טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

[קריין] פרוטוקול זה משלב טכניקה אספטית בשיטות ציפוי המשמשות לבידוד, ריבוי או ספירה של מיקרואורגניזמים כמו חיידקים ופאג'ים. ההליכים כוללים ציפוי פסים של תרביות חיידקים לבידוד מושבות בודדות. יוצקים ציפוי לקביעת ריכוז החיידקים. ולפזר ציפוי כדי למנות מושבות חיידקים ברות-קיימא. שכבות אגר רכות משמשות לבידוד פאג' וספירת פלאק בעוד ציפוי העתק מעביר תאים מלוח אחד למשנהו בתבנית מרחבית זהה. בסופו של דבר, היישומים המעשיים של טכניקות אלה לתרבית מיקרואורגניזמים נעים בין זיהוי חיידקים בסביבות להתקדמות טכנולוגית בגנטיקה מולקולרית ובדיקות ביולוגיות בתפוקה גבוהה.

- בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטות ציפוי אלו עשויים להיאבק מכיוון שהמניפולציות דורשות תנועות זהירות ומתואמות תוך הימנעות ממגע עם משטחים לא סטריליים. לימוד נהלים שגרתיים אלה דורש הכשרה ותרגול. מי שידגים את הנהלים יהיה מתאם המעבדה שלי, ד"ר קריס רדי.

- [קריין] התחל לעבוד עם מיקרואורגניזמים על ידי הכרת כללי המעבדה ואמצעי הבטיחות, כולל סיווג מפגעים ביולוגיים, טיהור וסילוק פסולת. ודא שכל המכשירים, הפתרונות והמדיה להליכי ציפוי הם סטריליים. צור גם סביבת עבודה ברורה. נקה אותו עם חומר חיטוי. הגדר מבער בונסן עם צינור המחובר לקו גז, סדר את האספקה הדרושה עם חומרים המסומנים כראוי. המשך לשטוף ידיים ביסודיות עם סבון חיטוי ומים חמים. ראשית, הרטיבו ידיים במים חמים וזורמים ואז מרחו ופזרו היטב סבון. שפשפו את הידיים במרץ ויוצרים חיכוך על כל המשטחים כולל אגודלים, גב האצבעות, גב הידיים ומתחת לציפורניים. לאחר מכן יש לשטוף היטב כדי להסיר שאריות סבון ולייבש באמצעות מגבות נייר המחולקות ממחזיק. לבסוף, בעזרת מגבת נייר טרייה, סגרו את הברז. נוהל צלחת הפסים נועד לבודד תרביות טהורות של חיידקים, או מושבות, מאוכלוסיות מעורבות על ידי הפרדה מכנית פשוטה. מוציאים צלחת אגר מקופסה קרה של ארבע מעלות צלזיוס ומחממים מראש לטמפרטורת החדר. בחר כלי ממערך המכשירים לפסים של הצלחת. וודאו שהצלחת יבשה ללא עיבוי על המכסה. סמן את החלק התחתון של צלחת אגר סביב הקצה. כאשר מיומן, השתמש בצלחת אחת למספר דגימות. לאחר מכן הדליקו מבער בונסן כדי להדליק את לולאת המתכת. התחל שלושה עד ארבעה סנטימטרים מלולאת המתכת עם החוט בקצה החרוט הכחול, החלק החם ביותר של להבת מבער הבונסן . כאשר המתכת הופכת לאדום לוהטת, הזז את החוט כך שהלהבה תתקרב ללולאה. כדי לקרר את הלולאה, גע בקצה מדיום האגר ויוצר צליל רוחש. המשך לאסוף את החיסון על הלולאה. הרם את החצי התחתון של הצלחת. הזז את הלולאה קדימה ואחורה מהשפה למרכז ברבע הראשון של הצלחת. הנח את הצלחת ההפוכה בחזרה על המכסה. הדליקו מחדש את לולאת המתכת. הופכים את צלחת הפטרי 90 מעלות. גע בלולאה לקראת סוף הרצף האחרון באמצעות התבנית קדימה ואחורה, חצה את המחצית האחרונה של הפסים