Name: הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-05T18:06:00.000+00:00
Duration: 16 min 37 s
Description: למד פרוטוקול הכלאה למערך CGH של מסלול ריצוף גנום שלם. השיטה מאפשרת סריקת הגנום האנושי עם כמות מינימלית של DNA ללא הגברה, ותומכת בניתוח דגימות ממקורות שונים כולל דם, רקמות קפואות וחומר FFPE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מבקשים להודות לחברי הצוות לאם וואן BAC מעבדה מערך במיוחד Miwa סוזוקי בריאן צ&#39;י להכנת מאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לבריאות מחקר הגנום קנדה / הגנום קולומביה הבריטית, ו-NIH / NIDCR מענק RO1 DE15965-01.

בדיקה סימון הערה: להגביל את החשיפה של צבעים Cye לאור בכל הזמנים (זו יכולה להיות מושגת על ידי עבודה באזור חשוך או על ידי מיגון צינורות עם כיסוי כמו רדיד אלומיניום) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב: (Setup 1 שפופרת תגובה עבור התייחסות 1 שפופרת התגובה למדגם) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA (25-400 נ&quot;ג) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μL של חיץ primers 5X אקראית (ריכוז סופי: 5X Promega Klenow חוצץ ו 7 מיקרוגרם / octamers אקראי μL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נפח 17.0 הכולל μL מזוקקים עם H 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים במשך 10 דקות ב 100 ° C. העברה מיידית קרח למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μL תמהיל dNTP 10X (2mm dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1.2 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CyeDyes: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μL 2 (2 nmoles) של dCTP סיי-3 שכותרתו ל-DNA Sample </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μL 2 (2 nmoles) של סיי-5 dCTP שכותרתו הפניה DNA (למשל, ה-DNA הגנומי Novagen אדם) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μL של Klenow (9 U / μL, Promega) ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה * (~ 18 שעות). * הפעם הכלאה בין לילה יכול להיות מותאם בין 14 ל -24 שעות מבלי להשפיע לרעה על תהליך תיוג כדי להתאים ללוח הזמנים מעבדה. </li></ol> דוגמא CLEAN UP (בשילוב בדיקה לנקות והכנה הכלאה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש YM-30 Microcon עמודה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 Cot-1 μL DNA (1μg/μL) לעמודה. אל תיגע קרום עם טפטפת בקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התגובות (התייחסות לדוגמה) ולהוסיף עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עמודה צינור סיפק ספין ב g 13,000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 H מזוקקים μL 2 0 עד קרום וחזור ספין לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל צינור ולהוסיף 45 פתרון הכלאה μL: (רוש DIG קל) </li></ul> אופציונלי: להוסיף זרע 5μL טעון DNA הרינג (יחידת 10μg/μL, Promega) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך Microcon, מקום צינור שכותרתו חדשים, ספין על 3000 גרם במשך 3 דקות. </li></ul></li></ol> חישוב INCORPORATIONS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1.5 μL ו Fluorophore למדוד ההתאגדות באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. באמצעות המאגר הכלאה שלך ריק (DIG קל) בצע את ההוראות על המסך. (ניתן לשחזר את הדוגמה הכן, במידת הצורך, לאחר מדידה). (הערה:. Incorporations מתחת 3.0 pmol / μL בערוץ גם הראו התוצאות משתנה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל על ​​85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בדיקה ב 45 ° C במשך שעה 30 דקות עד 1 (מאפשר Cot-1-DNA חישול). </li></ol> ARRAY הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 44 מקום פתרון μL בדיקה על coverslip (22 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ) (פישר סיינטיפיק). אם זמין, המקום coverslip בשקופית חם או לחסום חום טרום חימם עד 45 ° C כדי לשמור על הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר להחליק על coverslip פתרון בדיקה, נמוך קצה אחד של שקופיות המאפשר מגע עם הפתרון הכלאה. המשך נמוך עד coverslip מצורף לשקופית עם מתח הפנים. היפוך שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית לתוך קלטת הכלאה (Telechem), טרום חימם עד 45 ° C, ולהוסיף 10 μL מים החריץ התחתון (כדי לשלוט לחות במהלך הכלאה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם קלטת ו דגירה של 36-40 שעות ב 45 ° C. </li></ol> ARRAY כביסה הערה: כל פתרונות לשטוף הם ב-pH 7.0 הסרה של השקופית מתוך הקלטת ההכלאה היא קריטית. DIG קל במהירות מתגבש בטמפרטורת החדר. שקופית צריך להיות שקוע מיד את הפתק מכסה הסיר בפתרון לשטוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כ 60 מ&quot;ל של 0.1XSSC, 0.1% SDS (pH 7.0, 45 ° C) לשטוף פתרון בצנצנת Coplin לפני פתיחת תא הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא פתוח, להוסיף שקופית לשטוף ולהסיר פתרון coverslip (הוא אמור להחליק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית 3 פעמים 0.1XSSC + SDS 0.1% ב 45 ° C למשך דקה 1 כל אחד עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופית 3 פעמים 0.1XSSC טריים *. לא צריך להיות שום בועות שיורית מן לשטוף את SDS גלוי. * שקופיות יכול להישאר הפתרון הסופי עד לשטוף מוכן צנטריפוגות ולסרוק (~ 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את השקופית 50 צינורות מ&quot;ל פלקון 700 גרם ב 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לסרוק את השקופיות (עוצמות אות תפחת לאורך זמן.) </li></ol>

