מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

המטרה הכללית של הליך זה היא ביצוע היברידיזציה גנומית השוואתית על מערך (array comparative genomic hybridization) כדי לזהות חוסר איזון בגנום שעלול להוביל למגוון רחב של מחלות גנטיות. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון ה-DNA של המטופל בצבע פלואורסצנטי. בשלב השני, ה-DNA של המטופל ו-DNA ייחוס מסומן בצורה שונה, עוברים היברידיזציה למערך.

בשלב הבא, סורקים את המערך כדי למדוד את כמות ה-DNA של המטופל וה-DNA של הביקורת הקשורים לכל גשוש (probe). בשלב הסופי, מעבדים את התמונה הסרוקה כדי לזהות את האזורים בגנום שבהם כמות ה-DNA של המטופל גבוהה או נמוכה מזו של ה-DNA של הביקורת במערך. היברידיזציה גנומית השוואתית משמשת לקביעה האם המטופל נושא וריאציה במספר העותקים הגורמת לתסמונת גנטית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הרכבת שקופית המערך עלולה להיות קשה וקל להרס ההכלה. ערבב את התוכן ששפך מהתא לפני תחילת תגובת הסימון. הפשר את פלטת 96 הבארים המוכנה לשימוש של הנוקלאוטידים והפריימרים בטמפרטורה של 4°C תחת הגנה מאור למשך כשעה.

לאחר ההפשרה, יש להמתין 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר כדי להביא את הפלטה המכוסה לשיווי משקל תרמי; במקביל, יש להמתין 15 דקות בטמפרטורה של 60 °C כדי להביא את דגימות ה-DNA לשיווי משקל תרמי. בזמן חימום הדגימות, יש להשתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי להעביר כמות מספקת של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לכל באר בפלטה חדשה בעלת 96 בארות. לאחר שה-DNA מוכן, יש להעביר מיקרוגרם אחד של דגימה לכל באר בפלטת המים בעלת 96 הבארות.

כעת העבירו 20 µL מהנוקלאוטידים ומהפריימרים המשמשים לשיווי המשקל לכל אחת מהבארים בלוח המכיל את דגימות ה-DNA המדוללות, ואטמו את הלוח באמצעות מכסי רצועה (strip caps) תוך הקפדה על איטום הדוק. לאחר מכן, בצעו דנטורציה ל-DNA בטמפרטורה של 99 °C במכשיר PCR בעל מכסה מחומם למשך 10 דקות, והקרינו (anneal) את הפריימרים באמצעות קירור מהיר (snap cooling) של הלוח על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמשו ברובוט לטיפול בנוזלים כדי להוסיף 10 µL של אנזים clean out exo DNA polymerase לכל דגימה.

ערבב את הדגימות באמצעות פיפט, ולאחר מכן אטום והדגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 שעות. למחרת, הפסק את התגובה באמצעות 5 µL של תמיסת עצירה (stop buffer) לכל באר. לאחר מכן, הסר את הנוקלאוטידים שלא נקשרו. העבר את תכולת כל באר למבחנות נפרדות של 2 mL המסומנות מראש.

העמסו את הדגימות ואת עמודי הספין לטיהור DNA לתוך רובוט לעיבוד עמודי ספין, וכן את הבאפרים המתאימים הנלווים. בהתאם להוראות היצרן, הרובוט לעיבוד עמודי הספין יקשור את ה-DNA המסומן לממברנת הסיליקה באמצעות 250 µL של באפר לקישור DNA עם ריכוז מלח גבוה לכל מבחנה, ולאחר מכן יוסרו הזיהומים מהממברנות באמצעות שתי שטיפות של 500 µL של באפר שטיפה בכל פעם. לאחר מכן, הרובוט יוסיף 15 µL של באפר תמיסה עם ריכוז מלח נמוך לממברנות כדי לשחזר את דגימות ה-DNA המסומן המטוהרות בנפחים של כ-12 µL לצורך היברידיזציה של הדגימות.

בשלב הבא, חממו מראש תנור היברידיזציה ל-65 °C וחממו מראש את זכוכיות התמיכה ואת תאי ההיברידיזציה. להכנת תערובת ההיברידיזציה, ערבבו 1.1 µL של cot 1D NA, 4.95 µL של תערובת החסימה המסופקת על ידי היצרן, ו-24.75 µL של באפר היברידיזציה. השתמשו ברובוט לטיפול בנוזלים כדי לחלק תערובת זו לכל באר בלוח 96 בארות חדש, תוך הרטבה מראש של כל טיפ כדי לשפר את דיוק ההעברה.

