ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי
7 באפריל 2016
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח זמן-lapse של תהליכי התפתחות מגוונים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי עם אסטרטגיות פשוטות ליישור מחדש לאחר סחיפה לכל כיוון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית מכיוון שהיא מאפשרת התבוננות ישירה ברקמות ובהתפתחות איברים בעוברים חיים במשך מספר שעות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא חלופה משתלמת וקלה לשימוש לטכניקות מורכבות יותר המשמשות בדרך כלל להקלטה בזמן של רקמות ואיברים מתפתחים, כגון סריקת לייזר או מיקרוסקופיה מוארת.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שינויים מרחביים וזמניים המתרחשים במהלך התפתחות עוברי דגים וזחלים, ניתן ליישם אותה גם כדי לחקור תהליכי התפתחות מוקדמים ואורגניזמים מודלים אחרים. יתר על כן, מתאים לצפות בתהליכים דינמיים באורגניזמים בוגרים, כגון ריפוי שורשים והתחדשות. בהכנה, זהה דגים בוגרים בעלי רבייה גבוהה מקו הביטוי הטרנסגני של GFP.
אחר הצהריים לפני הזרקת המיקרו של הצמח, הציבו חמישה זוגות זכרים-נקבות של דגי רבייה בחמישה מיכלי רבייה. במיכלים, שמור את הזכר והנקבה מופרדים על ידי מסננת נשלפת למשך הלילה. למחרת בבוקר, מיד לאחר שהאורות נדלקים, הניחו זכר ונקבה יחד מעל המסננת, מה שימנע מהם לאכול את הביצים שלהם.
כעת, התבונן בדגים בזמן שהם משריצים. לאחר שהזוג מייצר כ-50 ביצים, הפרד ביניהן. לאחר מכן, העבירו את הביצים באמצעות פיפטת פסטר לצלחת פטרי מלאה במי עובר לסבב ראשון של הזרקה.
חזור על תהליך זה עבור כל זוג מזווג. אם יש צורך בביצים נוספות, ניתן להפגיש את אותם זוגות הזדווגות ולהפריד אותם מספר פעמים. לצורך המיקרו-הזרקה, הכנה מתקדמת של כלים ומחטי הזרקה נעשית בצורה סטנדרטית למדי.
פרטים ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. התחל בהעמסת מחט הזרקה מוכנה. בעזרת קצה מיקרו-מעמיס, מלא מחדש את המחט בשני מיקרוליטר של תמיסת עבודה MO, ולאחר מכן חבר את המחט במיקרו-מניפולטור.
לאחר מכן, ניתן לפתוח את קצה המחט. תוך כדי צפייה בו במיקרוסקופ הדיסקציה, השתמש בפינצטה כדי לפתוח את הקצה, או לדחוף את הקצה על משטח קשיח. לאחר מכן, כייל את נפח ההזרקה על ידי הזרקת תמיסת MO לטיפת שמן מינרלי על גרטיקול.
התאם את ההזרקה ליצירת טיפות של 75 מיקרון, שיתאימו לכ-200 פיקוליטר תמיסה. לאחר מכן, הכינו את העוברים להזרקה. סדרו את כ-21 העוברים בשלב התא לאורך החריץ של צלחת המיקרו-הזרקה כאשר הקוטב הצמחי מכוון לכיוון הגישה של מחט המיקרו-הזרקה, שנמצאת בזווית של 45 מעלות מהחריץ.
כעת, הזריקו את העוברים. בעזרת המחט מחוררים את הכוריון והחלמון, ואז מזריקים את תמיסת המורפולינו הטעונה לחלמון. זה עובד עבור עוברים בשלב תא אחד או שניים.
לאחר הזרקת כל העוברים, השתמש בפסטר רחב כדי לאסוף אותם. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחות פטרי מלאות במי עוברים, ודוגרים אותם בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר אחר הצהריים, שאבו עוברים מתים והחליפו את מי העוברים.
למחרת בבוקר, לאחר שהעוברים עברו קיבה, יש לעכב את המלניזציה שלהם על ידי החלפת המים שלהם במי עוברים המכילים כמות מזערית של PTU. היזהר, PTU ישבש את ההתפתחות התקינה לפני קיבה. מאוחר יותר, בשלב ההתפתחותי הרצוי, יש לפרק את העוברים בפינצטה חדה.
