איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שינויים במספר עותקי DNA בקנה מידה מגה-בסיס בתאים בודדים. על מנת לסווג הטרוגניות גנומית באוכלוסיות תאים, יש צורך לזהות שינויים גנומיים ברזולוציה של תא בודד. באופן מסורתי, זה הושג באמצעות גישות ציטולוגיות, אולם שיטות אלה היו מוגבלות ברגישותן ובספציפיותן.

ריצוף של תא בודד יכול לזהות מגוון שינויים גנומיים, עם רגישות וספציפיות משופרות בהשוואה לגישות קודמות, אך רק כאשר הוא מבוצע בקפידה. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש ברצף תא בודד כדי לזהות באופן אמין שינויים במספר עותקים בקנה מידה מגה-בסיס בתאים בודדים. כדי להרכיב את המיקרו-אספירטור, התחל בהסרת קצה הפלסטיק השקוף ממכלול צינור השואב והכנס את הקצה הצר לקצה אחד של צינור PVC באורך מטר אחד בקוטר פנימי של 3/16 אינץ'.

הכנס את השקע של מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לקצה השני של צינור PVC באורך מטר אחד בקוטר פנימי של 3/16 אינץ'. לאחר מכן הכנס את הכניסה של מסנן המזרק 0.2 מיקרומטר לקצה אחד של צינור PVC באורך שישה אינץ' בקוטר פנימי של 5/16 אינץ'. שברו פיפטה סרולוגית מפלסטיק של חמישה מיליליטר בסיום מיליליטר אחד והכנסו את הקצה השבור לקצה הפתוח של צינור ה-PVC בקוטר הפנימי של 5/16 אינץ'.

לאחר מכן, הכנס את השקע של הפיפטה הסרולוגית הפלסטית בנפח חמישה מיליליטר לקצה הגמיש של מכלול צינור האספירטור, ולאחר מכן השתמש בצינור פלסטיק סטרילי כדי לכסות את הפיה האדומה של מכלול הצינור לאחסון. משוך צינור נימי זכוכית לקוטר פנימי של 10-30 מיקרומטר על ידי מיקום אמצע הצינור ליד להבה והפעלת מתח משני קצות הצינור. שוברים את הצינור הנמשך לשני חצאים כדי ליצור שתי מחטי שואב פוטנציאליות.

חזור על שלב זה עם מספר צינורות כדי להבטיח שמכינים מספיק מחטים בקוטר פנימי מתאים לבחירת תאים בודדים. להכין תאי הדבקה, כגון קווי תאי פיברובלסטים אנושיים, לקצור תאים על ידי טריפסיניזציה, ולהעביר את התאים לצינור חרוטי המכיל את המדיום המתאים. הגדר מכסה מנוע להגברת הגנום כולו על ידי שימוש ב-10% אקונומיקה כדי לרסס על פני מכסה המנוע, קופסאות קצה פיפטה וקצות פיפטה.

לאחר מכן השתמש במגבת נייר כדי לנגב את כולם לפני שתחזור על הכביסה עם 70% אתנול. הוסף שמונה מיקרוליטר מים מערכת הגברת הגנום השלם, או WGA, לבארות בודדות לצלחת PCR של 96 בארות. לאחר מכן מכסים את צלחת ה-PCR של 96 בארות במכסה מצלחת תרבית רקמות של 96 בארות, ומניחים את הצלחת על קרח.

לאחר מכן, הוסיפו 1,000 תאים ל-10 מיליליטר של מדיום או PBS בצלחת פטרי של 15 סנטימטר והניחו את המנה על קרח כדי למנוע מהתאים להיצמד למנה. לאחר מכן, בעודם על קרח, העבירו את התאים בצלחת פטרי ובצלחת ה-PCR בת 96 הבארות למיקרוסקופ אור עם מטרה של פי 10. הגדל את פתח מחט השואב על ידי הקשה עדינה על הקצה הנמשך של המחט על משטח קשיח כך שהקצה יתנתק.

לאחר מכן הכנס את הקצה הרחב של המחט לקצה השקוף של המיקרו-אספירטור. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי המכילה תאים על במת המיקרוסקופ. הכנס את הפיה האדומה של השואב לפה.

לאחר מכן, תוך כדי שימוש באחד היה צריך להזיז את מחט השואב, וביד השנייה כדי להזיז את צלחת הפטרי, לזהות תאים בודדים שיש לרצף. בעזרת יניקת פה, משוך תא בודד למחט השואב יחד עם כ-1-2 מיקרוליטר של מדיום או PBS. העבירו את התא לשמונת המיקרוליטרים של המים בבאר אחת של צלחת ה-PCR בת 96 הבארות.

האיכות והתועלת של נתוני ריצוף תאים בודדים תלויים במצבו של כל תא ובגנום שלו, לכן, יש להקפיד במהלך הכנת התא ומיקרו-שאיפה לבודד תאים ברי קיימא ולא אפופטוטיים. לאחר שאיבת כל תא והעברתו לבאר של צלחת ה- PCR, סמן את הבאר שקיבלה תא. חזור על פעולה זו עבור מספר התאים הרצוי.