<ol><li>Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+array+comparative+genomic+hybridization+technologies+and+their+applications+in+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics.</a> European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).</li>
<li>Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiling+resolution+DNA+microarray+with+complete+coverage+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome.</a> Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).</li>
<li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high+throughput+validation+of+amplified+fragment+pools+of+BAC+DNA+for+constructing+high+resolution+CGH+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays.</a> BMC Genomics. 5, 6(2004).</li>
<li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetically+balanced+translocations+are+associated+with+focal+copy+number+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations.</a> Human Genetics. 120, 795-805 (2007).</li>
<li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeGH+--+a+software+tool+for+visualization+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data.</a> BMC Bioinformatics. 5, 13(2004).</li>
<li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MD-SeeGH%3A+a+platform+for+integrative+analysis+of+multi-dimensional+genomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data.</a> BMC Bioinformatics. 9, 243(2008).</li>
<li>Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+resolution+of+array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Resolving the resolution of array CGH.</a> Genomics. 89, 647-653 (2007).</li>
<li>Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+increases+heterogeneity+tolerance+in+the+analysis+of+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples.</a> Genomics. 85, 790-793 (2005).</li>
</ol>

DNA באיכות ירודה לא תספק פרופיל הכלאה טובה. זה חיוני כדי להבטיח כי המדגם ו-DNA הפניה ללא מזהמים כגון פנול, RNA, מלח, וכו &#39;שעשויים להפריע צעד תיוג אקראי הממשלה לפני תחילת ניסוי הכלאה. לדוגמה resuspension של דנ&quot;א טריס - EDTA (TE) במקום מים אינה מומלצת כמו ריכוז מלח גבוה יכולים לעכב את התגובה תיוג. אנו ממליצים assaying איכות דנ&quot;א באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop למדוד גם את כמות ה-DNA, כמו גם הצורה הכללית של עקומת ספיגת לבין 260/280, 260/230 יחס. <p style=";text-align:right;direction:rtl"...

<table><tbody><tr><td>בופר Klenow 5X</td><td>ריאגנט</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוקטמרים אקראיים (Random Octamers)</td><td>ריאגנט</td><td>Alpha DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תערובת dNTP 10X</td><td>ריאגנט</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td>2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP</td></tr><tr><td>dCTP מסומן ב-Cy-3</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dCTP מסומן ב-Cy-5</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דנ"א גנומי אנושי כרפרנס</td><td>ריאגנט</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td>דוגמה לרפרנס אפשרי</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>ריאגנט</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודת YM-30</td><td>ריאגנט</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIG Easy</td><td>ריאגנט</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דנ"א גזור מזרע הרינג</td><td>ריאגנט</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית (Coverslip)</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>22mm x 60mm</td></tr><tr><td>קסטת היברידיזציה</td><td>כלי</td><td>Telechem</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

