Name: מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למדו להשתמש בטכניקת aCGH לאיתור שוניי מספר עותקים בגנום האנושי. שיטה זו מאפשרת אבחון מדויק של תסמונות גנטיות ומחלות תורשתיות מורכבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין אישורים.

תגובת 1. תוויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש dUTPs, מראש aliquot cyanine 3 ו -5 שכותרתו, נוקלאוטידים ללא תווית ופריימרים אקראיים בריכוזים מומלץ יצרן ל96-גם צלחות וחנות ב -20 מעלות מוכנות לשימוש. למטרות פרוטוקול זה, aliquot 10.5 μl של dUTP שהכותרת המתאימה ו10.5 μl נוקלאוטידים ללא תווית ופריימרים אקראיים היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הצלחת מוכנה לשימוש 96-היטב של נוקלאוטידים ופריימרים על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעה, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהפשיר, לאזן צלחת זה ב RT לפחות 30 דקות, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דגימות DNA ב 60 ° C לפחות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט טיפול נוזלי, לוותר nuclease ללא מים היטב בכל צלחת 96-היטב. הערה: נפח מים יהיה תלוי בריכוז של כל דגימת DNA קלט וצריך להיות מספיק כדי לגרום לריכוז סופי של 50 ng / ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות האן נוזלירובוט dling, פיפטה 1 מיקרוגרם של ה- DNA לתוך באר של צלחת 96-היטב (ראה 1.5) כדי להביא את הנפח הכולל עד 20 μl. הערה: כמויות קטנות יותר של ה- DNA ניתן להשתמש למרות שהאיכות וכתוצאה מכך הנתונים עלולה לסכן (לדגימות יקרות, ניתן להשתמש בם כמויות DNA הקלט עד 400 ng). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט נוזל טיפול, להעביר 20 μl של נוקלאוטידים ופריימרים equilibrated לבאר כל הצלחת של DNA המדולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 96-היטב עם כובעי רצועה (חותם חזק הוא קריטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל DNA ב -99 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במכונה PCR עם מכסה מחומם ולאחר מכן הצמדתי מגניב על קרח למשך 5 דקות כדי פריימרים לחשל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט טיפול נוזלי, להוסיף 10 μl של אנזים פולימראז Klenow Exo DNA לכל DNAs ותמהיל פיפטה ביסודיות. הערה: הנפח הכולל צריך להיות 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 96-היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. הערה: דגירה קצרה של 4 שעות היא מספיק עם זאת O / N בcubation יכול להיות נוח יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט טיפול נוזלי, להוסיף 5 μl של חיץ להפסיק את כל טוב. הערה: סיכום של חומרים כימיים המשמשים לתגובת התיוג מוצג בטבלה 1. </li></ol> 2. ההסרה של נוקלאוטידים מאוגדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוקלאוטידים מאוגדים באמצעות עמודות ספין סיליקה-קרום מבוסס ורובוט עיבוד עמודת ספין ייעודי (עמודות הספין גם עשויות להיות מעובד באופן ידני). בצע את הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התוכן של כל אחד גם לצינור 2 מיליליטר; מראש תווית אלה עם תעודת זהות ושל. הערה: ניתן לבצע צעד זה באופן ידני או רצוי באמצעות רובוט טיפול נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים ברובוט עיבוד עמודת ספין, לאחר מכן לטעון את הרובוט עם 2 מיליליטר צינורות, עמודי ספין טיהור DNA ומאגרים כרוכים בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl מלח גבוה, חיץ (PB חיץ) מחייב DNA לתגובת התיוג כדי לאגד את ה- DNA שכותרתו לסיליקהקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר זיהומים על ידי שטיפת הקרום פעמיים עם 500 חיץ לשטוף μl (חיץ PE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 חיץ elution מלח μl נמוך (חיץ EB) הקרום לשחזר את ה- DNA המטוהר, שכותרתו בהיקף של 12 ~ μl. </li></ol></li></ol> 3. מערבבים את זוגות היב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הזוגות המתאימים של cyanine 3 ו- DNA 5 שכותרתו, DNA COT-1, תערובת חסימה סיפק יצרן ומאגר הכלאה-סיפק יצרן באמצעות רובוט טיפול נוזלי. הערה: זוגות היב אלה יכולים להיות דוגמא והתייחסות, או מדגם vs מדגם אם CNVs המשותף הוא לא בעיה (לדוגמא, אנו לשייך באופן שגרתי דגימות פנוטיפ-תואם, כגון חולה dysplasia כליות לעומת מטופל craniosynostosis, כפי שהם מאוד לא סביר לביצוע CNV המשמעותי קליני זהה). אם אתם