קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את ריכוז הנגיף באמצעות כימות של וריון זיהומי על ידי ספירת פלאקים בדידים בתרבית תאים. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של תאים ליצירת חד-שכבת קונפלואנט לזיהום. השלב השני הוא ביצוע דילול סדרתי של הדגימה הנגיפית הלא ידועה שיש לכמת.

לאחר מכן, החד-שכבות המשולבות נדבקות באמצעות דילול סדרתי של המלאי הנגיפי, ואחריו יישום של שכבת על משתקת. השלב האחרון הוא לתקן ולהכתים את הפלאק לאחר זמן הדגירה המתאים לנגיף המדובר על מנת לספור את הפלאקים הדיסקרטיים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במבחני פלאק ולשנות אותם במספר דרכים שונות על מנת לקבוע את הטיטר הנגיפי של דגימה ויראלית לא ידועה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שכבת העל המוצקה למחצה, הוא שיישום והסרה פשוטים בהרבה הן בתפוקה גבוהה והן ביישומים מסורתיים. בנוסף, אין צורך בחימום של הריאגנטים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחקר של נגיפים ליטיים רבים ושונים כשימוש בשכבת נוזל.

בפורמט של 96 בארות מאפשר סינון מהיר של תרכובות טיפוליות חדשות, מה שיכול להפחית מאוד את השעות הארוכות המושקעות במעבדה בביצוע בדיקות פלאק מסורתיות ביום שלפני לוחית הבדיקה, התאים המתאימים לנגיף המדובר על מנת להשיג שטף של 90 עד 100% ביום ההדבקה. ניתן להכין את פתרונות המלאי גם יום לפני הבדיקה, להכין תחילה תמיסת קיבוע של 10% פורמלדהיד במים מזוקקים על ידי ערבוב של 5.56 מיליליטר של פורמלדהיד מלאי 36% עם 14.44 מיליליטר מים מזוקקים. לאחר מכן הכינו את כתם הסגול הקריסטלי המורכב מ -1% סגול קריסטל ב -20% אתנול מדולל במים מזוקקים.

לאחר מכן, תוך כדי עבודה בתנאים סטריליים, הכינו את שני אמצעי הפלאק המתאימים לסוג התאים בהם נעשה שימוש. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.2 מיקרון אם אחד מהריאגנטים אינו סטרילי. להכנת שכבת נוזל לשימוש בבדיקת הפלאק ב-2.4 גרם תא אבי לבקבוק המכיל 97.6 מיליליטר מים מזוקקים המתערבבים במהירות עם מוט ערבוב.

מערבבים את התמיסה בטמפרטורת החדר עד שהיא הופכת לצמיגה מדי עבור מוט הערבוב. בשלב זה, העבירו את הבקבוק לשייקר בקבוק ונסערו בכבדות במשך 30 דקות כדי להבטיח הומוגניזציה אחידה. לבסוף חיטוי התמיסה ב-121 מעלות צלזיוס ב-14 PSI למשך 30 דקות.

וכאשר התוכנית הסתיימה, אחסן אטום בטמפרטורת החדר לכיסוי ארוס. הכן תמיסת מלאי אגרו 0.6% במים מזוקקים. מערבבים עם מוט ערבוב וחיטוי כדי להביא לתמיסה או כיסוי קרבוקסי מתיל צלולוז.

הכינו תמיסת מתיל צלולוז 2% קרבוקסי במים מזוקקים וערבבו מאשר חיטוי כמו לפני היום שלאחר הציפוי. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את השטף והכדאיות של התאים לפני תחילת הבדיקה. ודא שהתאים מציגים מורפולוגיה תאית סטנדרטית וכ-90% שטף קו.

בצע דילול סדרתי פי עשרה של הדגימות הזיהומיות במצע גידול תאי, תוך שינוי מספר הדילול הנדרש על סמך הטיטר הצפוי של הנגיף המדובר. כמו כן, הכינו דגימת בקרה לא נגועה כדי להבטיח באופן עצמאי את הכדאיות התאית ולסייע בזיהוי הפלאק. פיפטה את הבקרה הלא נגועה ודילול סדרתי לבארות הצלחת, תוך הקפדה על שיבוש החד-שכבה.

השתמש בנפח מספיק של חיסון כדי לכסות את התאים תוך שמירה על הנפח נמוך ככל האפשר כדי למקסם את המגע הנגיפי עם החד-שכבה. הכניסו את הצלחות לאינקובטור תרבית הרקמה והדביקו את התאים למשך 45 דקות עד שעה כל 20 דקות. נדנד בעדינות את הצלחות כדי להבטיח כיסוי אחיד וכדי למנוע התייבשות של השכבה החד-שכבתית התאית במהלך הזיהום.

