ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי
April 7th, 2016
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח זמן-lapse של תהליכי התפתחות מגוונים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי עם אסטרטגיות פשוטות ליישור מחדש לאחר סחיפה לכל כיוון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית מכיוון שהיא מאפשרת התבוננות ישירה ברקמות ובהתפתחות איברים בעוברים חיים במשך מספר שעות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא חלופה משתלמת וקלה לשימוש לטכניקות מורכבות יותר המשמשות בדרך כלל להקלטה בזמן של רקמות ואיברים מתפתחים, כגון סריקת לייזר או מיקרוסקופיה מוארת.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שינויים מרחביים וזמניים המתרחשים במהלך התפתחות עוברי דגים וזחלים, ניתן ליישם אותה גם כדי לחקור תהליכי התפתחות מוקדמים ואורגניזמים מודלים אחרים. יתר על כן, מתאים לצפות בתהליכים דינמיים באורגניזמים בוגרים, כגון ריפוי שורשים והתחדשות. בהכנה, זהה דגים בוגרים בעלי רבייה גבוהה מקו הביטוי הטרנסגני של GFP.
אחר הצהריים לפני הזרקת המיקרו של הצמח, הציבו חמישה זוגות זכרים-נקבות של דגי רבייה בחמישה מיכלי רבייה. במיכלים, שמור את הזכר והנקבה מופרדים על ידי מסננת נשלפת למשך הלילה. למחרת בבוקר, מיד לאחר שהאורות נדלקים, הניחו זכר ונקבה יחד מעל המסננת, מה שימנע מהם לאכול את הביצים שלהם.
כעת, התבונן בדגים בזמן שהם משריצים. לאחר שהזוג מייצר כ-50 ביצים, הפרד ביניהן. לאחר מכן, העבירו את הביצים באמצעות פיפטת פסטר לצלחת פטרי מלאה במי עובר לסבב ראשון של הזרקה.
חזור על תהליך זה עבור כל זוג מזווג. אם יש צורך בביצים נוספות, ניתן להפגיש את אותם זוגות הזדווגות ולהפריד אותם מספר פעמים. לצורך המיקרו-הזרקה, הכנה מתקדמת של כלים ומחטי הזרקה נעשית בצורה סטנדרטית למדי.
פרטים ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. התחל בהעמסת מחט הזרקה מוכנה. בעזרת קצה מיקרו-מעמיס, מלא מחדש את המחט בשני מיקרוליטר של תמיסת עבודה MO, ולאחר מכן חבר את המחט במיקרו-מניפולטור.
לאחר מכן, ניתן לפתוח את קצה המחט. תוך כדי צפייה בו במיקרוסקופ הדיסקציה, השתמש בפינצטה כדי לפתוח את הקצה, או לדחוף את הקצה על משטח קשיח. לאחר מכן, כייל את נפח ההזרקה על ידי הזרקת תמיסת MO לטיפת שמן מינרלי על גרטיקול.
התאם את ההזרקה ליצירת טיפות של 75 מיקרון, שיתאימו לכ-200 פיקוליטר תמיסה. לאחר מכן, הכינו את העוברים להזרקה. סדרו את כ-21 העוברים בשלב התא לאורך החריץ של צלחת המיקרו-הזרקה כאשר הקוטב הצמחי מכוון לכיוון הגישה של מחט המיקרו-הזרקה, שנמצאת בזווית של 45 מעלות מהחריץ.
כעת, הזריקו את העוברים. בעזרת המחט מחוררים את הכוריון והחלמון, ואז מזריקים את תמיסת המורפולינו הטעונה לחלמון. זה עובד עבור עוברים בשלב תא אחד או שניים.
לאחר הזרקת כל העוברים, השתמש בפסטר רחב כדי לאסוף אותם. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחות פטרי מלאות במי עוברים, ודוגרים אותם בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר אחר הצהריים, שאבו עוברים מתים והחליפו את מי העוברים.
למחרת בבוקר, לאחר שהעוברים עברו קיבה, יש לעכב את המלניזציה שלהם על ידי החלפת המים שלהם במי עוברים המכילים כמות מזערית של PTU. היזהר, PTU ישבש את ההתפתחות התקינה לפני קיבה. מאוחר יותר, בשלב ההתפתחותי הרצוי, יש לפרק את העוברים בפינצטה חדה.
בעזרת המיקרוסקופ, תפסו את הכוריון עם פינצטה אחת, ונסו לתפוס את הצד השני של הכוריון עם זוג פינצטה שני. לאחר מכן, משוך בזהירות את הפינצטה מבלי להפריע לעובר. לאחר מכן, הרדמו את העוברים עם טריקאין, והמשיכו להטמיע את העוברים והאגרוז על רשת רילוקיישן של 15 מיקרון המונחת במיקרו-צלחת זכוכית עם תחתית כיסוי.