משתמשים ב- DNA התייחסות, אספקת DNA מסחרית מומלצת, ואת זה צריך להיות מעובד לצד המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ro טיפול נוזליבוט, תוספת 1 COT DNA (3333 ng / μl), חסימת תערובת ומאגר הכלאה היטב בכל צלחת 96-היטב, כך שכל גם מכיל COT-1 DNA 1.1 μl, תערובת חסימת 4.95 μl ו24.75 שסופק על-יצרן מאגר הכלאה μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9.35 μl של DNA cyanine המתאים 3 שכותרתו היטב כל אחד. טרום רטוב כל קצה כדי לשפר את דיוק pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9.35 μl של DNA cyanine המתאים 5 שכותרתו היטב כל אחד. טרום רטוב כל קצה כדי לשפר את דיוק pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 96-היטב ומערבולת דקות 1. ספין צלחת 96-היטב כדי לאסוף תוכן בחלק התחתון של כל טוב. </li></ol></li></ol> 4. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים תנור הכלאה ל65oC וprewarm שקופיות גיבוי אחד ותא הכלאה אחת עבור כל שקופית מערך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל DNA שכותרתו בדגירת הכלאה מראש לפני שהחלת על המערכים. לבצע הכלאה בתנור מסתובב למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת 96-גם על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לעזוב ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובד על פלטפורמה מחוממת על 42 מעלות צלזיוס, לטעון כל שקופית גיבוי לתא הכלאה לפני השימוש. ודא שהחלק השקוף של שקופית האטם מיושר עם החלק &#39;חלונות&#39; של תא ההכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 42 μl של תמהיל ההכלאה שהוכן קודם לכן (ראה סעיף 3) על העמדה המתאימה במערך גיבוי שקופיות. טרום רטוב כל קצה כדי לשפר את דיוק pipetting. Pipet לאט על המרכז של כל עמדה, כדי לוודא שהנוזל לא נוגע בגבול טבעת גומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל העמדות בשקופית הגיבוי מלאות, להוריד בזהירות את שקף המערך עליו ולהרכיב את תא ההכלאה. ודא שהצד של המערך עם כתיבה על זה עומד בפני שקופיות הגיבוי. הקפד להדק את בורג תא הכלאה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תא ההכלאה התאסף. ENsure שאין דליפה של תערובת הכלאה מחוץ לגבולות טבעת הגומי וכל בועת אוויר היא ~ 4 מ&quot;מ הגובה, כאשר תא ההכלאה הוא נח על הקצה שלה בצורה אנכית. סובב את תא ההכלאה ולבדוק שאין בועות אוויר שתקועים בעמדה ולא זז. אם יש בכל אלה, נותנים החדר ברז חד על הספסל. בדוק שכל בועות האוויר נעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא ההכלאה לתנור מסתובב על 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ודא הרוטור התנור הוא מאוזן; להשתמש תאים ריקים אחרים במידת צורך. </li></ol></li></ol> 5. כביסה וסריקת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מערכים להסיר DNA שכותרתו עודף ולאחר מכן לסרוק למדוד הקרינה של כל בדיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תאי הכלאה מתוך תנור ולפרק. שקופיות המערך ואטם תהיה תקועות יחד; לצלול אלה בחיץ לשטוף 1 ולהשתמש זוג המלקחיים פלסטיק, קצוות שטוחים לחטט אותם בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Discard שקופית האטם ובמקום להחליק לתוך המערך מתלה שקוע במאגר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שקופית המערך ב~ 700 מיליליטר של חיץ לשטוף טרי 1 למשך 5 דקות, תוך בחישה נמרצת (להשתמש פשפשים ובוחש מגנטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שקופית המערך לחיץ לשטוף ~ 700 מיליליטר 2 ולשטוף עבור 90 שניות, תוך בחישה נמרצת. רם בעדינות את שקופיות מערך מלשטוף חיץ 2, הם צריכים לצאת יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את שקופית המערך להחזיק שקופיות של הסורק, משתמש במגן שקופית. טען את השקופיות לתוך סורק המערך ולסרוק הבאים הוראות יצרן המערך. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מערך CGH לא יזהה שחלופים מאוזנים או הפרעות ploidy כגון triploidy. יתר על כן, חוסר איזון פסיפס רמה נמוכה עשוי שלא להיות מזוהה. עם זאת, יש מערך CGH רזולוציה גבוהה יותר לזיהוי CNV מאשר ניתוח כרומוזום התאגדו-G בו החליף במעבדות ציטוגנטיקה רבות. לכן תקן הזהב הנוכחי לגילוי CNV הגנום. זה יכול להיות מוחלף על ידי טכנולוגיות רצף של הדור הבא בעתיד, אבל כרגע, עלותם והמורכבות הטכנית הקשורות בשימוש קצר קוראים לגילוי CNV אומר שזה עדיין לא בכושר טוב לשימוש קליני. <p class="jove_content" style=...