בעזרת המיקרוסקופ, תפסו את הכוריון עם פינצטה אחת, ונסו לתפוס את הצד השני של הכוריון עם זוג פינצטה שני. לאחר מכן, משוך בזהירות את הפינצטה מבלי להפריע לעובר. לאחר מכן, הרדמו את העוברים עם טריקאין, והמשיכו להטמיע את העוברים והאגרוז על רשת רילוקיישן של 15 מיקרון המונחת במיקרו-צלחת זכוכית עם תחתית כיסוי.
לאחר מכן, טען מיליליטר אחד של אגרוז מומס לתוך צינורות תגובה של 1.5 מיליליטר. הכניסו את הצינורות לקוביות חום המוגדרות ל -36 מעלות צלזיוס, והמתינו שיתקררו. לאחר מכן, בעזרת פיפטה רחבה, העבירו עובר לצלחת המיקרו.
שואבים את עודפי מי העובר ומכסים את העובר באגרוז. בזמן שהאגרוז עדיין נוזלי, השתמש בשני קצות פיפטה קטנים כדי לכוון את העוברים. מקם את מבנה העניין, במקרה זה, את הפרונפרו, קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית, ובסמיכות לרשת.
הרשת לא צריכה לכסות את מבנה העניין. זה יתרון להטמיע עד ארבעה עוברים במיקרו-כלים שונים, ולתכנן לצלם את הטוב ביותר. הטמעה נכונה דורשת תרגול מסוים.
בעוד האגרוז עדיין נוזלי, יש לכוון את העובר למיקום הרצוי. אם זה פרונפרוס קרוב לתחתית הזכוכית, ובמרחק מתאים לרשת הרילוקיישן. בדוק את האגרוז באופן שגרתי.
ברגע שקשה מספיק להחזיק את העוברים, הניחו לו להתייצב עוד שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, כסו את העובר המוטבע במי עובר המכילים כמויות עקבות של PTU וטריקאין. שפכו או שאבו את עודפי מי העובר וננעלו את המכסה כדי למנוע אידוי.
התוצאה לא אמורה להיות בועות אוויר. כעת ניתן לצלם את העובר כשתחתית הזכוכית פונה לעדשת האובייקטיב. באמצעות ההכנה ליצירת תמונות פסק, למשל, על ידי צילום תמונות Z-stack מעת לעת במשך מספר שעות, יש צורך לתקן את סחף המוקד.
במידת האפשר, החל אסטרטגיית מיקוד אוטומטי. החלף את אפשרות המיקוד האוטומטי בבקרת התוכנה. עבור ערוץ הייחוס, בחר את ערוץ השדה הבהיר של האור המועבר כדי למזער את רעילות הצילום.
כמו כן, חיוני לבחור טווח חיפוש תלוי דגימה גדול מספיק כדי שהפוקוס האוטומטי יעבוד כראוי. לפני איסוף תמונות, מקם נקודה מסוימת של הרשת המוטבעת קרוב למבנה העניין בכוונת התוכנה, ולאחר מכן שמור מיקום זה באמצעות צילום מסך. לאחר מכן, רגע לפני סיום כל מרווח זמן הדמיה, עיין בצילום המסך והתאם מחדש את מיקום ה-stagה ואת המיקוד אם המיקוד האוטומטי אינו בשימוש.
השיטה המוצגת שימשה לניתוח התפתחות הכליות בעוברים שעברו שינוי WT1A של חוט דגי זברה מהונדסים. במהלך הפרוגניות המוקדמות, קו זה בחר בפלואורסצנטיות ירוקה במזודרם הביניים שבו נוצרים אבות הכליה, ומאוחר יותר במהלך ההתפתחות בצינורות היוצרים ובפרימורדיה של הנפרון. הדמיית זמן-lapse חשפה נפרוגנזה תקינה בעוברים שהזריק מורפולינו.