לאחר מכן, טען מיליליטר אחד של אגרוז מומס לתוך צינורות תגובה של 1.5 מיליליטר. הכניסו את הצינורות לקוביות חום המוגדרות ל -36 מעלות צלזיוס, והמתינו שיתקררו. לאחר מכן, בעזרת פיפטה רחבה, העבירו עובר לצלחת המיקרו.
שואבים את עודפי מי העובר ומכסים את העובר באגרוז. בזמן שהאגרוז עדיין נוזלי, השתמש בשני קצות פיפטה קטנים כדי לכוון את העוברים. מקם את מבנה העניין, במקרה זה, את הפרונפרו, קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית, ובסמיכות לרשת.
הרשת לא צריכה לכסות את מבנה העניין. זה יתרון להטמיע עד ארבעה עוברים במיקרו-כלים שונים, ולתכנן לצלם את הטוב ביותר. הטמעה נכונה דורשת תרגול מסוים.
בעוד האגרוז עדיין נוזלי, יש לכוון את העובר למיקום הרצוי. אם זה פרונפרוס קרוב לתחתית הזכוכית, ובמרחק מתאים לרשת הרילוקיישן. בדוק את האגרוז באופן שגרתי.
ברגע שקשה מספיק להחזיק את העוברים, הניחו לו להתייצב עוד שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, כסו את העובר המוטבע במי עובר המכילים כמויות עקבות של PTU וטריקאין. שפכו או שאבו את עודפי מי העובר וננעלו את המכסה כדי למנוע אידוי.
התוצאה לא אמורה להיות בועות אוויר. כעת ניתן לצלם את העובר כשתחתית הזכוכית פונה לעדשת האובייקטיב. באמצעות ההכנה ליצירת תמונות פסק, למשל, על ידי צילום תמונות Z-stack מעת לעת במשך מספר שעות, יש צורך לתקן את סחף המוקד.
במידת האפשר, החל אסטרטגיית מיקוד אוטומטי. החלף את אפשרות המיקוד האוטומטי בבקרת התוכנה. עבור ערוץ הייחוס, בחר את ערוץ השדה הבהיר של האור המועבר כדי למזער את רעילות הצילום.
כמו כן, חיוני לבחור טווח חיפוש תלוי דגימה גדול מספיק כדי שהפוקוס האוטומטי יעבוד כראוי. לפני איסוף תמונות, מקם נקודה מסוימת של הרשת המוטבעת קרוב למבנה העניין בכוונת התוכנה, ולאחר מכן שמור מיקום זה באמצעות צילום מסך. לאחר מכן, רגע לפני סיום כל מרווח זמן הדמיה, עיין בצילום המסך והתאם מחדש את מיקום ה-stagה ואת המיקוד אם המיקוד האוטומטי אינו בשימוש.
השיטה המוצגת שימשה לניתוח התפתחות הכליות בעוברים שעברו שינוי WT1A של חוט דגי זברה מהונדסים. במהלך הפרוגניות המוקדמות, קו זה בחר בפלואורסצנטיות ירוקה במזודרם הביניים שבו נוצרים אבות הכליה, ומאוחר יותר במהלך ההתפתחות בצינורות היוצרים ובפרימורדיה של הנפרון. הדמיית זמן-lapse חשפה נפרוגנזה תקינה בעוברים שהזריק מורפולינו.
20 שעות לאחר ההפריה נראו הצינוריות הפרונפריות המתפתחות. בקצותיהם הקדמיים ניתן היה לזהות הצטברות כדורית של תאים המייצגים את פרימורדיה הנפרון הנוצר. במהלך השעות הבאות גדלו צינוריות ופרימורדיה נפרון, והפרימודיה החלה להתמזג בקו האמצע.
לעומת זאת, נפרוגנזה שובשה קשות אצל המוטאנטים. למרות שמבנים צינוריים חיוביים ל-GFP נראו 20 שעות לאחר ההפריה, הם היו מפוזרים ולא מפותחים. הדמיה בהילוך מהיר הראתה שפרימורגיה של נפרון מעולם לא נוצרה, ומספר מדהים של תאים פלואורסצנטיים הממוקמים מחוץ לפרונפרונים המתפתחים נדדו דרך הגחון, ועזבו את השדה הפרונפרי
.בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי היעדר ציוד נוסף, כגון בקרת טמפרטורה או טבלאות נגד אידוי דורש בדיקות קבועות עבור סחיפות והתאמות מחדש. לאחר הליך זה, ניתן לעבד עוברי תמונה לביצוע שיטות אחרות, כמו אימונוהיסטוכימיה, אינסטרוה-היפרטיזציה או PCR בזמן אמת על מנת לזהות רכיבים ספציפיים של תאים, רקמות או להעריך ביטוי גנים.