זה כבר ידוע במשך שנים רבות כי מחיקות או עותקים נוספים של מגזרי כרומוזומליות לגרום לנכות אינטלקטואלית, dysmorphism ומומי congentical, ובמקרים מסוימים לגרום לתסמונות גנטיות 1. עם זאת, הטכנולוגיה זמינה רק עד אמצע שנתי ה -2000 לגילוי הגנום של שינויים אלה יכול הייתה G-התאגדה ניתוח כרומוזום, שבו יש רזולוציה של כ 5-10Mb, בהתאם לאזור והטבע של חוסר האיזון, ושלא לזהות כרומוזומים לא נורמלים שבו חומר הוחלף באזור מכרומוזום שונה עם אותו דפוס פסים. טכניקות ציטוגנטית נלוות כגון הקרינה הכלאה באתר והגברת בדיקה קשירה ספציפית זמנית היו זמינות לחקירה של לוקוסים ספציפיים, במקרים של חוסר איזון syndromic הספציפי חשוד, אבל זה לא היה עד כניסתה של הכלאה גנומית השוואתית מערך (מערך CGH) לs אבחון הקלינית שגרתיתervice 2-5 שגילוי הגנום של עותק מספר הגרסאות (CNVs) התאפשר ברזולוציה גדלה מאוד (בדרך כלל סביב 120kb). עבודת שירות קלינית לצד מחקרים הראה כי CNVs לאזורים מסוימים נפוצים באוכלוסייה הרגילה 6-7, תוך CNVs האחר, בלתי ניתן לגילוי בעבר, המשויכים neurodisabilities כגון אוטיזם ואפילפסיה 8-11. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משמש במעבדה לאבחון הקלינית שירות הבריאות הלאומי בבריטניה (NHS); אנו משתמשים באסטרטגיות רומן הכלאה, בדיקות אצווה ורובוטיקה למזער את העלות בשירות במימון מדינה זו. לפני הפרוטוקול המפורט להלן, DNA באיכות גבוהה צריך להיות מופק מהחומר המוצא המתאים, בדרך כלל הדם, תאים בתרבית או דגימות רקמה. Spectrophotometry ניתן להשתמש כדי למדוד ריכוז (צריך להיות&gt; 50 ng / ul) ולבדוק 260: 280 יחסים ספיגה (צריך bדואר 1.8-2.0). ג&#39;ל אלקטרופורזה יכולה לשמש כדי לבדוק שה- DNA הוא של משקל מולקולרי גבוה בלי השפלה משמעותית. פרוטוקול זה מיועד למעבדות תפוקה גבוהות יותר, כי הם תיוג 96 דגימות לטווח באמצעות רובוטיקה טיפול הנוזלית אוטומטית. עם זאת, זה עשוי להיות מותאם למעבדות תפוקה נמוכות יותר ללא אוטומציה.