בינתיים, הפשירו 10X מאגר פיצול ליזה של תא בודד מערכת הגברת הגנום השלם. כדי למנוע זיהום במהלך הגברת הגנום השלם, הוסף את כל הריאגנטים בתוך מכסה המנוע של תרבית רקמות. השתמש בקצות פיפטה עם מסננים, והחלף את קצה הפיפטה בין הבארות.

עבור כל קבוצה של עד 32 תאים, שלב 32 מיקרוליטר של 10X מאגר ליזה ופיצול של תא יחיד ושני מיקרוליטר של תמיסת Proteinase K בצינור מיקרוצנטריפוגה, ולאחר מכן מערבל את הצינור כדי לערבב את התוכן. מוסיפים מיקרוליטר אחד מהתמיסה לכל באר ופיפטה למעלה ולמטה לערבב. מכסים את הצלחת ומשתמשים בסרט פלסטיק כדי לאטום את כל הבארות.

ואז צנטריפוגה קצרה של הצלחת במיני ספינר צלחת. לאחר מכן, העבירו את הצלחת דרך התרמו-סייקלר באמצעות התוכנית הבאה. ואז מצננים את הצלחת על קרח, וצנטריפוגה קצרה.

כדי להכין פתרון מאגר הכנת ספרייה עובד מערכת הגברת הגנום השלם, עבור כל תא, שלב שני מיקרוליטר של מאגר הכנת ספריית תא יחיד 1X, ומיקרוליטר אחד של פתרון ייצוב ספרייה. ליזה תאית נאותה ופיצול גנום מלא הם קריטיים על מנת למזער הטיה במהלך הגברת הגנום השלם ולהבטיח הכנת ספריות ריצוף באיכות גבוהה. ככזה, הקפד לבצע את השלבים הללו בדיוק כפי שנכתב.

מוציאים את סרט הפלסטיק מהצלחת ומוסיפים שלושה מיקרוליטר מהתמיסה לכל באר. פיפטו את תכולת הבאר למעלה ולמטה לערבוב, ואז החליפו את סרט הפלסטיק. לאחר סיבוב קצר של הצלחת, דגרו את התאים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ואז קררו את הצלחת על קרח, וצנטריפוגה קצרה שוב את הצלחת.

כעת, הסר את סרט הפלסטיק, הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים הכנת ספרייה לכל באר, ופיפטה את תכולת הבאר למעלה ולמטה כדי לערבב, ואז החלף את סרט הפלסטיק. לאחר סיבוב קצר של הצלחת, הנח אותה בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית הבאה. לאחר קירור הצלחת ומתן סיבוב קצר, הכינו תערובת הגברה עובדת מערכת הגברת הגנום השלם על ידי שילוב של 48.5 מיקרוליטר מים, 7.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר הגברה פי 10 ו-5 מיקרוליטר של WGA DNA פולימראז, לכל תא.

שמור את תערובת העבודה על קרח. הסר את סרט הפלסטיק מהצלחת. הוסף 61 מיקרוליטר מתערובת ההגברה העובדת לכל באר, ופיפטה את תכולת כל באר למעלה ולמטה לערבוב, ולאחר מכן החלף את סרט הפלסטיק.

צנטריפוגה קצרה את הצלחת ואת המחזור התרמי כדלקמן. רצף הדגימות וביצוע ניתוח נתונים על פי פרוטוקול הטקסט. כפי שמודגם באיור זה, אם הגברת הגנום השלם תצליח, הדגימה תופיע כמריחה על ג'ל אגרוז.

מריחה קלושה או נעדרת מעידה על תגובת הגברה כושלת ואין לרצף את הדגימה. כפי שמוצג כאן, ניתוח גדלי השברים בוצע באמצעות אלקטרופורזה נימית על מנתח שברים. לספריות שהוכנו בהצלחה תהיה התפלגות אחידה למדי של גדלי שברים מ-150 עד 900 זוגות בסיסים.

הכנת ספרייה כושלת תגרום להתפלגות מוטה של גודל המקטע ואין לרצף ספריות כאלה. באמצעות מודל מרקוב הנסתר ופילוח בינארי מעגלי, הגנום של כל תא נותח למקטעים בעלי מספר עותק משוער. טבלה זו מציגה את התוצאות החופפות מתא בודד וחושפת רווח בכרומוזום 10 מ-67 ל-130 מגה-בסיס, ורווח בכרומוזום 19 מ-0 ל-20 מגה-בסיס.

הבידוד והגברת הגנום השלם של תאים בודדים יכולים וצריכים להתבצע ביום אחד. לאחר מכן ניתן לבצע את הכנת ספריות הריצוף, ריצוף גנום שלם וניתוח נתונים, בלוח זמנים גמיש. כאשר בידוד תאים והגברת גנום שלם מבוצעים כראוי, וניתוח הנתונים מבוצע בקפדנות כמתואר, ניתן לזהות שינויים במספר העותקים העולים על חמישה מגה-בסיסים ברגישות וספציפיות גבוהות.

בעוד שהפרוטוקול שלנו מתאר באופן ספציפי את השימוש בריצוף תא בודד לזיהוי שינויים במספר עותקים, ניתן ליישם היבטים של פרוטוקול זה, כגון בידוד תא בודד והכנת ספרייה, כדי לזהות שינויים גנומיים אחרים.