20 שעות לאחר ההפריה נראו הצינוריות הפרונפריות המתפתחות. בקצותיהם הקדמיים ניתן היה לזהות הצטברות כדורית של תאים המייצגים את פרימורדיה הנפרון הנוצר. במהלך השעות הבאות גדלו צינוריות ופרימורדיה נפרון, והפרימודיה החלה להתמזג בקו האמצע.
לעומת זאת, נפרוגנזה שובשה קשות אצל המוטאנטים. למרות שמבנים צינוריים חיוביים ל-GFP נראו 20 שעות לאחר ההפריה, הם היו מפוזרים ולא מפותחים. הדמיה בהילוך מהיר הראתה שפרימורגיה של נפרון מעולם לא נוצרה, ומספר מדהים של תאים פלואורסצנטיים הממוקמים מחוץ לפרונפרונים המתפתחים נדדו דרך הגחון, ועזבו את השדה הפרונפרי
.בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי היעדר ציוד נוסף, כגון בקרת טמפרטורה או טבלאות נגד אידוי דורש בדיקות קבועות עבור סחיפות והתאמות מחדש. לאחר הליך זה, ניתן לעבד עוברי תמונה לביצוע שיטות אחרות, כמו אימונוהיסטוכימיה, אינסטרוה-היפרטיזציה או PCR בזמן אמת על מנת לזהות רכיבים ספציפיים של תאים, רקמות או להעריך ביטוי גנים.
סקירה כללית
שיטה זו מאפשרת ניתוח של התפתחות איברים בעוברים של דגי זברה באמצעות צילום רצף (time-lapse) תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי. היא מאפשרת תצפית ישירה על רקמות והתפתחות איברים לאורך מספר שעות, ומספקת תובנות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה של דגי זברה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- דימוי במרווחי זמן (Time-lapse imaging) הוא חיוני לחקר תהליכי התפתחות.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות מורכבות ויקרות.
- שיטה זו מציעה חלופה פשוטה וזולה יותר.
- ניתן ליישמה על מגוון אורגניזמי מודל.
מטרת המחקר
- כדי להקל על תצפית על התפתחות איברים בעוברי חיים.
- כדי לספק שיטה קלה לשימוש ובעלת עלות-תועלת.
- כדי לאפשר לחוקרים לחקור תהליכי התפתחות דינמיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של דגי זברה בוגרים להרבייה.
- מיקרו-הזרקה של תמיסות Morpholino לעוברי דגים.
- הטמעה של עוברי דגים באגרוז עבור דימיון.
- דימיון Time-lapse באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי.
תוצאות עיקריות
- תצפית מוצלחת על התפתחות איברים בעוברי דגי זהב.
- הוכחת יעילות השיטה לדימות במרווחי זמן (time-lapse).
- אספקת תובנות לגבי שינויים מרחביים וזמניים במהלך ההתפתחות.
- הצגת התאמה לתהליכי התפתחות וארגוניים אחרים.
מסקנות
- שיטה זו היא כלי בעל ערך למחקר בביולוגיה התפתחותית.
- היא מפשטת את תהליך המעקב אחרו שלו של עוברים לאורך זמן.
- היא פותחת נתיבים חדשים לחקר תופעות התפתחותיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מספקת גישה נגישה להדמיה של התפתחות איברים (organogenesis) בשיטת time-lapse בעוברים של דגי זברה, ומאפשרת תצפית ישירה על תהליכים התפתחותיים ללא צורך בתשתיות מיקרוסקופיה מורכבות או יקרות. על ידי תמיכה בהדמיה אורכית של דינמיקת רקמות במודל של חולייתן, היא מקלה על תיקוף מטרות בשלב מוקדם והפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. הטכניקה מציעה חלופה חסכונית להפקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על אירועים מורפוגנטיים הרלוונטיים למידול מחלות ולסריקה פנוטיפית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד גנים בהתפתחות הכליות על ידי ויזואליזציה של שינויים מרחביים וזמניים בנפרוגנזה (nephrogenesis) בעקבות knockdown של wt1a.
- ערך תפעולי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות ויזואליזציה ישירה של היווצרות צינורות הפרונפרוס (pronephric tubule) ומיזוג פרימורדיה של נפרונים בעוברים חיים.