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH wash buffers</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>מערך CGH מאגר הכלאה</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור מינלוט</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיוג CGH</td><td>מערך Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

מערך השוואתי הגנום הכלאה (array cgh) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

מערך CGH לזיהוי וריאנטים של מספר עותקים גנומיים החליף ניתוח קריוטיפ עם פס G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה ויישומה במעבדה של שירות אבחון קליני. DNA המופק מדגימת המטופל (דם, רוק או סוגי רקמות אחרים) מסומן בפלואורוכרום (ציאנין 5 או ציאנין 3). דגימת DNA ייחוס מסומנת עם הפלואורוכרום ההפוך. לאחר מכן יש שלב ניקוי להסרת נוקלאוטידים לא משולבים לפני שה-DNA המסומן מעורבב ומושעה מחדש במאגר הכלאה ומוחל על מערך הכולל ~60,000 בדיקות אוליגונוקלאוטידים מאתרים ברחבי הגנום, עם צפיפות בדיקה גבוהה באזורים חשובים מבחינה קלינית. לאחר הכלאה, המערכים נשטפים, ואז נסרקים והתמונות המתקבלות מנותחות כדי למדוד את הקרינה האדומה והירוקה עבור כל בדיקה. תוכנה משמשת להערכת האיכות של כל מדידת בדיקה, חישוב היחס בין הקרינה האדומה לירוקה וזיהוי וריאנטים פוטנציאליים של מספר עותקים.

כל בדיקה על מערך הכלאה היא דמיינה כתערובת של fluorochromes האדום והירוק (ראה איור 1). היחס של אדום לאות ניאון ירוק עבור כל בדיקה הוא לכמת על ידי הסורק והתוכנה נלווית חלקות אלה כיחסי log2 על פי העמדה הגנומי שלהם, ומזהה אזורים נופלים גבולות מוגדרים מראש מחוץ. עקבות מערך וכתוצאה מכך לאפשר פרשנות של אזורים שזוהו כgenomically לא מאוזן. לדוגמא, העקבות מילד עם תסמונת ויליאמס, תסמונת microdeletion חוזרת בתיווכו של חזרות נמוכות עותק באזור הפרוקסימלי של כרומוזום 7, מתוארת <...