ברבע הראשון, ולאחר מכן עבור לרבע השני הריק. לאחר מילוי הרביע השני, הנח את הצלחת. חזור על הליך הפסים עבור הרביע השלישי והרביעי תוך הימנעות ממגע עם הרביע הראשון. לפסים עם קיסם סטרילי ושטוח, החזק את הקצה הצר בעדינות בין האגודל לאצבע הקמיצה בזווית של 10 עד 20 מעלות למדיום, השתמש בקצה הרחב כדי לפספס את הרבעים. הפוך את הצלחת בחזרה על המכסה בין הרבעים והשליך את הקיסם כראוי. המשך לדגור את הצלחות המפוספסות הפוכות. נוהל צלחת המזיגה מונה את המספר הכולל של יחידות יוצרות מושבה על פני השטח ובתוך האגר של צלחת בודדת. הגדר טיימר למשך 10 דקות, ואז העביר 18 מיליליטר של מדיום אגר מומס מאמבט מים של 55 מעלות צלזיוס לגוש חום של 48 מעלות צלזיוס ושיווי משקל למשך 10 דקות. סמן את החלק התחתון של צלחת פטרי סטרילית. במידת הצורך, כלול גורם דילול. כעת מחלקים מיליליטר אחד של דגימה לאמצע צלחת הפטרי. סגור את המכסה. הסר את המכסה מצינור האגר המומס והעביר את שפת הצינור הפתוח דרך להבה. שופכים את האגר בזהירות לצלחת הפטרי. סגור את המכסה ואז ערבב את הדגימה עם האגר על ידי סיבוב עדין של הצלחת. המתן 30 דקות כדי לאפשר לאגר להתמצק. לאחר שהאגר התמצק, הפוך והניח את הצלחת בחדר חם. ציפוי התפשטות נועד להפריד מיקרואורגניזמים הכלולים בנפח דגימה קטן, ולחלק את המושבות המתקבלות באופן שווה על פני השטח של האגר. איזון צלחת לטמפרטורת החדר ותווית כראוי. מקם את הצלחת על הפטיפון. פיפטה 0.1 מיליליטר דגימה על מרכז האגר וסגור את המכסה. הוצא את הקצה למיכל פסולת. טובלים את מוט המתכת בכוס של 70% אתנול המכסה את כל החלק התחתון של המפזר ואת הסנטימטר הראשון של הגבעול ולאחר מכן מסננים. הצית עודף אתנול על ידי מעבר דרך הלהבה של מבער בונסן לאחר מכן, פתח את מכסה צלחת האגר וקרר את המפזר על ידי נגיעה בו באגר לאורך הקצה ליד השפה. סובב את הפטיפון לאט. החזיקו את המפזר בעדינות על פני האגר, פזרו בהדרגה את הדגימה באופן שווה על כל הצלחת בתנועה קדימה ואחורה בזמן שהפטיפון מסתובב. סגור את המכסה ואפשר לדגימה להיספג היטב למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת ההפוכה. ראשית, סמן את צלחת האגר כראוי. פתח את המכסה של צלחת האגר. לאחר מכן פתח את מיכל חרוזי הזכוכית המעוקרים מראש והדליק את השפה. מחלקים בזהירות 10 עד 12 חרוזי זכוכית סטריליים על צלחת אגר. סגור את מכסה הצלחת והדליק את שפת מיכל חרוזי הזכוכית לפני החלפת המכסה. כעת, פיפטה את הדגימה על מרכז האגר. בתנועה אופקית, נענע בעדינות את החרוזים על פני האגר שבע פעמים. אם נעשה כראוי, ההליך נשמע כמו טלטול מרקאס. סובב את הצלחת 60 מעלות ונער אופקית שוב שבע פעמים. שוב, סובב את הצלחת 60 מעלות וחזור על הניעור. ודא שהדגימה נספגת. לאחר מכן, שפכו את החרוזים המזוהמים לכוס איסוף מסומנת המכילה 10% אקונומיקה כלור. דגרו את הצלחת ההפוכה. בדיקת הפלאק משמשת בדרך כלל לאיתור וכימות של פאג'ים חיידקים. תרבית