בשלב הבא, פלפט 9.35 µL של ה-DNA המסומן ב-three המתאים, ולאחר מכן 9.35 µL של ה-DNA המסומן ב-five המתאים. לאחר מכן, אטמו את הפלטה בכל באר, חממו את הדגימות למשך דקה אחת, וסובבו את הפלטה במהירות (spin) כדי לרכז את התכולה בתחתית כל באר. דנטורו את ה-DNA המסומן באינקובטור להכנה לקדם-הכלאה (pre hybridization).

ראשית למשך שלוש דקות ב-95 °C, ולאחר מכן למשך 30 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, עבודה על משטח חימום בטמפרטורה של 42 °C. יש להניח את זכוכית התמיכה לתוך תא ההיברידיזציה, תוך וידוא שהחלק השקוף של האטם מיושר עם החלק החלוני של תא ההיברידיזציה, תוך שימוש בטיפים שהורטבו מראש.

כעת, טפטפו באיטיות 42 µL מתערובת ההכלאה (hybridization mix) למרכז המיקום המתאים על שקופית התמיכה של המערך. הקפידו שהנוזל לא ייגע בגבול טבעת הגומי. לאחר מילוי כל המיקומים, הורידו בזהירות את שקופית המערך על שקופית התמיכה והרכיבו את תא ההכלאה.

יש לוודא כי הצד של המערך שעליו מופיע הכיתוב פונה לעבר זכוכית התמיכה, לאחר מכן יש להדק את בורג תא ההיברידיזציה באופן מלא ולבדוק את תא ההיברידיזציה המורכב, כדי לוודא שאין דליפה של תמיסת ההיברידיזציה אל מחוץ לגבולות טבעת הגומי וכי כל בועית אוויר היא בגובה של כ-4 mm. כדי לבדוק זאת, יש להניח את תא ההיברידיזציה במצב אנכי על קצהו ולסובב אותו.

כל בועות האוויר בכל מיקום נעות. אם חלק מהבועות תקועות, הקישו בחוזקה על התא נגד ספסון המעבדה. לאחר מכן, הכניסו את תאי ההיברידיזציה לתנור מסתובב בטמפרטורה של 65 °C למשך 24 שעות.

ביום למחרת, טבול את תאי ההיברידיזציה בבופר שטיפה 1, והשתמש בזוג פינצטות פלסטיק בעלות קצה שטוח כדי להפריד בין השקופיות. לאחר מכן, השלך את שקופיות האטם והנח את שקופיות המערך (array) במעמד הטבול בבופר 1 טרי. שטוף את שקופיות המערך בערך 700 מיליליטר של בופר שטיפה למשך דקה עד חמש דקות, תוך ערבוב נמרץ באמצעות מגנט המגליד (flea) ומערבל מגנטי.

לאחר מכן, העבירו את שקופיות המערך לכ-700 מיליליטר של בופר שטיפה, פעמיים למשך 90 שניות, עם ערבוב נמרץ יותר בסוף השטיפה השנייה. הרימו בעדינות את שקופיות המערך מהבופר. הן אמורות לצאת יבשות.

לאחר מכן, טענו את שקופיות המערך לתוך מחזיקי השקופיות בסורק יחד עם מגני השקופיות, וסרקו את הדגימות. בהתאם להוראות יצרן המערך, כל גשש (probe) במערך שעבר היברידיזציה מוצג כתערובת של פלואורוכרומים אדומים וירוקים. יחסי האות הפלואורסצנטי האדום לירוק עבור כל גשש נמדדים כמותית על ידי הסורק והתוכנה הנלווית, הממפה אותם כיחסי log two בהתאם למיקומם הגנומי.

עקבות המערך המתקבלים מאפשרים פענוח של אזורים שזוהו כלא מאוזנים גנומית. לדוגמה, בעקבה זו מילד עם תסמונת ויליאמס, תסמונת מיקרו-מחיקה חוזרת המתווכת על ידי חזרות בעותקים נמוכים באזור הפרוקסימלי של כרומוזום 7, אי-האיזון הגנומי זוהה על ידי התוכנה באמצעות קו אדום. יחס הלוג של הפלואורסצנציה אמור להתרכז סביב אפס, מה שמעיד על יחס של אחד לאחד בין צבע ירוק לאדום עבור אזורים תקינים בגנום.

עקבות מערך מפוזרים כפי שנצפו בסריקה זו, עלולים להוביל לזיהוי שגוי של אזורים חריגים, או לכשל בזיהוי חוסר איזון גנומי, ועשויים להיגרם ממספר גורמים, כולל איכות DNA נמוכה, או נוכחות של קרניים ורמות של אוזון באטמוספירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן עיבוד דגימות חולים לבדיקה באמצעות aCGH ולהפקת נתונים באיכות גבוהה לצורך ניתוחים המשכיים וזיהוי וריאציות במספר העותקים.