאחר מכן, מזריקים לחלל פריקרד (pericardial cavity) צבע פלואורסצנטי מסוג rumine dextra, ומבצעים דימות פלואורסצנטי של אזור הלב באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה עם תאורה אפי-פלואורסצנטית. לבסוף, מוערה הפינוי הכליתי של הצבע הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מדד כמותי לתפקוד הכליות של דג הזברה מבלי להזדקק לבדיקות דם או שתן, שאינן אפשריות בדג הזברה.

שיטה זו מספקת כלי רב-עוצמה להערכת תפקוד הכליות במודלים של מחלות בדגי זהב (zebrafish). לאחר שליפת המחטים והכנת התבנית בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש ליצוק את התבנית על ידי מזיגה ראשונית של תמיסת 2% aro שהוכנה במי דגים לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מילימטר. הנח את התבנית על צלחת הפטרי, כך שקצוות השקופיות הערומות ישקעו בזווית מתחת לפני השטח של ה-agro.

המתינו 30 דקות עד להתset. הסירו את תבנית ההטבעה והשתמשו במי דגים טריים המכילים חומר הרדמה tricaine ביחס של 1:25. כסו את השקף המוטבע כדי לבצע הזרקות של צבע פלואורסצנטי לדגי זברה.

השתמשו במערכת מיקרו-הזרקה סטנדרטית המורכבת ממדחס אוויר המחובר למערכת ויסות לחץ, המזינה מחזיק פיפטה ישר המיועד לקפילריות בעלות קוטר חיצוני של 1.0. מחזיק הפיפטה צריך להיות מותקן בתוך MN 33 compact. השתמשו במיקרו-מניפולטור בעל בקרת שלושה צירים המקובע לפלטת בסיס מפלדה באמצעות מעמד מגנטי, ובמיקרוסקופ דיסקציה כדי להדמות, לתמרן ולהזריק לעוברים, תוך שמירה על דגי zebrafish בתנאים סטנדרטיים כפי שפורטו בפרוטוקול הכתוב.

השתמשו במקווי דגי זברה מסוג פרא (wild type) או בקווי דגים טרנסגניים, בהתאם לדרישות הניסוי. שמרו על צפיפות גידול של 15 זכרים ו-15 נקבות לכל מיכל של שמונה ליטר, כדי להבטיח איסוף מקסימלי של ביצים מבלי להטריף את הדגים. השקיעו את מיכלי הרבייה בתוך מיכלי המלאי של דגי הפרא בערב שלפני האיסוף.

ביום האיסוף, המתינו 30 עד 40 דקות להטלת הביצים של הדגים. לאחר מכן, השתמשו במסננת רשת ובמי אקווריום טריים כדי לאסוף ולשטוף את הביצים. העבירו את הביצים הנקיות לכלי Petri בן 90 מילימטר המכיל מצע לעוברים, והדגרירו בטמפרטורה של 28.5 °C כדי לעכב את המיוגנזה.

שמונה שעות לאחר ההפריה (HPF), העבירו את העוברים החיוניים בכמות מינימלית של נוזל לצלוחי פטרי טריים המכילים 1 עד 100 PTU במדיום עוברים, והמשיכו בדגירה בטמפרטורה של 28.5 °C.

השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק כדי לשבור את קצה המחט. לאחר מכן, העבירו את ה-RD לקצה המחט על ידי הגדרת משך הפעימה למקסימום בפיסוק של דקות. כאשר התמיסה תגיע לקצה, חזרו להגדרה של מילי-שניות.

הניחו מיקרומטר על משבית המיקרוסקופ, ובעזרת ווסת הלחץ והכוונונים של קצה המחט, כווןנו את גודל טיפת הפליטה לקוטר של 100 microns או לנפח של 0.5 nanoliters לפני ההזרקה. הכינו שתי צלחנות פטרי בנפח 35 millimeter, שכל אחת מהן מכילה חמישה milliliters של מצע לעוברים; סמנו את אחת כ-trica ואת השנייה כ-recovery.

הוסיפו 200 µL של תמיסת stock trica לצלחת המסומנת כ-trica. כאשר השלב מוכן להזרקה, בחרו עובר בודד בגיל 72 HPF. העבירו כמות מינימלית של נוזל לצלחת ה-trica ועקבו אחר פעילותו של העובר.

לאחר הרדמת העובר, העבירו אותו לתבנית ההזרקה וכיוונו בתוך התעלה כך שהצד השמאלי יפנה כלפי מעלה. מ theלב צריך להיות ממוקם בצד השמאלי של שדה הראייה. כדי להזריק את ה-RD לתוך הלב, השתמשו במחט כדי לנקב את הפריקארד (pericardium) והזריקו 1 nanoliter של RD אל תוך חלל הפריקארד.

לאחר הוצאת המחט, העבירו את העובר המוזרק עם כמות מינימלית של נוזל לכלי ההתאוששות ועקבו אחריו במשך דקה אחת. לאחר מכן, העבירו כל עובר בנפרד לפלטה בעלת 24 בארות המכילה 1 ml של מצע עוברים טרי עם PTU וסמנו אותה באופן מתאים. לאחר הזרקה של לפחות 10 עוברים לכל קבוצה ניסיונית, דגרו בטמפרטורה של 28.5 °C למשך שלוש שעות.

שלוש שעות לאחר ההזרקה (HPI), יש להרדים את העוברים כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, העבירו אותם לפטריית פטרי בקוטר 35 מילימטר המכילה 3% methyl cellulose. דחפו בעדינות את העוברים אל תוך ה-methyl cellulose וכיוונו אותם כך שניתן יהיה לצלם את הצד הלטראלי.

באמצעות מסנן פליטה של 570 ננומטר לאור UV, רכשו תמונה של העובר. אפשרו לעובר להתאושש לפני החזרתו לבאר המיועדת. רכשו תמונות עבור כל העוברים המוזרקים, ולאחר מכן המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. לאחר רכישת סבב שני של תמונות ב-24 HP, השתמשתי בתוכנת Image J כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה של כל עובר מוזרק, על ידי פתיחת התמונה והגדרת אזור עניין או ROI.

בבחירת "ערוך בחירה" (edit selection), הגדירו את הערך ל-100 פיקסלים ריבועיים. מקמו את הלב במרכז ה-ROI ובחרו ב"ניתוח" (analyze); הגדירו את המדידות כך שיכללו את ממוצע סולם האפור (mean gray scale) ואת השטח. לאחר מכן בצעו את המדידה, כמיו את הפלואורסצנציה עבור כל סט של תמונות ב-3 HPI וב-24 HPI לכל עובר, והעבירו את ערכי ממוצע סולם האפור לגיליון אלקטרוני לצורך עיבוד המשך.

השתמשו בתוכנה מתאימה לביצוע ניתוח סטטיסטי ולהשוואת קבוצות עבור מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t של student כפי שמוצג כאן. הזרקה של RD לתוך bbbs בתשעה דגים שהוזרקו morpho הובילה לכך ש-40% מהעוברי פיתחו ציסטות prone fric עד חמישה ימים לאחר ההפריה. בנוסף, דגי ה-morphin הראו ירידה ביכולת לפנות את הצבע הפלורסצנטי לאחר 24 HPI בהשוואה לקבוצות הביקורת.

ניתן להזריק קבוצה של 10 דגים בתוך 15 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנצל את השקיפות האופטית של דגי זברפיש כדי לנטר כמותית את הפינוי הזמני של צבע פלואורסצנטי שהוזרק במיקרו-הזרקה, כקריאה יעילה לתפקוד הכליות של דגי הזברפיש.