מערך CGH לצורך זיהוי של גרסאות עותק מספר הגנומי החליף ניתוח קריוטיפ התאגדו-G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה והיישום שלה במעבדת שירות לאבחון.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ביצוע היברידיזציה גנומית השוואתית על מערך (array comparative genomic hybridization) כדי לזהות חוסר איזון בגנום שעלול להוביל למגוון רחב של מחלות גנטיות. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון ה-DNA של המטופל בצבע פלואורסצנטי. בשלב השני, ה-DNA של המטופל ו-DNA ייחוס מסומן בצורה שונה, עוברים היברידיזציה למערך.בשלב הבא, סורקים את המערך כדי למדוד את כמות ה-DNA של המטופל וה-DNA של הביקורת הקשורים לכל גשוש (probe). בשלב הסופי, מעבדים את התמונה הסרוקה כדי לזהות את האזורים בגנום שבהם כמות ה-DNA של המטופל גבוהה או נמוכה מזו של ה-DNA של הביקורת במערך. היברידיזציה גנומית השוואתית משמשת לקביעה האם המטופל נושא וריאציה במספר העותקים הגורמת לתסמונת גנטית.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הרכבת שקופית המערך עלולה להיות קשה וקל להרס ההכלה. ערבב את התוכן ששפך מהתא לפני תחילת תגובת הסימון. הפשר את פלטת 96 הבארים המוכנה לשימוש של הנוקלאוטידים והפריימרים בטמפרטורה של 4°C תחת הגנה מאור למשך כשעה.לאחר ההפשרה, יש להמתין 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר כדי להביא את הפלטה המכוסה לשיווי משקל תרמי; במקביל, יש להמתין 15 דקות בטמפרטורה של 60 °C כדי להביא את דגימות ה-DNA לשיווי משקל תרמי. בזמן חימום הדגימות, יש להשתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי להעביר כמות מספקת של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לכל באר בפלטה חדשה בעלת 96 בארות. לאחר שה-DNA מוכן, יש להעביר מיקרוגרם אחד של דגימה לכל באר בפלטת המים בעלת 96 הבארות.כעת העבירו 20 µL מהנוקלאוטידים ומהפריימרים המשמשים לשיווי המשקל לכל אחת מהבארים בלוח המכיל את דגימות ה-DNA המדוללות, ואטמו את הלוח באמצעות מכסי רצועה (strip caps) תוך הקפדה על איטום הדוק. לאחר מכן, בצעו דנטורציה ל-DNA בטמפרטורה של 99 °C במכשיר PCR בעל מכסה מחומם למשך 10 דקות, והקרינו (anneal) את הפריימרים באמצעות קירור מהיר (snap cooling) של הלוח על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמשו ברובוט לטיפול בנוזלים כדי להוסיף 10 µL של אנזים clean out exo DNA polymerase לכל דגימה.ערבב את הדגימות באמצעות פיפט, ולאחר מכן אטום והדגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 שעות. למחרת, הפסק את התגובה באמצעות 5 µL של תמיסת עצירה (stop buffer) לכל באר. לאחר מכן, הסר את הנוקלאוטידים שלא נקשרו. העבר את תכולת כל באר למבחנות נפרדות של 2 mL המסומנות מראש.העמסו את הדגימות ואת עמודי הספין לטיהור DNA לתוך רובוט לעיבוד עמודי ספין, וכן את הבאפרים המתאימים הנלווים. בהתאם להוראות היצרן, הרובוט לעיבוד עמודי הספין יקשור את ה-DNA המסומן לממברנת הסיליקה באמצעות 250 µL של באפר לקישור DNA עם ריכוז מלח גבוה לכל מבחנה, ולאחר מכן יוסרו הזיהומים מהממברנות באמצעות שתי שטיפות של 500 µL של באפר שטיפה בכל פעם. לאחר מכן, הרובוט יוסיף 15 µL של באפר תמיסה עם ריכוז מלח נמוך לממברנות כדי לשחזר את דגימות ה-DNA המסומן המטוהרות בנפחים של כ-12 µL לצורך היברידיזציה של הדגימות.בשלב הבא, חממו מראש תנור היברידיזציה ל-65 °C וחממו מראש את זכוכיות התמיכה ואת תאי ההיברידיזציה. להכנת תערובת ההיברידיזציה, ערבבו 1.1 µL של cot 1D NA, 4.95 µL של תערובת החסימה המסופקת על ידי היצרן, ו-24.75 µL של באפר היברידיזציה. השתמשו ברובוט לטיפול בנוזלים כדי לחלק תערובת זו לכל באר בלוח 96 בארות חדש, תוך הרטבה מראש של כל טיפ כדי לשפר את דיוק ההעברה.בשלב הבא, פלפט 9.35 µL של ה-DNA המסומן ב-three המתאים, ולאחר מכן 9.35 µL של ה-DNA המסומן ב-five המתאים. לאחר מכן, אטמו את הפלטה בכל באר, חממו את הדגימות למשך דקה אחת, וסובבו את הפלטה במהירות (spin) כדי לרכז את התכולה בתחתית כל באר. דנטורו את ה-DNA המסומן באינקובטור להכנה לקדם-הכלאה (pre hybridization).ראשית למשך שלוש דקות ב-95 °C, ולאחר מכן למשך 30 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, עבודה על משטח חימום בטמפרטורה של 42 °C. יש להניח את זכוכית התמיכה לתוך תא ההיברידיזציה, תוך וידוא שהחלק השקוף של האטם מיושר עם החלק החלוני של תא ההיברידיזציה, תוך שימוש בטיפים שהורטבו מראש.