הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי
5 באוגוסט 2008
סרט הווידאו הזה הוא הפגנה טכני של פרוטוקול הכלאה עבור כל ריצוף הגנום נתיב מערך CGH, שסורקת את הגנום האנושי כולו רק באמצעות 25-100 ng של DNA כי ניתן לבודד מתוך מגוון של מקורות, כולל חומר ארכיוני קבוע פורמלין.
המצגת הקצרה הבאה היא סרטון המציג את פרוטוקול ההיברידיזציה עבור מערך ה-27 K תת-מגה-בסיס. מערך או מערך חכם זה מורכב מ-26,946 שיבוטים אחוריים ברצף נפרד המודפסים על שקופית אחת. הם מזוהים בשכפול בסך הכל 54,000 אלמנטים לשקופית המודפסים בשטח של 18 על 54 מילימטר.
הנתונים המתקבלים דומים למערכי אוליגו בצפיפות גבוהה מבלי לדרוש פרשנות נתונים על ידי ביואינפורמטיקה. יתרון מרכזי אחד של שימוש במערך הכנסה גדול כגון שיבוטים אחוריים הוא שהוא מאפשר שימוש ב-100 ננוגרם בלבד של DNA דגימה ללא הגברה. זה מאפשר ניתוח של מגוון דגימות כגון DNA מרקמות קפואות בדם, תאים ממויינים וחומר FFPE.
המערך החכם הוכח כשימושי בסביבה הקלינית. בסוכנות הסרטן של קולומביה הבריטית, ניתוח דגימות מרובות של מטופלים מותאם בקלות לשבוע העבודה הממוצע. לציטוגנטיקה.
רוב השלבים המשמשים במערך CGH דומים ל-CGH או דגים קונבנציונליים. מאפשר הכנסה מהירה של הפרוטוקול למעבדות מבוססות. איכות ה-DNA היא ההשפעה הגדולה ביותר על התוצאות במערך.
הכלאה של CGH, איכות ירודה או DNA מזוהם ישפיעו לרעה על שילוב PSI במוצר וכתוצאה מכך תמונות עמומות או רעש בנתונים. הספקטרופוטומטר NanoDrop הוא כלי מצוין להערכת איכות ה-DNA לפני הכלאה. כדי לכמת את ערכת ה-DNA, ה-NanoDrop למדידת חומצת גרעין והמצב למדידת DNA 50 ריק, ה-NanoDrop עם 1.5 מיקרוליטר מאותה תמיסה כמו הדגימה המושהית שלך.
במקרה זה, מדובר במים טריס. הוכח כי ל-EDTA יש השפעות שליליות פוטנציאליות על שילוב PS D. הסר את המגבון הריק עם מגבון קים והוסף 1.5 מיקרוליטר ממדד הדגימה שלך ורשום את ריכוז הדגימה שלך.
קריאת שני 60 על 2 80 ב-NanoDrop היא אינדיקטור טוב לאיכות ה-DNA כאשר יחס של 1.8 הוא אופטימלי. שיטת היחס הכפול שתיים 60 על שתיים 80 ושתיים 60 על שתיים 30 מספקת דרך טובה עוד יותר לקבוע את טוהר הדגימות שלך. ה-NanoDrop מציג עקומה המייצגת את הספיגה ביחס לאורך הגל.
עקומה חלקה ללא פסגות מעידה על ניגוב DNA באיכות טובה וניקוי ה-NanoDrop במים ומגבון קים, או אם הדגימה מגבילה, פיפטה את הדגימה מהכן. פרוטוקול זה מותאם עבור בין 100 ל-400 ננוגרם של דגימה. 200 ננוגרם היא כמות היעד ל-DNA באיכות טובה כדי לתייג את הדגימה נדרשים הריאגנטים והציוד הבאים.
מאגר SCI שלושה SCI חמישה ERs אקראיים 10 פעמים DNTP תערובת התייחסות DNA מים סטריליים 0.2 מיקרוליטר צינורות PCR סטריליים בלוק חום קרח באינקובטור של 100 מעלות צלזיוס ב-45 מעלות צלזיוס. הגדר צינור תגובה אחד ל-DNA ייחוס וצינור תגובה אחד. עבור דגימת DNA, הם יסומנו עם מדע בדיוני ו-SCI 3 בהתאמה.
במסגרת מחקרית, אנו מעדיפים להשתמש ב-CY 3 עבור ה-DNA הדגימה שלנו מכיוון שהוא עמיד יותר בפני פירוק האוזון. שלב את מאגר המים והתעלה של ה-DNA שלך לדגימה וחזור על ה-DNA הייחוס. במעבדה שלנו, אנו משלבים את המאגר פי 10 עם האופטימוס האקראי.
ליצירת פיתרון של חמש פעמים, הוסף מים סטריליים לנפח כולל של 17 מיקרוליטר. מעבירים את הצינורות לגוש חום, מנטרלים במשך חמש דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס. מעבירים מיד לקרח.
הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תערובת DNTP פי 10. יש להוסיף את העיניים הצדדיות. הוסף שני מיקרוליטרים של SCI שלושה עם תווית DCTP לדגימת DNA.
הוסף שני מיקרוליטרים של scifi המסומן DCTP להתייחסות DNA. מוסיפים 2.5 מיקרוליטר תעלה ומערבבים. הפתרון יכול להיות מעורבב ביד או מערבולת.
סובב בקצרה את התמיסה לתחתית הצינור עם דופק מהיר בצנטריפוגה ספסל. מעבירים לתנור ודוגרים בחום של 37 מעלות למשך הלילה. ניתן לכוונן את זמן ההכלאה בן לילה בין 14 ל-24 שעות מבלי להשפיע לרעה על תהליך התיוג.
כדי להתאים לוח זמנים למעבדה באמצעות עמודת MicroCon YM 30 הוסף 100 מיקרוליטר 1D NA שנתפסו לעמודה. היזהר לא לגעת בקרום עם קצה פיפטה שנתפס. ידוע כי שונות אצווה לאצווה מתרחשת גם כאשר היא נרכשת ממפיצים גדולים.
מומלץ לרכוש ולבדוק קבוצות גדולות לפני השימוש. כעת יהיו שני צינורות לכל הכלאה של דגימה, אחד בצבע כחול ואחד בצבע אדום. שלב את הצינורות לכל דגימה וערבב על ידי פיפטינג.
לאחר מכן העבר את כל התמיסה לממברנת ה-MicroCon. הנח את העמודה בצינור ה-MicroCon המצורף וסובב ב-13,000 גרם למשך 10 דקות. עמודת ה-MicroCon היא עמודת אי הכללת גודל ותלכוד את ה-DNA עם צבעי הצד המשולבים ותאפשר לצבעים הלא משולבים לשטוף דרך הממברנה.
כדי לשטוף כל שאריות נוקלאוטידים או צד לא משולבים, הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים לממברנה. סובב שוב ב -13, 000 גרם למשך 10 דקות. השליכו את הצינור והוסיפו 45 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה לחלק העליון של עמודת הרכז של MicroCon.
פתרון ההכלאה בו אנו משתמשים הוא Dig Easy מבית Roche Scientific ניתן להוסיף לתמיסה גם חמישה מיקרוליטרים של זרע הרינג משותף. באופן מסורתי, זה שימש לחסימת כריכה לא תחרותית למשטח ההחלקה. הופעתם של חומרי קשירה חדשים אפשרה את ביטול שלב זה.
עם זאת, לפעמים הוא מתווסף כדי להגביר את הצמיגות של פתרון ההכלאה. הפוך את עמודת ה-MicroCon והנח בשפופרת חדשה עם תווית. סובב את הצינור בחום של 3000 גרם למשך שלוש דקות.
התמיסה תצטבר בתחתית הצינור החדש. 1.5 מיקרוליטר מהתמיסה ישמשו לכימות התאגדות SD. הגדר את NanoDrop לניתוח מיקרו-מערך, ריק.
ה-NanoDrop עם 1.5 מיקרוליטר חפירה. מאגר הכלאה קל. מדוד את הריק עם ה-NanoDrop.
הקריאה צריכה להיות אפס. הסר את המגבון הריק עם מגבון קים והוסף 1.5 מיקרוליטר ממידת הדגימה שלך ורשום את שילוב הדגימה שלך. ה-NanoDrop ייתן לך שומה PICA לריכוז מיקרוליטר של דגימות שילוב צבעי S3 ומדע בדיוני עם שילובים למטה.
יש להתייחס לשלושה אולות למיקרוליטר כבעלי מעט מדי ארבע פלואור כדי להמשיך, ה-NanoDrop יציג גרף של הספיגה לעומת אורך הגל. שתי פסגות צריכות להיות גלויות, אחת לכל אחת מהעיניים הצדדיות לנגב ולנקות את ה-NanoDrop במים ומגבון קים. הנח את הכיסוי להחליק על מחמם שקופיות או בלוק חום לחמם מראש ל-45 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת הכלאה.
הנח 42 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה על החלקת הכיסוי בגודל 22 מילימטר על 60 מילימטר. וודאו כי אין בועות אוויר בתמיסה. טריק מהיר להסרת בועה עיקשת הוא לקחת החלקת כיסוי טרייה ולפוצץ את הבועה בפינה חדה.
יישר את השקופית מעל החלקת הכיסוי ותמיסת הבדיקה. הורד קצה אחד של המגלשה, המאפשר מגע עם פתרון ההכלאה. המשך להוריד קצה אחד עד שהחלקת הכיסוי מתחברת למגלשה עם מתח פנים.
הפוך את השקופית. הנח את המגלשה לתוך קלטת הכלאה, חמם מראש ל-45 מעלות צלזיוס והוסף 10 מיקרוליטר מים בחריץ התחתון כדי לשלוט בלחות. יש לתרגל שלב זה כאשר החפירה קלה מתגבשת בטמפרטורות נמוכות יותר ותשאיר רקע על המגלשה.