גנומית השוואתי מערך ההכלאה (מערך CGH) היא שיטה לגילוי הרווחים וההפסדים של מגזרים דנ&quot;א או מינון גנים הגנום 1. ההתקדמות בטכנולוגיה זו אפשרו השוואה ברזולוציה גבוהה של הגנום כולו לזיהוי שינויים גנטיים בסרטן ומחלות גנטיות אחרות 2. תת Megabase ריצוף שנקבע בהחלטה מערך (או SMRT) מערך מורכב של קבוצה של כ 30,000 חופפים כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שיבוטים כי ההיקף הגנום האנושי בזוג ~ kilobase 100 (KB) 2 קטעים. מטרות אלה BAC מסונתזים בנפרד הבחין בשני עותקים על זכוכית שקופית אחת 2-4. Array CGH מבוססת על העיקרון של הכלאה תחרותי. לדוגמה ו-DNA התייחסות מסומנים באופן דיפרנציאלי עם Cyanine-3 ואת צובעת Cyanine-5 ניאון, ושיתוף הכלאה למערך. לאחר תקופת דגירה הדגימות מאוגד נשטפים משקופית ואת מערך היא הדמיה. חבילת זמין בחינם תוכנות מותאמות אישית בשם SeeGH (www.flintbox.ca) משמש כדי תהליך נפח גדול של נתונים שנאספו - ניסוי אחד מייצר 53,892 נקודות נתונים. SeeGH מדמיין את האות log2 עוצמת היחס בין 2 דגימות בכל מטרה BAC אשר מיושרים אנכית עם עמדת כרומוזומליות 5,6. מערך SMRT יכול לזהות שינויים קטנים כמו 50 KB בגודל 7. מערך SMRT יכול לזהות מגוון של סידור אירועים DNA לרבות רווחים DNA, הפסדים ומחיקות amplifications הומוזיגוטים. יתרון ייחודי של המערך SMRT היא שאף אחד יכול להשתמש DNA שבודד פורמלין דגימות פרפין קבוע מוטבע. בשילוב עם דרישות קלט נמוך של ה-DNA unamplified (25 100ng) זה מאפשר אפיון של דגימות יקרות כמו אלה המיוצרים על ידי microdissection 7,8. זו מיוחסת גודלו של כל יעד הכלאה BAC המאפשר קשירה של דגימות שכותרתו מספיק כדי לייצר אותות לצורך זיהוי. יתרון נוסף של הפלטפורמה הזו היא סובלנות ההטרוגניות של רקמות, הקטנת הצורך microdissection רקמות משעמם 8. זה פרוטוקול וידאו הדרכה צעד אחר צעד מהתווית DNA קלט דרך לאותת הרכישה עבור מערך שלם ריצוף הגנום נתיב SMRT.

סרט הווידאו הזה הוא הפגנה טכני של פרוטוקול הכלאה עבור כל ריצוף הגנום נתיב מערך CGH, שסורקת את הגנום האנושי כולו רק באמצעות 25-100 ng של DNA כי ניתן לבודד מתוך מגוון של מקורות, כולל חומר ארכיוני קבוע פורמלין.

הכלה גנומית השוואתית על גבי מערך (array CGH) היא שיטה לגילוי תוספות ואובדנים של מקטעי DNA או מינון גנים בגנום 1. לאחרונה...

*ניתן להשאיר את השקופיות ב-

technical-demonstration-whole-genome-array-comparative-genomic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microarrays ג'ין הם כלים רבי עוצמה באפיון ביטוי גנים ברמת הגנום כולו. טכנולוגיה זו יישומים במגוון רחב של תחומים לרבות ביולוגי ביולוגיה התפתחותית הרעלים. בסרטון הזה, אנחנו פרט פרוטוקול ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות פלטפורמה מקיפה microarray oligonucleotide על דג הזברה.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

אנו מדגימים את השימוש microarrays DNA עבור פרופיל הביטוי של מערכת העצבים. אנו מתארים לשלוט RNA איכות, תיוג המדגם, הכלאה מערך סריקה.

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

מערך CGH לצורך זיהוי של גרסאות עותק מספר הגנומי החליף ניתוח קריוטיפ התאגדו-G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה והיישום שלה במעבדת שירות לאבחון.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

מאמר זה מתאר את היישום של metabolomics לא ממוקד, transcriptomics ניתוח סטטיסטי רב משתני תמלילי ברי ענבים מטבוליטים כדי לקבל תובנה לגבי מושג טרואר, כלומר, השפעת הסביבה על תכונות איכות ברה.

קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics

פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

במאמר זה, אנו מציגים ולדון התפתחויות חדשות סינתזה ויישומים של חומצות גרעין מיקרומערכים מפוברק באתרו. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד הפרוטוקולים לסינתזה DNA ניתן להרחיב RNA וכיצד מיקרו מערכים ניתן להשתמש כדי ליצור לאחזור ספריות גרעין של חומצה.

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

למד פרוטוקול הכלאה למערך CGH של מסלול ריצוף גנום שלם. השיטה מאפשרת סריקת הגנום האנושי עם כמות מינימלית של DNA ללא הגברה, ותומכת בניתוח דגימות ממקורות שונים כולל דם, רקמות קפואות וחומר FFPE.

הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי

גלה סרטונים נוספים