המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

שלום, שמי הלן קוסטר ואני עובדת בקבוצת המחקר הקרדיווסקולרית של ד"ר הרולד ופרופסור באוניברסיטת אוטו ויקה במקבוק. אנו מעוניינים באפיון בידוד של מונוציטים ימיים על מנת להשתמש בהם ככלי רכב בגידול כלי שיט נלווים. השלבים העיקריים הבאים נחוצים לגידול מונוציטים שמקורם במח עצם, הרדמה ראשונה של עכבר ופריקת צוואר הרחם, מיצוי שני ושטיפה של עצם הירך.

סינון שלישי של מח העצם. רביעית לשלבי כביסה עם חמישית בינונית, טיפוח התאים על לוחות הצמדה נמוכים במיוחד. ציטומטריית זרימה שישית.

על מנת לחלץ מונוציטים ממח העצם, העכבר יורדם באמצעות ISO פלואור ויורדם על ידי פריקת צוואר הרחם. העכבר יתוקן ושתי הגפיים התחתונות מופרדות באמצעות אזמל סטרואידים. גם עצם הירך וגם עצם השוק נקטפו ונשטפו עם אתנול איתן 96% למשך 90 שניות לפחות.

לאחר מכן, כל השלבים חייבים להיות סטריליים לחלוטין כדי למנוע זיהום. שרירים או חוטים יוסרו מהעצם. עצם הירך והשוק נשטפים ב-PBS חם מספר פעמים.

לצורך קצירת מח העצם, הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של כל עצם נחתכים במספריים עדינים. על מנת לשטוף את העצם, אנו זקוקים למחט סטרואידים אחת 28 גרם, אחת, מזרק מיליליטר אחד, ובין 10 ל -15 מיליליטר של מדיום לעצם. לאחר מכן מח העצם מסונן דרך 70 מיקרומטר S תוך החזקת העצם במלקחיים עדינים.

שוטפים את העצמות אחת אחת עד שהן הופכות לאשליה. על מנת למזער את הלחץ על התאים, הפעל בזהירות לחץ על חותמת המזרק. שוטפים את הסיאט עם PBS.

לאחר מכן, התאים עוברים צנטריפוגה בטמפרטורה של 250 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. והאם ראוס מושעה עם מדיום? לאחר שלב זה, חזור על השלב שוב.

עבור מונוציטים שמקורם במח עצם ממח עצם מקומי, אנו משתמשים ב-M 199 עם 1% פניצילין וסטרפטומיצין ו-10% סרום שיעול עוברי. בנוסף, אנו מוסיפים 20 ננוגרם למיליליטר INE MCSF ביום הראשון. שמונה ננוגרם למיליליטר אינטרפר גמא מתווספים ביום האחרון של התרבית למדיום.

אם רוצים להגביר את הוויסות של MHC 2, התאים נזרעים לתוך לוחות חיבור נמוכים במיוחד עם בארות עבות כדי למנוע הידבקות קבועה לתחתית. אנו משתמשים בריכוז חד פעמי של 10 עד שישה תאים למיליליטר עם עד שישה מיליליטר לבאר. תקופת הטיפוח היא חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות ו-5% פחמן דו חמצני.

התאים נבדקים מדי יום לאחר חמישה ימים בין 60 ל -80% מהתאים הם מונוציטים. שמי מרטין בכנר ואני סטודנט לרפואה כאן באוניברסיטת Auto Fungi במחלקה לקרדיולוגיה, אנולוגיה וכרונולוגיה. וכאשר אתה עושה את ההזרקה התוך ורידית, חשוב להתאמן הרבה לפני שאתה עושה את זה כי אחרת לא תוכל למרוח את המונוציטים בצורה נאותה.

ניסויים הראו כי מונוציטים יעילים ביותר בשיפור אגנזה של אמנות כאשר הם מיושמים באופן שיטתי. דרך נפוצה ליישום תרופות מערכתיות היא זריקת זנב WA. במקרה שלנו, אנו מזריקים 2.5 מיליון מונוציטים, המורחפים מחדש ונתרן כלורי.

ישנם ארבעה כלי דם בזנב עורקי העכבר בצד הגחון והגב, ושניים דועכים בצד הצדדי. אז עבור הזרקת WA, עלינו לסובב את הזנב בכ-90 מעלות. להליך קל יותר, יש לחמם את העכבר באמצעות כרית חימום למשך כ-10 דקות.

