מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

המטרה הכוללת של פרוטוקול הכלאה גנומי השוואתי מבוסס מערך זה היא לזהות במהירות וריאציות של מספר עותקים במוטציות הנגרמות על ידי הפצצת נויטרונים מהירה של צמח הקטניות Medicago truncatula. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הקטניות. כגון, הקלה על זיהוי אמפתוגנים באתר נמוך המעורבים בוויסות התפתחות גושים בקטניות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בעלת המוניטין הגבוה ביותר ורגישה באיתור וריאציות של מספר עותקים כגון מוטציות מחיקה במוטציות הפצצת הנויטרונים של צמח הקטניות Medicago truncatula. מי שמדגים את ההליך הזה יהיו אני, והונגצ'נג וואנג, רופא מארח עמיתים מהמעבדה הגנטית. הקפיאו במהירות גרם אחד של רקמת עלים צעירה שנאספה מצמחים בודדים בחנקן נוזלי.

לאחר מכן, השתמשו במכתש ועלי וטחנו את רקמת העלים הקפואה לאבקה דקה בתוך החנקן הנוזלי. חלץ את דגימות ה-DNA הגנומי הפראי והמוטנטי מהאבקה העדינה באמצעות ערכת בידוד DNA. השתמש בצינורות צנטריפוגות של 500 מיקרוליטר כדי לדלל מיקרוגרם אחד מכל סוג בר ו-DNA גנומי מוטנטי במים מזוקקים כפולים לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של פריימר אקראי לצינורות הצנטריפוגה. מערבל במהירות את הצינורות, ולאחר סיבוב מהיר למטה הנח אותם בתרמו-סייקלר למשך 10 דקות כדי לנטרל את דגימות ה-DNA ב-98 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות הסר את הצינורות מהתרמאופקלר והניח אותם מיד על מי קרח למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הכינו שתי תערובות תיוג והוסיפו 25 מיקרוליטר של תערובת תיוג כאחד ושניים לצינורות ה-DNA מסוג הפראי והמוטנטי בהתאמה. פיפטה את הדנ"א והתווית מתערבבים שלוש פעמים, ואז מסובבים לזמן קצר את הצינורות. לאחר הסיבוב, דגרו את הצינורות בתרמו-סייקלר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן ב-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לנטרל את האנזים אקסו קלנוב.

לאחר מכן, הוסף 430 מיקרוליטר של One X TE Buffer, וערבב את התוכן בכל צינור. לאחר מכן, סובב בקצרה את הצינורות והעביר את התמיסה בצינורות לעמודי טיהור עם שני צינורות איסוף מיליליטר. צנטריפוגה את עמודי הטיהור ב 14, 000 פעמים G למשך 10 דקות והשליכו את הזרימה דרכם.

הוסף 480 מיקרוליטר של One X TE Buffer לכל עמודה, ושוב צנטריפוגה ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את הזרימה. העבירו כל אחד מה-DNA המסומן בסוג הבר והמוטציה מתחתית העמודה לצינורות צנטריפוגות חדשים.

לאחר מדידת הנפח של כל אחד מה-DNA המסומנים עם הפיפטה, התאם את הנפח הסופי ל-80 מיקרוליטר עם One X TE Buffer, ולאחר מכן מדוד את ריכוז ה-DNA המסומן בספקטרופוטומטר. לאחר מכן, ערבבו כמויות שוות ערך של DNA מוטנטי ובר כדי להכליא בדיקות על שבב מיקרו מערך להכלאה השוואתית. הביאו את הנפח הסופי ל-160 מיקרוליטר עם One X TE Buffer.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת ההכלאה ופיפטה אותה שלוש פעמים כדי לערבב היטב שלושה סוכנים עם DNA מעורב. לאחר סיבוב קצר של הצינורות דגרו אותם בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ובטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. זכור להגדיר את הטמפרטורה ל 67 מעלות צלזיוס כדי לחמם מראש את תנור ההכלאה ארבע שעות לפני ההכלאה.