כעת, טפטפו באיטיות 42 µL מתערובת ההכלאה (hybridization mix) למרכז המיקום המתאים על שקופית התמיכה של המערך. הקפידו שהנוזל לא ייגע בגבול טבעת הגומי. לאחר מילוי כל המיקומים, הורידו בזהירות את שקופית המערך על שקופית התמיכה והרכיבו את תא ההכלאה.יש לוודא כי הצד של המערך שעליו מופיע הכיתוב פונה לעבר זכוכית התמיכה, לאחר מכן יש להדק את בורג תא ההיברידיזציה באופן מלא ולבדוק את תא ההיברידיזציה המורכב, כדי לוודא שאין דליפה של תמיסת ההיברידיזציה אל מחוץ לגבולות טבעת הגומי וכי כל בועית אוויר היא בגובה של כ-4 mm. כדי לבדוק זאת, יש להניח את תא ההיברידיזציה במצב אנכי על קצהו ולסובב אותו.כל בועות האוויר בכל מיקום נעות. אם חלק מהבועות תקועות, הקישו בחוזקה על התא נגד ספסון המעבדה. לאחר מכן, הכניסו את תאי ההיברידיזציה לתנור מסתובב בטמפרטורה של 65 °C למשך 24 שעות.ביום למחרת, טבול את תאי ההיברידיזציה בבופר שטיפה 1, והשתמש בזוג פינצטות פלסטיק בעלות קצה שטוח כדי להפריד בין השקופיות. לאחר מכן, השלך את שקופיות האטם והנח את שקופיות המערך (array) במעמד הטבול בבופר 1 טרי. שטוף את שקופיות המערך בערך 700 מיליליטר של בופר שטיפה למשך דקה עד חמש דקות, תוך ערבוב נמרץ באמצעות מגנט המגליד (flea) ומערבל מגנטי.לאחר מכן, העבירו את שקופיות המערך לכ-700 מיליליטר של בופר שטיפה, פעמיים למשך 90 שניות, עם ערבוב נמרץ יותר בסוף השטיפה השנייה. הרימו בעדינות את שקופיות המערך מהבופר. הן אמורות לצאת יבשות.לאחר מכן, טענו את שקופיות המערך לתוך מחזיקי השקופיות בסורק יחד עם מגני השקופיות, וסרקו את הדגימות. בהתאם להוראות יצרן המערך, כל גשש (probe) במערך שעבר היברידיזציה מוצג כתערובת של פלואורוכרומים אדומים וירוקים. יחסי האות הפלואורסצנטי האדום לירוק עבור כל גשש נמדדים כמותית על ידי הסורק והתוכנה הנלווית, הממפה אותם כיחסי log two בהתאם למיקומם הגנומי.עקבות המערך המתקבלים מאפשרים פענוח של אזורים שזוהו כלא מאוזנים גנומית. לדוגמה, בעקבה זו מילד עם תסמונת ויליאמס, תסמונת מיקרו-מחיקה חוזרת המתווכת על ידי חזרות בעותקים נמוכים באזור הפרוקסימלי של כרומוזום 7, אי-האיזון הגנומי זוהה על ידי התוכנה באמצעות קו אדום. יחס הלוג של הפלואורסצנציה אמור להתרכז סביב אפס, מה שמעיד על יחס של אחד לאחד בין צבע ירוק לאדום עבור אזורים תקינים בגנום.עקבות מערך מפוזרים כפי שנצפו בסריקה זו, עלולים להוביל לזיהוי שגוי של אזורים חריגים, או לכשל בזיהוי חוסר איזון גנומי, ועשויים להיגרם ממספר גורמים, כולל איכות DNA נמוכה, או נוכחות של קרניים ורמות של אוזון באטמוספירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן עיבוד דגימות חולים לבדיקה באמצעות aCGH ולהפקת נתונים באיכות גבוהה לצורך ניתוחים המשכיים וזיהוי וריאציות במספר העותקים.

array-comparative-genomic-hybridization-array-cgh-for-detection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה הוא הפגנה טכני של פרוטוקול הכלאה עבור כל ריצוף הגנום נתיב מערך CGH, שסורקת את הגנום האנושי כולו רק באמצעות 25-100 ng של DNA כי ניתן לבודד מתוך מגוון של מקורות, כולל חומר ארכיוני קבוע פורמלין.

הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי

מאמר זה מתאר את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בסביבה קלינית.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

להלן, אנו מתארים הליך לניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול. ההליך רלוונטי למחקרים החוקרים קשרים בין דפוסי מתילציה של גנים וגורמים התורמים מסרטן בסרטן מערכת העיכול.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ISO15189 אוטומטית ומוסמכת של הדור הבא לאיתור שינויים גנומיים ממוקדים ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין של סרטן תאים לא קטנים (NSCLC).

זיהוי שינויים ממוקדים בסרטן ריאות של תאים לא קטנים באמצעות ריצוף מהדור הבא

למדו להשתמש בטכניקת aCGH לאיתור שוניי מספר עותקים בגנום האנושי. שיטה זו מאפשרת אבחון מדויק של תסמונות גנטיות ומחלות תורשתיות מורכבות.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

גלה סרטונים נוספים