מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

המטרה הכוללת של הליך זה היא לארגן הכלאה גנומית השוואתית כדי לזהות חוסר איזון בגנום שיכול להוביל למגוון רחב של מחלות גנטיות. זה מושג על ידי תיוג ה-DNA של המטופל בצבע פלואורסצנטי. בשלב השני, המטופל, ה-DNA ו-DNA ייחוס המסומן באופן שונה, מוכלאים למערך.

לאחר מכן, המערך נסרק כדי למדוד את כמות המטופל והתייחסות ל-DN בשפע לכל בדיקה. בשלב האחרון, התמונה הסרוקה מעובדת כדי לזהות את אזורי הגנום שבהם ל-DNA של המטופל יש יותר או פחות חומר מאשר מערך ה-DNA הייחוס בסופו של דבר. הכלאה גנומית השוואתית משמשת כדי לקבוע אם המטופל נושא וריאנט מספר עותק המביא לתסמונת גנטית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהרכבה של שקופית המערך יכולה להיות קשה והיא קלה להכלאה. מערבבים את הדליפה מהתא לפני תחילת תגובת התיוג. הפשירו את צלחת 96 הבאר המוכנה לשימוש של נוקלאוטידים ופריימרים בארבע מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור למשך כשעה.

לאחר ההפשרה, יש לאזן את הצלחת המכוסה למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר, לאזן את דגימות ה-DNA למשך 15 דקות ב-60 מעלות צלזיוס גם בשלב זה. בזמן שהדגימות מתחממות, השתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי להזרים מספיק מים נטולי נוקלאז לכל באר של צלחת חדשה של 96 בארות. לאחר מכן, כאשר ה-DNA מוכן, העבירו מיקרוגרם אחד של דגימה לכל באר לצלחת המים של 96 בארות.

כעת העבירו 20 מיקרוליטר של הנוקלאוטידים והפריימרים המאזנים לכל אחת מהצלחת המכילה את דגימות ה- DNA המדוללות ואטמו את הצלחת במכסי רצועה תוך הקפדה על אטימה הדוקה. לאחר מכן, דנטורציה של ה-DNA ב-99 מעלות צלזיוס במכונת PCR עם מכסה מחומם לאחר 10 דקות וברך את הפריימרים על ידי קירור הצלחת על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש ברובוט הטיפול בנוזלים כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של אנזים אקסו DNA פולימראז לכל דגימה.

מערבבים את הדגימות על ידי פיפטה ולאחר מכן אוטמים ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. למחרת סיים את התגובה עם חמישה מיקרוליטרים של מאגר עצירה לכל באר ואז הסר את הנוקלאוטידים הלא משולבים. העבירו את תכולת כל באר לצינורות בודדים של שני מיליליטר מסומנים מראש.

טען את הדגימות ואת עמודות הסיבוב לטיהור ה-DNA לרובוט לעיבוד עמודות ספין, כמו גם את המאגרים המתאימים הנלווים. על פי הוראות היצרן, רובוט עיבוד עמודות הספין יקשור את ה-DNA המסומן לקרום הסיליקה עם 250 מיקרוליטר של מאגר קשירת DNA עם מלח גבוה לכל צינור, ולאחר מכן יוסרו הזיהומים מהממברנות בשתי שטיפות של 500 מיקרוליטר מאגר כביסה כל אחת. לאחר מכן הרובוט יוסיף 15 מיקרוליטר של מאגר תמיסת מלח נמוכה לממברנות כדי לשחזר את דגימות ה-DNA המסומנות המטוהרות בנפחים של כ-12 מיקרוליטר כדי להכליא את הדגימות.

לאחר מכן מחממים תנור הכלאה ל 65 מעלות צלזיוס ומחממים מראש את מגלשות הגיבוי ותאי ההכלאה. להכנת תערובת ההכלאה, שלבו 1.1 מיקרוליטר עריסה, 1D NA 4.95 מיקרוליטר של תערובת החסימה שסופקה על ידי היצרן, ו-24.75 מיקרוליטר של מאגר הכלאה. השתמש ברובוט הטיפול בנוזלים כדי להקצות את התערובת הזו לכל באר של צלחת חדשה של 96 בארות ולהרטיב מראש כל קצה כדי לשפר את דיוק ההעברה.