חיידקי האינדיקטור לשלב אקספוננציאלי ואחסון על קרח. לאחר מכן, סמן שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים פאג' ובקרה והוסף 50 מיקרוליטר של דגימת פאג' או מאגר בהתאמה לכל אחד מהם. לאחר מכן, סובבו את תרבית החיידקים בבקבוקון, ואז העבירו כמות חיידקים לצינור סטרילי ומערבלו בעדינות את חיידקי המחוון, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר חיידקים לכל צינור ספיגה. מערבבים על ידי לחיצה עדינה על הצינורות. לעולם אל תערבב או תשתמש נמרצות בדגימות פאג'ים. דגרו את תערובת חיידקי הפאג'ים בטמפרטורה המתאימה לזן המחוון למשך 20 דקות. בינתיים, העבירו שני צינורות אגר רכים מאמבט מים של 55 מעלות צלזיוס לבלוק חימום של 48 מעלות צלזיוס. שיווי משקל למשך 10 דקות. סמן שתי צלחות אגר קשות ללא עיבוי מאוזנות מראש לטמפרטורת החדר. הסר צינור אגר רך מגוש החום ובדוק שהתכולה אינה חמה מדי למגע. לאחר מכן, העבירו את התערובת באופן אספטי מצינור ספיגת הפאג'ים לצינור האגר הרך. לאחר מכן, סובב במהירות בין כפות הידיים כדי לערבב את התוכן. כשהצינור ביד אחת, פתח את המכסה של צלחת האגר הקשה ביד השנייה. יוצקים מיד את כל תכולת הצינור על פני צלחת אגר קשה. נדנד את הצלחת במהירות ובעדינות. סוגרים את המכסה ומניחים את הצלחת על מפלס למשך 30 דקות עד שהאגר הרך מתמצק. לאחר מכן, חזור על ההליך עבור צינור ספיגת הבקרה על ידי העברת תערובת הבקרה לתוך צינור אגר רך. מערבבים אותו, שופכים את התכולה על צלחת אגר קשה, מנדנדים אותה ומאפשרים לאגר הרך להתמצק למשך 30 דקות. בדוק את הלוחות להיווצרות רובד. כדי לבודד רובד מתערובת הטרוגנית, יש לנקב בזהירות את המרכז בעזרת קיסם סטרילי ולהעביר את החיסון לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי המכיל 100 מיקרוליטר של מאגר פאג'ים. המשך לטהר את הליזאט הזה על ידי חזרה על בדיקת הפלאק שלוש עד שש פעמים עם דילולים סדרתיים לפי הצורך. ציפוי העתק מנצל פנוטיפ הניתן לבחירה על ידי מתן אפשרות השוואה של צמיחת תאים בצלחת ראשונית ללוחות משניים. סמן רשת בתחתית הצלחת, סמן את הצלחת הראשית ומספר את הריבועים המתקבלים. כעת, השתמש בטכניקה אספטית כדי להסיר קיסם מעוקר מראש מהכוס, לטפוח את מרכז כל ריבוע בדגימת תא ולהשליך את הקיסם למכל פסולת מתאים. דגירה של הצלחת הראשונית. עורמים את הצלחת הראשית ואת כל הלוחות המשניים. הניחו סימן כיוון בצד המחצית התחתונה של הצלחות. כעת הסר בד קטיפה סטרילי מהעטיפה שלו והניח אותו על הגוש הגלילי. לאחר מכן, הנח את המחזיק מיישר את הסימנים על המחזיק עם אלה שעל הבלוק. שימו לב לסימן הכיוון על הבלוק והמחזיק. לאחר מכן, הסר את המכסה מהצלחת הראשית. יישר את סימני הכיוון על הצלחת והבלוק. הורד את הצלחת כך שמשטח האגר ייגע בבד הקטיפה. בעזרת קצות האצבעות, לחץ קלות אך באופן שווה כלפי מטה על גב הצלחת הראשית ולאחר מכן הרם אותה בזהירות מהבלוק. אשר כי ניתן לראות