יש לצפות בבעלי החיים על ידי התחממות. זה חשוב לזיהוי סימני התחממות יתר. יתר על כן, אנו זקוקים לחומר זיהום זה ולמחט של 30 גנים המונחת על מזרק אינסולין של מיליליטר אחד.

תקן את החיה בזהירות במסננת, מה שמקל בהרבה על ההזרקה לזנב. ודא שהעכבר מקבל מספיק מקום לנשימה לפני טעינת התמיסה למזרק. מערבולת, תמיסת המונוציטים כדי לוודא שניתן להזריק את כל המונוציטים.

מחטא את מקום ההזרקה כדי למנוע זיהום, קח את הזנב בין החבטה לאצבע המורה. בנקודה הדיסטלית ביותר, המחט מוחדרת בזווית שטוחה. אם הוא מונח בווריד, קל מאוד להזריק את תמיסת המונוציטים.

אם יש שלפוחית, זה סימן לזריקה שגויה. כדאי לעצור מיד ולנסות עוד. פרוקסימלי, נסה תמיד להזריק לאט ולא יותר מחמישה מיקרוליטר לגרם.

אם ההזרקה הצליחה, יש לעצור את הדימום במקום ההזרקה על ידי הפעלת לחץ עדין למשך כדקה. בתום ההליך, פתח את המחזיר והנח את העכבר בכלוב שלו כדי לאפיין מונוציטים. אנו משתמשים באפקטים עם שילוב של אנטיגנים, כלומר CD 11 B, F ארבע 80, CD 115 ו-GL אחד.

הביטוי של אנטיגנים אלה נמצא בקורלציה עם שלב התפתחות לניתוח המונוציטים. עשינו את העובדות ביום 0, 3, 5 ו-7, טוהר המונוציטים עולה עד 90% ביום החמישי. כדי להשיג את הטוהר הזה, חשוב לדלל מקרופאגים חזקים של טרין.

תאים שאינם טרין מתרוקנים על ידי שימוש במאגר שטיפה ללא EDTA. כדי לרוקן את תאי הטרין, אנו משתמשים ב-EDTA המכיל שטיפה, חיץ וליטוף עדין. תרשים זה מציג את סוגי התאים העיקריים עבור תרבית הקצה האחד שלהם.

סוגי התאים השונים המוצגים הם לימפוציטים אחד, שני מונוציטים, שלושה גרנולוציטים, המגדילים את טוהר המונוציטים לאחר היום החמישי. ותרבות. שימו לב, ההרכב התאי המשתנה במהלך אוכלוסיית תאי הגידול כולל מונוציטים אחד ושני מקרופאגים.

איור שני, ציר הזמן של ביטוי CD 115 במהלך התמיינות. שימו לב כי למעלה מ-95% מכלל התאים חיוביים ל-CD 115 לאחר חמישה ימים של התמיינות, מה שמצביע על כך שהרוב המכריע של התאים הם מונוציטים או מקרופאגים. הסיווג יכול להתבסס על גודל התא והגרעיניות, אך סמנים סלולריים ספציפיים אמינים יותר.

איור שלוש, ביטוי הולך וגובר של בשלות מקרופאגים מונוציטים. סמן F ארבע 80, יום חמישי, שימו לב להופעת אוכלוסייה עם ביטוי ביניים F ארבע 80, התואם את הפנוטיפ של מונוציטים. ביום השביעי, שימו לב לשינוי הימני של ביטוי F four 80 התואם את התבגרות המקרופאגים.

בידוד מונוציטים חשוב במחקרי מבחנה ו-in vivo רבים. תאים אלה מהווים מטרה מעניינת, למשל, בקשר למחלות כמו מחלת עורקים היקפית או מחלת לב כלילית, הקשורות לאיסכמיה. מח עצם מ-FEMA ושוק של עכברי ביופסיה נקצר על ידי שטיפת עצמות עם תרחיף תאים בינוני חם, מתווסף ל-MCSF ומתורבת על משטחי התקשרות נמוכים במיוחד כדי למנוע הידבקות, התמיינות מופעלת של תכונות מונוציטים והתמיינות של מונוציטים נבדקת בזמנים שונים ועובדות עם סמן כמו CD 11 b, CD 115 ו-FO 80 משמשות לפנוטיפ התאים.

אם רוצים מתן תרופות מערכתיות, הזרקה תוך ורידית היא דרך קלה ויעילה לעשות זאת. תיארנו את השיטה לבידוד כמויות גדולות של מונוציטים MI ממח העצם בצורה פשוטה וחסכונית. בשיטה חדשה זו, אנו מסוגלים לייצר כ-11 מיליון מונוציטים לכל עכבר.