סקירה כללית
שיטה זו מאפשרת ניתוח תהליכי זמן של התפתחות איברים בעובר של דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. היא מאפשרת תצפית ישירה של רקמות והתפתחות איברים במשך מספר שעות, ומספקת תובנות לביולוגיה התפתחותית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- עוברי דגי זברה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- צילום תהליכי זמן הוא קריטי לחקר תהליכים התפתחותיים.
- שיטות מסורתיות יכולות להיות מורכבות ויקרות.
- שיטה זו מציעה חלופה פשוטה ומשתלמת יותר.
- ניתן ליישם אותה על מגוון אורגניזמים מודליים.
מטרת המחקר
- להקל על תצפית בהתפתחות איברים בעובר חי.
- לספק שיטה קלה לשימוש וחסכונית.
- לאפשר לחוקרים לחקור תהליכים התפתחותיים דינמיים.
שיטות ששימשו
- הכנת דגי זברה בוגרים להזדווגות.
- הזרקת מיקרו של פתרונות מורפולינו לעוברים.
- הטמעת עוברים באגרוזה לצורך צילום.
- צילום תהליכי זמן עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תוצאות עיקריות
- תצפית מוצלחת על התפתחות איברים בעובר דגי זברה.
- הוכח האפקטיביות של השיטה לצילום תהליכי זמן.
- סופקו תובנות לגבי שינויים מרחביים וזמניים במהלך ההתפתחות.
- הוכחה יישומיות לתהליכים התפתחותיים אחרים ואורגניזמים.
מסקנות
- שיטה זו היא כלי חשוב למחקר בביולוגיה התפתחותית.
- היא מפשטת את תהליך התצפית על עוברים חיים לאורך זמן.
- היא פותחת דרכים חדשות לחקר תופעות התפתחותיות שונות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method provides an accessible approach for time-lapse imaging of organogenesis in zebrafish embryos, enabling direct observation of developmental processes without requiring complex or expensive microscopy infrastructure. By supporting longitudinal imaging of tissue dynamics in a vertebrate model, it facilitates early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique offers a cost-effective alternative for generating quantitative, reproducible data on morphogenetic events relevant to disease modeling and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in kidney development by visualizing spatial and temporal alterations in nephrogenesis upon wt1a knockdown.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through direct visualization of pronephric tubule formation and nephron primordia fusion in live embryos.
- Predictive Value: Facilitates assessment of phenotypic severity in morphant models, aiding in target confidence evaluation for renal disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative z-stack and time-lapse readouts of fluorescently labeled kidney structures for comparative analysis between control and perturbed conditions.
- Operational Value: Utilizes a fluorescence dissecting microscope with autofocus and relocation grids to minimize drift, enhancing reproducibility across imaging sessions.
- Assay Readiness: Produces standardized imaging outputs that can be used to establish baseline phenotypes for compound screening or genetic modifier studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables observation of conserved developmental processes in zebrafish, a disease-relevant system for modeling human kidney disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows tracking of cellular migration and tubule morphogenesis defects, providing insight into off-target or pathway-specific effects of genetic perturbations.
- Preclinical Alignment: Supports progression from discovery to preclinical validation by establishing dose- or time-dependent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for renal pathways where dynamic tissue imaging informs mechanism of action and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets like wt1a by enabling real-time observation of downstream developmental consequences in a living system.
- Screening: Generates reproducible fluorescence-based readouts suitable for assessing compound effects on kidney morphogenesis in a vertebrate context.
- Analytics: Provides quantitative measurements of tubule length, primordia formation, and cellular localization over time, enabling objective comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects early developmental phenotypes to later-stage organ dysfunction, supporting biomarker-aligned assessment of renal toxicity or repair.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable imaging capability that can be applied across multiple developmental models and organ systems with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic perturbation to observable developmental defects in a physiological context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through hardware-based drift correction (autofocus, relocation grids) and standardized embryo preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, visual confirmation of pathway modulation in a whole-organism assay.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on severity and specificity of developmental phenotypes observed in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and embryo staging for successful application.
- Dependent on fluorescence dissecting microscope with z-stack capability and software supporting autofocus and stage repositioning.
- Necessitates standardization of agarose embedding and embryo orientation to ensure consistent imaging quality across users and sessions.
- Adaptation to other organs or models may require changes in transgenic reporters, injection timing, or developmental staging.
- Practical limitations include lower throughput compared to automated systems and manual effort required for drift monitoring when autofocus is not used.