את חותם התאים על הקטיפה. החזר את המכסה לצלחת. כעת, חזור ברצף על הפרוטוקול על בד הקטיפה עם כל אחת מהלוחות המשניים. השתמש בטביעת הקטיפה של תאים מהצלחת הראשונית כדי לחסן עד שמונה צלחות משניות המסודרות מהמצע הפחות טוב לטוב ביותר. לבסוף, כבקרה חיובית, עבור הצלחת האחרונה בסדרה, השתמש במדיום אגר שבו כל הזנים שנבדקו אמורים לגדול. הדביקו את הלוחות ההפוכים יחד ודגרו אותם. בדוק את הלוחות המשניים לצמיחה. כבה את מבער הבונסן ואז הניח את כל האספקה. הנח בלאי מעבדה מזוהם, כלי זכוכית ופסולת מסוכנת לתוך מיכל הסילוק המתאים. נקה את אזור העבודה עם חומר חיטוי. לבסוף, שטפו ידיים היטב עם סבון חיטוי ומים חמים. Serratia Marcescens הוא פרוטאובקטריום בצורת מוט בצורת גרם שלילי המייצר פיגמנט אדמדם הנקרא פרודיגיוזין. הוא נמצא בדרך כלל גדל בחדרי אמבטיה ועל וילונות מקלחת. בדוגמה זו, טכניקת לוח הפסים יוצרת מושבות בודדות ברביע הרביעי. ניתוח זה של חיידקים הנמצאים בדגימת מים שנאספה ממזרקת שתייה ציבורית משתמש בטכניקת צלחת יציקה. שימו לב להבדל במראה המושבות. מושבות פני השטח גדולות ומעגליות בצורתן בעוד שחלק מהמושבות על פני השטח קטנות מאוד וצורתן לא סדירה. טכניקת ה-Spread Plate היא מרכיב חשוב בניסויי העשרה, בחירה וסינון. לדוגמה, שיטת הקופקבנה היא כלי מבדיל במסך הכחול-לבן הקלאסי בטכנולוגיית DNA רקומביננטי. פאג' T4 הוא פאג' DNA דו-גדילי אלים המדביק את המארח שלו כ-Escherichia coli כדי ליז ולשחרר פאג'ים צאצאים. בדיקת פלאק זו על אגר EHA מראה פאג'ים באזורי פינוי בקוטר של כמילימטר אחד. בהיעדר חלקיקי פאג'ים מזהמים, צמיחת חיידקים גורמת להשעיה עכורה של תאים באגר הרך שבו מושבות נפרדות אינן נראות לעין. בטכניקת כיסוי האגר הרך, מורפולוגיות הפלאק משתנות. לדוגמה, כאן אותו זן מארח מיקובקטריום מייצר מורפולוגיות פלאק מובחנות בנוכחות משמידי פאג'ים מיקרובקטריאליים לעומת פאג'ים מיקובקטריאליים MSSS. כוחו של ציפוי העתק הוא בהקרנה בו זמנית של מספר רב של מיקרואורגניזמים. במקרה זה, ארבעה זני פסאודומונס נבדקו בשכפול לגידול בשלושה מקורות פחמן שונים. אצטמיד, לקטוז וגליצין. כאן, הצלחת העיקרית היא מדיום YTA שלם מחוסן בארבעת הזנים כפי שמצוין. הזנים מראים דפוסי גדילה משתנים על לוחות העתק של מדיום MSA מינימלי בתוספת מקור פחמן יחיד אצטמיד, לקטוז או גליצין. כל הזנים גדלים על לוחית הבקרה החיובית האחרונה המאשרת שתאים הועברו לכל הלוחות המשניים בסדרה זו. טבלאות עם תוצאות לוחות העתק אלה מפרטות סינון בו-זמני של זני הבר השונים לדרישות גידול אופייניות.

- לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הליכי ציפוי מבלי לזהם מדיה או תרבויות וגם להשתמש בשיטת הציפוי המתאימה לכל משימת ניסוי נתונה במעבדה. כדי להתמקצע בטכניקות אלה נדרש תרגול. עם זאת, עם הכשרה מתאימה, נהלי הציפוי המתוארים בסרטון זה יהפכו לטבע שני בעבודה על ספסל המעבדה.