זה חשוב במיוחד כאשר התמיסה נמצאת על המגלשה מכיוון שמדובר בשכבה דקה מאוד של נוזל. בשלב זה, אטמו את הקסטה ודגרו למשך 36 עד 40 שעות בחום של 45 מעלות צלזיוס. הסרת השקופית מקלטת ההכלאה היא קריטית.
חופרים, קל מתגבש בטמפרטורת החדר. יש לטבול את השקופית מיד ולהסיר את החלקת הכיסוי בתמיסת הכביסה. כל תמיסות השטיפה צריכות להיות מוכנות מראש ובעלות pH של שבעה pH לא ניטרלי עלול לפגוע בעיניים הצדדיות.
מחממים את תמיסת הכביסה ל 45 מעלות צלזיוס. הוסף כ-60 מיליליטר מתמיסת הכביסה לצנצנת קופלנד לפני פתיחת תא ההכלאה. פתח את החדר.
הסר את השקופית בעזרת פינצטה והוסף את השקופית לתמיסת הכביסה. כשפתק הכיסוי עדיין מחובר, המתן 10 עד 20 שניות ואחזר את פתק הכיסוי בעזרת פינצטה. זה היה צריך ליפול מהמגלשה.
זהו שלב חשוב מכיוון שהוא אוסר על המאגר הקל לחפירה להתגבש וכן מפחית כל שריטות פוטנציאליות של המגלשה על ידי הסרה מכנית של החלקת הכיסוי. שטפו את השקופית שלוש פעמים בתמיסת כביסה. דקה אחת כל אחד עם התרגשות.
שטפו את השקופית שלוש פעמים. לא אמורות להיות שאריות בועות מה-SDS בתמיסת הכביסה הנראות לאחר הכביסה האחרונה. השאירו את השקופית בתמיסת הכביסה עד שהיא מוכנה לצנטריפוגה.
צנטריפוגה בצינור פלקון של 50 מיליליטר ב-700 גרם למשך דקה. ודא ששפופרת הבז יבשה לפני השימוש. סרוק מיד את השקופית מכיוון שעוצמות האות יפחתו עם הזמן.
בהתאם לרמות האוזון בסביבה, כל סורק שונה, אך יש כמה הנחיות נפוצות שיש לעקוב אחריהן. להדמיית שקופיות. רמות האוזון הסביבתי הן קריטיות במהלך תהליך הסריקה.
קוביית מדע בדיוני רגישה לאוזון ותתכלה במהירות במהלך זמן סריקה ארוך. הוכח שחמישה חלקים למיליארד אוזון משפיעים על S חמש. זה שווה ערך לזיהום תנועה קלה ביום בהיר.
מדי אוזון מומלצים לתעד את רמות האוזון בסביבה. נוצרת תמונה נפרדת לכל ערוץ S3 ו- SCI 5. ניתן לאזן את הערוצים על ידי שינוי רגישות החשיפה, הזמן, העירור, הקלט או הלכידה של הסורק.
תמונות אלה מוכנות כעת לניתוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
הסרטון הזה מדגים את פרוטוקול ההכלאה למערך מסלול חיפוי שלם של הגנום האנושי CGH, המאפשר סריקה של כל הגנום האנושי עם קלט DNA מינימלי. השיטה מאפשרת ניתוח של סוגי דגימות שונות, כולל חומרים ארכיוניים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- גנומיקה
- ניתוח DNA
- טכניקות הכלאה
רקע
- המערך מורכב מ-26,946 שיבוטים אחוריים שנרצפו באופן אינדיבידואלי.
- כל שקופית מכילה בסך הכל 54,000 אלמנטים.
- הנתונים המתקבלים דומים למערכי אוליגו בצפיפות גבוהה.
- אין צורך בפרשנות ביו-אינפורמטית לניתוח הנתונים.
מטרת המחקר
- להדגים פרוטוקול הכלאה לסריקת גנום.
- להשתמש בדגימות DNA מינימליות לניתוח גנומי מקיף.
- לאפשר שימוש בסוגי דגימות מגוונות במחקרים גנומיים.
שיטות ששימשו
- פרוטוקול הכלאה למערך מסלול חיפוי שלם של הגנום האנושי CGH.
- שימוש ב-25-100 נג של DNA ממקורות שונים.
- יישום שיבוטים אחוריים המודפסים בכפילות על השקופיות.
- ניתוח דגימות ללא הגברה.
תוצאות עיקריות
- סריקה מוצלחת של הגנום האנושי עם קלט DNA נמוך.
- יכולת לנתח DNA מדם, רקמות קפואות, וחומר FFPE.
- איכות נתונים דומה למערכים בצפיפות גבוהה יותר.
- ניתוח מקל על דרישות ביו-אינפורמטיקה נרחבות.
מסקנות
- פרוטוקול ההכלאה יעיל לניתוח גנומי רחב היקף.
- דרישות DNA מינימליות מרחיבות את היקף סוגי הדגימות.
- שיטה זו משפרת את הנגישות למחקר גנומי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