- ערך ניבוי: מקל על הערכת החומרה הפנוטיפית במודלים של מורפנטים, ובכך מסייע בהערכת רמת הביטחון ביעד עבור נתיבים של מחלות כליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של z-stack ו-time-lapse של מבני כליה המסומנים פלואורסצנטית, לצורך ניתוח השוואתי בין תנאי בקרה לתנאים מופרעים.
- ערך תפעולי: עושה שימוש במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי עם מיקוד אוטומטי ורשתות מיקום מחדש כדי למזער סחיפה, ובכך משפר את השחזוריות בין מפגשי הדמיה.
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטי הדמיה סטנדרטיים שניתן להשתמש בהם לקביעת פנוטיפים בסיסיים עבור סריקת תרכובות או מחקרי מודיפיקטורים גנטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת תצפית על תהליכי התפתחות שמורים בדגי zebrafish, מערכת רלוונטית למחלות למידול הפרעות בכליות אנושיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשרת מעקב אחר פגמים בנדידה תאית ובמורפוגנזה של תעלות, ובכך מספקת תובנה לגבי השפעות שאינן במטרה (off-target) או השפעות ספציפיות למסלול של הפרעות גנטיות.
- הלימה פרה-קלינית: תומכת במעבר משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי ביסוס מדדי פנוטיפ תלויי-מינון או תלויי-זמן.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור מסלולים כלייתיים שבהם הדמיה דינמית של רקמה מספקת מידע על מנגנון הפעולה והתוצאה הפנוטיפית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בתיקוף פונקציונלי של מטרות כגון wt1a על ידי מתן אפשרות לתצפית בזמן אמת על השלכות התפתחותיות במורד הזרם במערכת חיה.
- סריקה: מייצרת תוצאות מבוססות פלואורסצנציה הניתנות לשחזור, המתאימות להערכת השפעות של תרכובות על מורפוגנזה של הכליות בהקשר של בעלי חוליות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של אורך פרסות, היווצרות פרימורדיה ולוקליזציה תאית לאורך זמן, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפים התפתחותיים מוקדמים לבין תפקוד לקוי של האיבר בשלבים מאוחרים יותר, ובכך תומכת בהערכה מותאמת לסממנים ביולוגיים של רעילות כלייתית או תיקון.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת דימוג ניתנת להרחבה שניתן ליישם במגוון מודלים התפתחותיים ומערכות איברים עם הגדרה מחדש מינימלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מנגונית בתיקוף מטרות על ידי קישור הפרעה גנטית לפגמים התפתחותיים ניתנים לצפייה בהקשר פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות תיקון סחיפה מבוסס חומרה (מיקוד אוטומטי, רשתות מיקום מחדש) והכנה סטנדרטית של העוברים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות לגבי המשכת התהליך (go/no-go) באמצעות אספקת אישור חזותי מוקדם של מודולציה של נתיבים בבדיקה של אורגניזם שלם.
- השפעה על פורטפניו: מאפשר תיעוד ותיעדוף של מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על החומרה והספציפיות של פנוטיפים התפתחותיים שנצפו in vivo.
שיקולי יישום
- היישום המוצלח דורש מומחיות בגידול דגי זבראפיש (zebrafish), בהזרקה מיקרוסקופית (microinjection) ובסיווג שלבי התפתחות העוברים.
- התהליך תלוי במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי עם יכולת z-stack ותוכנה התומכת במיקוד אוטומטי (autofocus) ובמיקום מחדש של השולחן.
- נדרש סטנדרס של הטמעת העוברים בג'ל אגרוז (agarose) ושל אוריינטציית העוברים כדי להבטיח איכות דימוי עקבית בין משתמשים ובמפגשים שונים.
- התאמה לאיברים או למודלים אחרים עשויה לדרוש שינויים ברפורטרים טרנסגניים, בתזמון ההזרקה או בסיווג שלבי ההתפתחות.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה יותר בהשוואה למערכות אוטומטיות ומאמץ ידני הנדרש לניטור סחף (drift) כאשר לא נעשה שימוש במיקוד אוטומטי.