לאחר מכן, הנח שקופית אטם על בסיס תא ההכלאה והעמיס עליו 490 מיקרוליטר מתמיסת ההכלאה לאחר 20 דקות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ב-thermocycler. כדי ליצור את תא ההכלאה, כסו את שקופית האטם בשבב מיקרו מערך הגנום של Medicago truncatula, ולאחר מכן כסו את תא ההכלאה והדקו אותו היטב בעזרת המהדקים. דגרו את תא ההכלאה המורכב בתנור ההכלאה בחום של 67 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 48 שעות.

בינתיים, הכינו שני כלי כביסה עם 250 מיליליטר של מאגר כביסה אחד שנשמר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו שקופית אחת לשטיפת כלים עם מאגר כביסה שניים נשמרים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו צנצנת כביסה אחת עם 70 מיליליטר אצטוניטריל, וצנצנת כביסה נוספת עם 70 מיליליטר תמיסת ייצוב וציור.

הנח את שתי צנצנות הכביסה במכסה אדים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה הסר את תא ההכלאה מתנור ההכלאה ושחרר את מהדקי החדר לפתיחת המכסה. לאחר מכן, הסר את שבב מערך המיקרו בשקופית האטם והנח אותם על כלי כביסה עם Wash Buffer One.

בודד את שבב מערך המיקרו משקופית הכיסוי. לאחר מכן, העבירו את שבב מערך המיקרו לכלי הכביסה של השקופית השנייה עם Wash Buffer One. מערבבים בעדינות את התמיסה על צלחת ערבוב מגנטית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

הנח את שבב מערך המיקרו על כלי הכביסה עם מאגר כביסה שני שחומם מראש, ולאחר מכן ערבב עם מוט הערבוב כדי לשטוף את התמיסה ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הסר את שבב מערך המיקרו והנח אותו בצנצנת הכביסה המכילה אצטוניטריל במכסה אדים לשטיפה למשך 30 שניות. העבירו את שבב מערך המיקרו לצנצנת הכביסה עם תמיסת ייצוב וייבוש ושטפו שוב למשך 30 שניות.

הסר בזהירות את השבב וייבש במשך דקה אחת בתוך מכסה האדים. סרוק את שבב מערך המיקרו באמצעות סורק ברזולוציות של שתי מיקרומטר. תוכנת מיפוי אותות שימשה כממשק לניתוח ההתפלגות של שני יחסים מנורמלים של אותות מוטנטיים לעומת אותות פראיים על פני שמונה כרומוזומים.

עבור מחיקות משוערות, הערך של יחס לוג שניים שווה או קטן ממינוס שתי נקודות חמש, נלקחת בחשבון סטיית תקן. ניתוח פילוח של התוכנה מדגים אזור מחיקה משוער של 22 קילו-בסיס בכרומוזום 4 המוצג בגרף. ניתוח גבולות המחיקה המוקפים בבדיקות מערך המיקרו מראה יחס ממוצע מנורמל מופחת של לוג שניים.

הגרף מציג גם שישה גנים מבוארים אחרים כולל גן הבן המקיף את האזור שנמחק. גן הבן אחראי על בקרת קשריות ב-Metecago truncatula. לאחר מכן, הגברת PCR שנעשתה כדי לאשר את גבולות המחיקה מציגה תוצר של נקודה וחמישה קילו-בסיס מוגבר ממוטציה FN6191, אך לא בסוג הפראי.

ריצוף ה-DNA נעשה כדי להראות את צומת המחיקה במוטציה FN6191 המוצגת בחץ השחור. נעשה גם רצף שאישר את מיקום גבולות המחיקה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה, זכור לשמור על ריכוז אוזון נמוך בחדר בו מבצע את ההליך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כגון תגובות שרשרת פולימראז של כל ריצוף הגנום כדי לענות על שאלות נוספות כמו הגודל ומספר העותקים בגנום. אירוע ואימות של טכניקה זו סללו את הדרך לחוקרים לחקור את השונות במספר העותקים שהם גורמים למוטציות ואת הגרסאות הטבעיות במיני צמחים שאינם ניתנים למוטגנזה החדרתית כגון Garden P. אל תשכח שעבודה עם אצטוניטריל, ייצוב ותמיסת ייבוש עלולה להיות מסוכנת ביותר.

אמצעי זהירות, כגון לבישת מגן עיניים, הימנעות ממגע ישיר עם הסוכנים ועבודה זהירה הם חיוניים לחלוטין.