לאחר מכן פיפטה 9.35 מיקרוליטר של הסימן המתאים, שלושה מסומנים DNA, ואחריהם 9.35 מיקרוליטר של הסימן המתאים, חמישה מסומנים DNA. לכל באר אטום את הצלחת, ארבע את הדגימות למשך דקה אחת, ותן לצלחת סיבוב מהיר כדי לאסוף את התכולה בתחתית כל אחת. ובכן דנטור את ה- DNA המסומן בחממה טרום הכלאה.

תחילה למשך שלוש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. ואז עובד על פלטפורמה מחוממת של 42 מעלות צלזיוס. הנח את שקופית הגיבוי לתוך תא ההכלאה, וודא שהחלק השקוף של האטם מתיישר עם החלק החלון של תא ההכלאה באמצעות טיפים רטובים מראש.

כעת פיפטה לאט 42 מיקרוליטר מתערובת ההכלאה למרכז המיקום המתאים של שקופית הגיבוי של המערך. הקפדה שהנוזל לא ייגע בגבול טבעת הגומי. לאחר מילוי כל המיקומים, הורד בזהירות את שקופית המערך על מגלשת הגיבוי והרכיב את תא ההכלאה.

הקפד שהצד של המערך עם הכתיבה פונה לשקופית הגיבוי, ואז הדק את בורג תא ההכלאה במלואו ובדוק את תא ההכלאה המורכב, וודא שאין דליפה של הכלאה. מערבבים מחוץ לגבולות טבעת הגומי ושגובה כל בועת אוויר הוא כארבעה מילימטרים. כאשר תא ההכלאה מונח על קצהו אנכית, סובב את תא ההכלאה כדי לבדוק זאת.

כל בועות האוויר בכל תנוחה זזות. אם אחת מהבועות תקועה, תן לתא ברז חד על הספסל. לאחר מכן הכניסו את תאי ההכלאה לתנור המסתובב בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

למחרת טבלו את תאי ההכלאה במאגר הכביסה הראשון, והשתמשו בזוג מלקחיים שטוחים מפלסטיק כדי להפריד בין המגלשות. לאחר מכן השליכו את שקופיות האטם והניחו את שקופיות המערך לתוך מתלה שקוע במאגר טרי. שטפו את החלקות המערך בכ-700 מיליליטר של מאגר כביסה למשך דקה עד חמש דקות, תוך ערבוב נמרץ עם פרעוש וכוכב מגנטי.

לאחר מכן העבירו את שקופיות המערך לכ-700 מיליליטר של מאגר כביסה, שניים למשך 90 שניות תוך ערבוב נמרץ יותר בסוף הכביסה השנייה. הרם בעדינות את מגלשות המערך אל מחוץ למאגר. הם צריכים לצאת יבשים.

לאחר מכן טען את שקופיות המערך לתוך מחזיקי השקופיות בסורק יחד עם מגיני השקופיות, ולאחר מכן סרוק את הדגימות. על פי הוראות יצרן המערך, כל בדיקה במערך היברידי מוצגת כתערובת של פלואורוכרומים אדומים וירוקים. היחסים בין אות פלואורסצנטי אדום לירוק עבור כל בדיקה מכומתים על ידי הסורק והתוכנה המשויכת מבטלת אותם כשני יחסי יומן בהתאם למיקום הגנומי שלהם.

עקבות המערך המתקבלות מאפשרות פרשנות של אזורים שזוהו כלא מאוזנים מבחינה גנומית. לדוגמה, בעקבות זה של ילד עם תסמונת וויליאמס, תסמונת מיקרו מחיקה חוזרת המתווכת על ידי חזרות עותק נמוכות באזור הפרוקסימלי של כרומוזום שבע, חוסר האיזון הגנומי זוהה על ידי התוכנה עם קו אדום. יחס הלוג הפלואורסצנטי של האביזר צריך להתקבץ קרוב לאפס, מה שמצביע על יחס ירוק לאדום של אחד לאחד עבור אזורים נורמליים של הגנום.

עקבות מערך מפוזרות כפי שנצפו בסריקה זו, עלולות לגרום לקריאה לא מדויקת של האזורים החריגים, או לכשל בזיהוי חוסר האיזון הגנומי ועלולים להיגרם ממספר גורמים, כולל איכות DNA ירודה, או נוכחות של קרניים, רמות אוזון בכדור האטמוספירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבד דגימות מטופלים לבדיקה על ידי A CGH ולהפיק נתונים באיכות טובה לניתוח במורד הזרם וזיהוי וריאציה של מספר עותקים.