הכן את פתרון העבודה של הכיסוי לשכבות נוזליות. ערבב מדיית פלאק מחוממת ו-1.2 עד 2.4% טמפרטורת החדר מלאי תא avy ביחס של אחד לאחד כדי לקבל פתרון עבודה של 0.6 עד 1.2% מדיום כיסוי תא avy או שכבות AROS או CMC מדיית פלאק מחוממת מעורבת, ופתרון מלאי של 0.6% AROS מחומם או 2% CMC ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן מניחים באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס, 30 דקות לאיזון טמפרטורה.

ודא שהתמיסה חמה אך לא חמה למגע כדי למנוע מוות תאים והפחתת טיטרים ויראליים. לאחר ההדבקה, יש למרוח את השכבות על החד-שכבות הנגועות לאחר הוספת צלחות הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך יומיים עד 14 ימים, תלוי בנגיף המנותח כדי לתקן תאים עם כיסוי נוזלי, לשפוך או לשאוף את שכבת התא האלקטרוני, ואז לשפוך תמיסת פורמלדהיד 10% לבארות ולתקן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות למשך הלילה או ל-aros או CMC ישירות. הוסף את תמיסת הפורמלדהיד לכיסוי למשך שעה עד לילה בטמפרטורת החדר לאחר הקיבוע, השליך את הפורמלדהיד ולאחר מכן הסר ידנית את התקעים המוצקים למחצה שבהם הארוס עם המרית.

שטפו את לוחות התא במים כדי להסיר שאריות של קיבוע שכבת העל לפני הצביעה. כדי להכתים, מכסים את התאים בכמות מינימלית של תמיסת סגול קריסטל למשך כרבע שעה. נדנד את הצלחות במידת הצורך כדי להבטיח כיסוי אחיד.

יש לשטוף בעדינות את כתם הסגול הקריסטלי במים לאחר קיבוע, מוכתם ומיובש לאחסן פלקס ללא הגבלת זמן לניתוח עתידי. ספרו את הלוחות בכל באר בניכוי בארות עם פחות מחמישה או יותר מ-100 לוחות. קח את הממוצע עבור כל שכפול טכני של אותו דילול.

שימו לב לגודל הפלאק ולמורפולוגיה. קבע את הטיטר הנגיפי של דגימת המלאי על ידי לקיחת המספר הממוצע של פלאק לדילול והיפוך גורם הדילול הכולל. תמונה זו מציגה השוואות שכבת רובד של נגיף קדחת עמק השבר תוך שימוש ב-12 צלחות באר לשכות צופו פי 2.5 10 מהתאים החמישיים ב-12 צלחות באר ונדבקו ב-200 מיקרוליטר באמצעות אותה דגימה התחלתית מדוללת סדרתית של MP 12.

לאחר ההדבקה, שכבות-על של 1.5 מיליליטר של 0.3%aros 0.6% AVY, או 1%CMC הוחלו כדי להשוות ישירות את השכבות. היסטוגרמה זו מציגה את התוצאות של ספירת הפלאק והטיטרינג עבור כל שלושת השכבות. הנה. השוואות שכבת-על של רובד ViiV המשתמשות ב-12 לוחות בארות הראו כי הלשכות צופו כמו קודם ונדבקו בנפח של 200 מיקרוליטר באמצעות אותה דגימה התחלתית מדוללת סדרתית של זן החיסון ViiV TC 83 לאחר ההדבקה, שכבות-על של 1.5 מיליליטר של 0.3%aros, 0.6%avy cell או 1%CMC הוחלו כמו קודם.

שוב, ההיסטוגרמה מציגה את התוצאות של ספירת הפלאק והטיטרינג עבור כל שלושת השכבות. תמונה זו מציגה דוגמה לשכבות-על של פלאק בתפוקה גבוהה. צלחת של 96 בארות של VIRs המצופה בשלוש פעמים 10 מהתאים הרביעיים לבאר נדבקה ב-50 מיקרוליטר של חיסון באמצעות אותה דגימה התחלתית מדוללת סדרתית של נגיף קדחת עמק השבר MP 12 למשך שעה אחת בשכפול מרובע עבור השכבות 0.6 ו-1.2%.

היסטוגרמה זו מציגה את הטיטרים שנקבעו מכל שכבת-על. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל וירוס שונה וייתכן שיהיה צורך באופטימיזציות כולל שימוש בסוגי תאים שונים, זמני דגירה ו/או אמצעי גידול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת פלאק בסיסית תוך שימוש בשכבות נוזליות וחצי מוצקות כאחד.